Name: imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy
Uploaded: 2021-04-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy at JoVE.com

Författarna vill tacka Blanka Duvnjak och Nikola Kuhr för deras utmärkta tekniska hjälp.

1. Delning och sådd av celler
<ol><li>Värm upp sterilt Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) inklusive 10% fetalt kalvserum (FCS), steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och steril trypsin till 37 °C. Aktivera den rena bänken.</li>
	<li>Förbered en 6-brunnsplatta genom att tillsätta en steril glaskåpa (10 mm) till varje brunn med sterila tångar.</li>
	<li>Lägg en 10 cm cellkulturrätt med Cos7-celler under den rena bänken. Aspirera cellernas medium under den rena bänken med hjälp av en vakuumanordning...

<ol>
	<li>Matsushita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts:+a+collaborative+meta-analysis.">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li><li>Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+up:+regulation+of+podocyte+structure+and+function+by+components+of+the+actin+cytoskeleton.">Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).</li><li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-localization+of+nephrin,+podocin,+and+the+actin+cytoskeleton+-+Evidence+for+a+role+in+podocyte+foot+process+formation.">Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation.</a> American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein+-+nephrin+-+is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Huber, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocin-mediated+recruitment+of+nephrin+into+lipid+rafts+is+required+for+efficient+nephrin+signaling.">Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPHS2,+encoding+the+glomerular+protein+podocin,+is+mutated+in+autosomal+recessive+steroid-resistant+nephrotic+syndrome.">NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome.</a> Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis.">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li><li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Testa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+nanoscopy+in+fixed+and+living+cells+by+exciting+conventional+fluorophores+with+a+single+wavelength.">Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> Embo Reports. 19 (9), (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nanoscale+optical+imaging+of+mouse+and+human+kidney+via+expansion+microscopy.">nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Rinschen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+deep+mapping+of+the+cultured+podocyte+proteome+uncovers+shifts+in+proteostatic+mechanisms+during+differentiation.">Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+protocols+for+imaging+proteins+and+RNA+in+cells+and+tissues.">Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).</li><li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy.">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+(U-ExM).">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

Den presenterade metoden gör det möjligt för prövaren att visualisera cellulära proteiner, t.ex. podocin, nephrin och cytoskeletala komponenter, t.ex. F-aktin. Inom detta protokoll används transfekterade cos7-celler som modell för att studera interaktion mellan slitsmembranproteiner och F-aktin. Tyvärr uttrycker odödliga podocyt cellinjer inte tillräckliga endogena mängder slitsmembranproteiner19.
Med denna metod kan cellulära proteiner visualiseras med nano...

Albuminuri är en surrogatparameter för kardiovaskulär risk och är resultatet av störningar i glomerulärt filter1. Det glomerulära filtret består av det fenestrerade endotel, det glomerulära källarmembranet och slitsmembranet som bildas av podocyter. Primära och sekundära fotprocesser av podocyter lindas runt den kapillärväggen i glomerulum2. Den känsliga strukturen hos fotprocesser upprätthålls av kortikala aktinbuntar som också fungerar som ankare för flera slitsmembranproteiner och andra adaptorproteiner2. Slitsmembranens ryggradsprotein kallas nephrin och interagerar på ett homofilt sätt med nephrinmolekyler av motsatta podocyter. Via olika adaptorproteiner är nephrin kopplad till aktin cytoskeleton2,3. Mutationer i nephrinkodningsgenen NPHS1 leder till nefrotiskt syndrom av den finska typ4.
Ett av nephrins interagerande proteiner är podocin, ett hårnålsliknande protein i stomatinfamiljen3. Podocin rekryterar nephrin till lipidflottar och länkar den till aktin cytoskeleton5. Podocin kodas av NPHS2-genen. Mutationer i NPHS2 leder till steroidresistent nefrotiskt syndrom6.
För att visualisera och samlokalisering av aktinadapterproteiner kan immunofluorescenstekniker användas. Tyvärr begränsar ljusets diffraktionsbarriär upplösningen av konventionella fluorescensmikroskop till 200-350 nm7. Nya mikroskopitekniker, t.ex. stimulerad utsläppsutarmning (STED)8, fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (PALM)9, stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM eller dSTORM) eller markstatsborttagningsmikroskopi följt av individuell molekylåterkomst (GSDIM)9,10,11, möjliggör en upplösning upp till cirka 10 nm. Dessa superupplösningstekniker kräver dock mycket dyra mikroskop, välutbildad personal och finns därför inte i många laboratorier.
Expansionsmikroskopi (ExM) är en ny och enkel teknik som möjliggör superupplösningsavbildning med konventionella mikroskop och är potentiellt tillgänglig för ett stort forskarsamhälle12. Vid proteinretentionsexpansionmikroskopi (proExM) fixeras och färgas provet av intresse (celler eller vävnad) med fluoroforer13. Proteiner i provet är sedan kovalst förankrade av en liten molekyl (6-(Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, AcX) till en svällbar hydrogel13. Genom enzymatisk matsmältning med proteinas K (ProK) bibehåller proteiner och fluoroforer sin relativa position i gelén efter expansion13. Efter svullnad av gelén expanderar provet upp till 4,5 gånger (90-faldig volymetrisk expansion) vilket leder till en effektiv lateral upplösning på cirka 60-70 nm (300 nm/4,5). Modifieringar av denna teknik kan till och med möjliggöra en 10-faldig expansion (1 000-faldig volymetrisk expansion), vilket ger en upplösning på 20-30 nm på konventionella mikroskop14,15,16.
Glomerulära strukturer av mus och mänskliga njurar har visualiserats via ExM17. I detta dokument presenterar vi ett detaljerat proExM-protokoll för att visualisera superupplösningsbilder av F-aktin och actin-adapterprotein podocin i celler med hjälp av ett konventionellt fluorescensmikroskop.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide &#62;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A-20770</td>
			<td>store up to 4 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Engelbrecht</td>
			<td>K12432</td>
			<td>24x32mm #1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamont cutter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>201-0392</td>
			<td>for cutting the cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td>8M Stock can be kept at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marten hair paintbrush</td>
			<td>Leon Hardy</td>
			<td>3 (770)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Menzel&#34; Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Thermo Fischer&#160;</td>
			<td>15654786</td>
			<td>24x24mm #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N`-Methylenbisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objekttr&#228;ger UniMark</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>703010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td>check purity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>produced at the university&#39;s workshop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well glass bottom plates</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin-ExM 546&#160;</td>
			<td>chrometra</td>
			<td>non-available</td>
			<td>1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Podocin produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0372-200UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti guinea-pig CF633</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB4600129-50UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti rabbit 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti nephrin</td>
			<td>Origene</td>
			<td>BP5030</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiview</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXIO Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>non-available</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy

