Name: imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy
Uploaded: 2021-04-23T14:30:00
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Los autores quieren agradecer a Blanka Duvnjak y Nikola Kuhr por su excelente asistencia técnica.

1. División y siembra de células
<ol><li>Caliente el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco estéril, incluyendo un 10% de suero de pantorrilla fetal (FCS), solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) y trippsina estéril a 37 °C. Active el banco limpio.</li>
	<li>Prepare una placa de 6 pozos añadiendo un resbalón estéril de cubierta de vidrio (10 mm) a cada pozo utilizando fórceps estériles.</li>
	<li>Ponga un plato de cultivo celular de 10 cm con células Cos7 bajo el banco limpio. Bajo el b...

<ol>
	<li>Matsushita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts:+a+collaborative+meta-analysis.">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li><li>Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+up:+regulation+of+podocyte+structure+and+function+by+components+of+the+actin+cytoskeleton.">Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).</li><li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-localization+of+nephrin,+podocin,+and+the+actin+cytoskeleton+-+Evidence+for+a+role+in+podocyte+foot+process+formation.">Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation.</a> American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein+-+nephrin+-+is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Huber, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocin-mediated+recruitment+of+nephrin+into+lipid+rafts+is+required+for+efficient+nephrin+signaling.">Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPHS2,+encoding+the+glomerular+protein+podocin,+is+mutated+in+autosomal+recessive+steroid-resistant+nephrotic+syndrome.">NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome.</a> Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis.">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li><li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Testa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+nanoscopy+in+fixed+and+living+cells+by+exciting+conventional+fluorophores+with+a+single+wavelength.">Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> Embo Reports. 19 (9), (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nanoscale+optical+imaging+of+mouse+and+human+kidney+via+expansion+microscopy.">nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Rinschen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+deep+mapping+of+the+cultured+podocyte+proteome+uncovers+shifts+in+proteostatic+mechanisms+during+differentiation.">Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+protocols+for+imaging+proteins+and+RNA+in+cells+and+tissues.">Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).</li><li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy.">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+(U-ExM).">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

El método presentado permite al investigador visualizar proteínas celulares, por ejemplo, podocina, nefrina y componentes citoesqueléticos, por ejemplo, F-actin. Dentro de este protocolo, las células cos7 transfectadas se utilizan como modelo para estudiar la interacción de proteínas de diafragma cortadas con F-actin. Desafortunadamente, las líneas celulares de podocitos inmortalizadas no expresan suficientes cantidades endógenas de proteínas de diafragma cortadas19.
<p class="jove_co...

Albuminuria es un parámetro sustituto del riesgo cardiovascular y resulta de la interrupción del filtro glomerular1. El filtro glomerular se compone del endotelio fenestrado, la membrana glomerular del sótano y el diafragma cortado formado por podocitos. Los procesos de pie primario y secundario de los podocitos se envuelven alrededor de la pared capilar del glomérulo2. La delicada estructura de los procesos de los pies se mantiene mediante haces corticales de actina que también sirven como anclajes para múltiples proteínas de diafragma de hendidura y otras proteínas adaptadoras2. La proteína de la columna vertebral del diafragma cortado se llama nefrina e interactúa de manera homofílica con moléculas de nefrina de podocitos opuestos. A través de diversas proteínas adaptadoras, la nefrina está vinculada al actin cytoskeleton2,3. Las mutaciones en el gen de codificación de nefrina NPHS1 conducen al síndrome nefrótico del tipofinlandés 4.
Una de las proteínas que interactúan con la nefrina es la podocina, una proteína similar a la horquilla de la familia de la estomatina3. Podocin recluta nefrina a balsas lipídicas y la vincula con el actin cytoskeleton5. La podocina está codificada por el gen NPHS2. Las mutaciones en NPHS2 conducen al síndrome nefrótico resistente a los esteroides6.
Para visualizar y co-localizar las proteínas adaptadoras de actina, se pueden utilizar técnicas de inmunofluorescencia. Desafortunadamente, la barrera de difracción de la luz limita la resolución de los microscopios de fluorescencia convencionales a 200-350 nm7. Las nuevas técnicas de microscopía, por ejemplo, el agotamiento estimulado de emisiones (STED)8,la microscopía de localización fotoactivada (PALM)9,la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM o dSTORM) o la microscopía de eliminación de estado de tierra seguida de retorno individual de moléculas (GSDIM)9,10,11,permiten una resolución de hasta aproximadamente 10 nm. Sin embargo, estas técnicas de súper resolución requieren microscopios altamente caros, personal bien capacitado y, por lo tanto, no están disponibles en muchos laboratorios.
La microscopía de expansión (ExM) es una técnica novedosa y sencilla que permite imágenes de súper resolución con microscopios convencionales y que potencialmente está disponible para una gran comunidad de investigación12. En la microscopía de expansión de retención de proteínas (proExM), la muestra de interés (células o tejidos) se fija y se tiñe con fluoróforos13. Las proteínas dentro de la muestra son entonces ancladas covalentemente por una molécula pequeña (6-((Accriloyl)amino)ácido hexanoico, éster de succinimidyl, AcX) en un hidrogel hinchable13. A través de la digestión enzimática con proteinasa K (ProK), las proteínas y fluoróforos mantienen su posición relativa dentro del gel después de la expansión13. Después de la hinchazón del gel, la muestra se expande hasta 4,5 veces (expansión volumétrica 90 veces) lo que conduce a una resolución lateral efectiva de aproximadamente 60-70 nm (300 nm/4,5). Las modificaciones de esta técnica pueden incluso permitir una expansión de 10 veces (expansión volumétrica de 1.000 veces), lo que representa una resolución de 20-30 nm en microscopios convencionales14,15,16.
Las estructuras glomerulares del ratón y los riñones humanos se han visualizado a través de ExM17. Dentro de este artículo, presentamos un protocolo proExM detallado para visualizar imágenes de súper resolución de F-actin y la podocina proteica actin-adaptador dentro de las células utilizando un microscopio de fluorescencia convencional.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide &#62;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A-20770</td>
			<td>store up to 4 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Engelbrecht</td>
			<td>K12432</td>
			<td>24x32mm #1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamont cutter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>201-0392</td>
			<td>for cutting the cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td>8M Stock can be kept at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marten hair paintbrush</td>
			<td>Leon Hardy</td>
			<td>3 (770)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Menzel&#34; Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Thermo Fischer&#160;</td>
			<td>15654786</td>
			<td>24x24mm #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N`-Methylenbisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objekttr&#228;ger UniMark</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>703010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td>check purity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>produced at the university&#39;s workshop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well glass bottom plates</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin-ExM 546&#160;</td>
			<td>chrometra</td>
			<td>non-available</td>
			<td>1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Podocin produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0372-200UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti guinea-pig CF633</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB4600129-50UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti rabbit 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti nephrin</td>
			<td>Origene</td>
			<td>BP5030</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiview</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXIO Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>non-available</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy

La interrupción del filtro glomerular compuesto por el endotelio glomerular, la membrana glomerular del sótano y los podocitos, resulta en albúmina. Los procesos del pie de podocito contienen haces de actina que se unen a proteínas adaptadoras citoesqueléticos como la podocina. Esas proteínas adaptadoras, como la podocina, unen la columna vertebral del diafragma de hendidura glomerular, como la nefrina, con el citoesqueleto actin. Estudiar la localización y la función de estas y otras proteínas podocíticas es esencial para la comprensión del papel del filtro glomerular en la salud y la enfermedad. El protocolo presentado permite al usuario visualizar actina, podocina y nefrina en células con imágenes de super resolución en un microscopio convencional. En primer lugar, las células se tiñen con una técnica convencional de inmunofluorescencia. Todas las proteínas dentro de la muestra se anclan covalentemente a un hidrogel hinchable. A través de la digestión con proteinasa K, las proteínas estructurales se cleaved permitiendo la hinchazón isotrópica del gel en el último paso. La diálisis de la muestra en agua da como resultado una expansión de 4-4,5 veces de la muestra y la muestra se puede imaginar a través de un microscopio de fluorescencia convencional, lo que representa una resolución potencial de 70 nm.

El concepto y el tiempo de este protocolo proExM se representan en la Figura 1. El día 5, las células transfectadas se fijan y se tiñen con anticuerpos fluorescentes dirigidos a la proteína de interés(Figura 1A,B). El día 6, el tratamiento con AcX conduce a la formación de grupos de aminas en todas las proteínas (incluidos los fluoróforos) (Figura 1A,B)<sup ...

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Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

El método presentado permite visualizar proteínas celulares etiquetadas fluorescentemente con microscopía de expansión que conduce a una resolución de 70 nm en un microscopio convencional.

Imagen de las proteínas podocíticas nefrina, actina y podocina con microscopía de expansión