Störningar av glomerular filtret består av glomerular endotel, glomerular källarmembran och podocyter, resulterar i albuminuria. Podocyt fotprocesser innehåller aktin buntar som binder till cytoskeletal adapter proteiner såsom podocin. Dessa adapterproteiner, såsom podocin, länkar ryggraden i det glomerulära slitsmembranet, såsom nephrin, till aktincytoskeletonet. Att studera lokalisering och funktion av dessa och andra podocytiska proteiner är avgörande för förståelsen av glomerulära filtrets roll i hälsa och sjukdom. Det presenterade protokollet gör det möjligt för användaren att visualisera aktin, podocin och nephrin i celler med superupplösningsavbildning på ett konventionellt mikroskop. För det första färgas celler med en konventionell immunofluorescensteknik. Alla proteiner i provet är sedan kovalst förankrade i en svällbar hydrogel. Genom matsmältningen med proteinas K klyvs strukturella proteiner som möjliggör isotropisk svullnad av gelén i det sista steget. Dialys av provet i vatten resulterar i en 4-4,5-faldig expansion av provet och provet kan avbildas via ett konventionellt fluorescensmikroskop, vilket ger en potentiell upplösning på 70 nm.

Konceptet och tidpunkten för detta proExM-protokoll visas i figur 1. Dag 5 är transfekterade celler fixerade och färgade med fluorescerande antikroppar riktade mot det protein som är av intresse(figur 1A,B). Dag 6 leder behandling med AcX till bildandet av amingrupper på alla proteiner (inklusive fluorforer) (figur 1A,B)12. Vid polymerisa...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy at JoVE.com

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Den presenterade metoden möjliggör visualisering av fluorescerande märkta cellulära proteiner med expansionsmikroskopi som leder till en upplösning på 70 nm på ett konventionellt mikroskop.

Avbildning av podocytiska proteiner Nephrin, Actin och Podocin med expansionsmikroskopi

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Detta expansion mikroskopiska protokoll gör det möjligt för prövaren att visualisera glomerulära proteiner med nanoskala upplösning på ett konventionellt mikroskop. Den största fördelen med expansionsmikroskopi är att den är tillgänglig för ett stort forskarsamhälle. Börja med att göra distanser till geleringskammaren.Skär nummer ett och nummer 1,5 glasskydd glider in i fem millimeters ränder med en diamantkniv. Placera en glasrutschbana i en målningskammare och placera nummer 1,5 täcksprutor på glasrutschbanan, så att de bildar en kvadrat på 2,5 centimeter. Pipett en droppe dubbelt destillerat vatten i hörnen av torget för att fästa glaslockets glidremsor på varandra och på glasrutschbanan.Vänta i cirka 20 minuter så att siffran 1,5 täckslipsar är stabilt fastsatta. Pipett en droppe vatten på varje nummer 1,5 täckspapp. Placera fyra nummer ett glasskyddsband på nummer 1,5 täckslips.För geleringskammarens lock, linda in ett täckglas med paraffinfilm och undvik veck eller smuts på filmen. För förankring av behandling, ta bort PBS från de immunmålade cellerna och tillsätt 250 mikroliter förankringsbuffert per brunn direkt på glaskåpan. Inkubera plattan i tre timmar vid rumstemperatur.Håll substratet i mörkret med hjälp av en låda. Efter inkubationen, ta bort förankringsbufferten och tvätta locket en gång med 1,5 milliliter PBS per brunn. För att färga aktinfibrer, tina en EXM-kompatibel falloidinlösning och inkubera den i 45 minuter vid rumstemperatur.Lös under tiden natrium akrylat i dubbelt destillerat vatten med hjälp av en omrörningsenhet och förbered monomerlösningen på is. Ta bort falloidin från cellerna och tvätta dem med 1,5 milliliter PBS, två gånger, vid rumstemperatur. Lämna 1,5 milliliter PBS i brunnen efter den sista tvätten.Använd tång och en kanyl för att lyfta täckglasets glid från sexbrunnsplattan och placera den i gelationskammaren. Tillsätt APS till geleringslösningen och virveln en kort stund. Pipett 200 mikroliter geleringslösning på provet och stäng försiktigt kammaren och undvik luftbubblor i gelén.Tillsätt vatten i färgkammaren och inkubera färgkammaren i minst en timme vid 37 grader Celsius för att polymerisera gelén. Ta ut färgkammaren ur inkubatorn. För att öppna gelationskammarens lock, sätt in ett rakblad mellan locket och distansen och ta försiktigt bort locket.Ta bort distanserna med rakbladet och skär av all extra gel. Använd en pensel för att lossa geléns kanter. Lägg rutschkanan med gelén och täckglaset i en skål fylld med PBS.Ta sedan bort det fristående täckglaset från gelén genom att skaka det försiktigt. Sätt rutschkanan under gelén för att fästa gelén på bilden. Dela upp gelén i små bitar med rakbladet med hjälp av gelen på bilden.Tryck försiktigt en bit gel i en brunn av en sex brunnsplatta med en glasbotten och veckla ut den med en pensel. Använd penseln för att hålla gelén återfuktad med en liten mängd PBS. Använd ett inverterat mikroskop och ta översiktsbilder med låg numerisk bländare för förexpansionsbilder.Späd proteinas K till fyra enheter per milliliter i matsmältningsbufferten för att göra matsmältningslösningen. Tillsätt 500 mikroliter av matsmältningslösningen till varje brunn och sänk ner gelén i lösningen. Låt det smälta över natten vid rumstemperatur med locket stängt för att hålla proverna i mörkret.Ta bort rötningslösningen med en pipett och kassera den. Tillsätt en milliliter dubbeldestillerat vatten och inkubera den nedsänkta gelén i 10 minuter vid rumstemperatur. Ta bort vattnet och tillsätt en milliliter färskt, dubbeldestillerat vatten.Fortsätt att byta vatten var 10: e minut tills en expansionsplatå nås, vilket gör att gelén blir optiskt klar. Ta bort vattnet från gelén och starta omedelbart mikroskopi. Använd ett inverterat mikroskop med hjälp av ett luftmål vid låg förstoring för att hitta celler i förexpansions tillstånd.Byt till 40 X- och 63 X-mål för bättre upplösning. Hetsa upp med våglängden av intresse och ta bilden via kameran. Detta EXM-protokoll möjliggör expansion på upp till fyra gånger.För att bestämma expansionsfaktorn är det viktigt att bildceller före och efter expansionen. Otillräcklig förankring och homogenisering kan leda till förvrängningar och sprängningar av celler. Representativa exempel på brustna celler visas här.Denna metod kan användas för att undersöka colocalization av F-aktin och aktin adapter proteiner, såsom podocin och nephrin. Podocin avbildas i grönt, aktin i blått och nephrin i rött. Vita områden indikerar colocalization.Den fluorescerande signalintensiteten och överflöd är nyckeln till framgångsrik EXM. Effektiv förankring av fluorescerande färgämnen via ACX är av avgörande betydelse för detta protokoll. I våra händer är löslig ACX bra i upp till tre till fyra månader.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metod för att visualisera och analysera membraninteragerande proteiner genom transmissionselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerisation av F-aktin på tidig Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid vävnader färgas med självlysande konjugerade Oligothiophenes av Hyperspektrala Confocal Microscopy och fluorescens livstid Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondera strukturen och dynamiken i Nucleosomes med hjälp av Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Avbildning av extracellulära blåsor med atomkraft mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitokona-och endoplasmatiska Retikulum avbildning av korrelat ljus och Volymelektronmikroskopi

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakterisera cellulära proteiner med In-cell Snabb fotokemisk oxidation av proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tvärgående sektionering av moget ris (Oryza sativa L.) Kärnor för skanning av elektronmikroskopiavbildning med pipettespetsar som immobiliseringsstöd

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Analysera interaktionen mellan fluorescerande märkta proteiner med konstgjorda fosfolipidmikrovesiklar med hjälp av kvantitativ flödescytometri

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...