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Este protocolo microscópico de expansión permite al investigador visualizar proteínas glomerulares con resolución a nanoescala en un microscopio convencional. La principal ventaja de la microscopía de expansión es que es accesible para una gran comunidad de investigación. Comience por hacer espaciadores para la cámara de gelación.La cubierta de vidrio número uno y número 1.5 se desliza en rayas de cinco milímetros, usando un cuchillo de diamantes. Coloque un tobogán de vidrio en una cámara de tinción y coloque las rayas deslizantes de la cubierta número 1.5 en el tobogán de vidrio, de modo que formen un cuadrado de 2,5 centímetros. Pipeta una gota de agua destilada doble en las esquinas del cuadrado para adherir las rayas deslizantes de la cubierta de vidrio entre sí y a la diapositiva de vidrio.Espere aproximadamente 20 minutos para que los resbalones de cobertura número 1.5 estén firmemente unidos. Pipeta una gota de agua en cada número 1.5 cubierta raya resbaladiza. Coloque cuatro rayas deslizantes de cubierta de vidrio número uno en los resbalones de cubierta número 1.5.Para la tapa de la cámara de gelificación, envuelva un vaso de cubierta con película de parafina, evitando cualquier pliegue o suciedad en la película. Para el tratamiento de anclaje, retire PBS de las células manchadas inmunes y agregue 250 microlitros de amortiguador de anclaje por pozo directamente en el resbalón de la cubierta de vidrio. Incubar la placa durante tres horas a temperatura ambiente.Mantenga el sustrato en la oscuridad con una caja. Después de la incubación, retire el amortiguador de anclaje y lave el resbalón de la cubierta una vez con 1,5 mililitros de PBS por pozo. Para manchar las fibras de actina, descongelar una solución de fhalloidina compatible con EXM e incubarla durante 45 minutos a temperatura ambiente.Mientras tanto, disolver el acrilato de sodio en agua destilada doble utilizando un dispositivo de agitación y preparar la solución monómero sobre hielo. Retire la faloidina de las células y lávela con 1,5 mililitros de PBS, dos veces, a temperatura ambiente. Deje 1,5 mililitros de PBS dentro del pozo después del último lavado.Utilice fórceps y una cánula para levantar el resbalón de vidrio de la cubierta de la placa de seis pozos y colóquelo en la cámara de gelación. Agregue APS a la solución de gelling y vórtice brevemente. Pipeta 200 microlitros de solución de gelling en la muestra y cerrar con precaución la cámara, evitando burbujas de aire dentro del gel.Agregue agua a la cámara de tinción e incubar la cámara de tinción durante al menos una hora a 37 grados Celsius para polimerizar el gel. Saca la cámara de manchas de la incubadora. Para abrir la tapa de la cámara de gelificación, introduzca una cuchilla de afeitar entre la tapa y el espaciador y retire la tapa con precaución.Retire los espaciadores con la cuchilla de afeitar y corte todo el gel adicional. Utilice un pincel para separar los bordes del gel. Coloque el tobogán con el gel y cubra el vidrio en un plato lleno de PBS.A continuación, retire el vaso de cubierta separado del gel agitando suavemente. Coloque la diapositiva debajo del gel para fijar el gel a la diapositiva. Con el gel en el tobogán, divida el gel en trozos pequeños usando la hoja de afeitar.Empuje suavemente una pieza de gel en un pozo de un pozo de seis placas de pozo con un fondo de vidrio y despliécelo con un pincel. Utilice el pincel para mantener el gel hidratado con una pequeña cantidad de PBS. Con un microscopio invertido, tome imágenes de visión general con baja apertura numérica para imágenes previas a la expansión.Diluir proteinasa K a cuatro unidades por mililitro en búfer de digestión para hacer la solución de digestión. Añadir 500 microlitros de la solución de digestión a cada pozo, y sumergir el gel dentro de la solución. Deje que digera durante la noche a temperatura ambiente con la tapa cerrada para mantener las muestras en la oscuridad.Retire la solución de digestión con una pipeta y deséchela. Agregue un mililitro de agua destilada doble e incubar el gel sumergido durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire el agua y agregue un mililitro de agua fresca destilada doble.Continúe intercambiando agua cada 10 minutos hasta que se alcance una meseta de expansión, lo que hace que el gel se vuelva ópticamente claro. Retire el agua del gel e inicie inmediatamente la microscopía. Con un microscopio invertido, utilice un objetivo de aire a baja ampliación para encontrar células en el estado de pre-expansión.Cambie a objetivos 40 X y 63 X para una mejor resolución. Excitar con la longitud de onda de interés y tomar la imagen a través de la cámara. Este protocolo EXM permite la expansión de hasta cuatro veces.Para determinar el factor de expansión es esencial para las celdas de imagen antes y después de la expansión. El anclaje y la homogeneización insuficientes pueden conducir a distorsiones y rupturas de las células. Aquí se muestran ejemplos representativos de células rotas.Este método se puede utilizar para investigar la colocación de proteínas adaptadoras de F-actina y actina, como la podocina y la nefrina. La podocina se representa en verde, actin en azul y nefrina en rojo. Las áreas blancas indican la colocación.La intensidad y la abundancia de la señal fluorescente son clave para un EXM exitoso. El anclaje eficiente de los colorantes fluorescentes a través de ACX es de vital importancia para este protocolo. En nuestras manos, acx solubilizado es bueno para hasta tres a cuatro meses.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Investigación

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Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

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Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imagen de vesículas extracelulares mediante microscopía de fuerza atómica

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitocondrias y endoplasmática retícula imagen por microscopía electrónica de luz y volumen correlativa

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Producción de Conjuntos de Motores de Dynein y Kinesin en Nanoestructuras de Origami de ADN para Observación de MoléculaS Simples

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caracterización de proteínas celulares con oxidación fotoquímica rápida en las células de proteínas

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Seccionamiento transversal de arroz maduro (Oryza sativa L.) Núcleos para imágenes de microscopía electrónica de barrido utilizando puntas de pipeta como soporte de inmovilización

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Análisis de la interacción de proteínas marcadas con fluorescentes con microvesículas de fosfolípidos artificiales utilizando citometría de flujo cuantitativa

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...