Name: imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy
Uploaded: 2021-04-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy at JoVE.com

Yazarlar Blanka Duvnjak ve Nikola Kuhr'a mükemmel teknik yardımları için teşekkür etmek istiyor.

1. Hücrelerin bölünmesi ve tohumlama
<ol><li>%10 fetal baldır serumu (FCS), steril Fosfat tamponlu salin (PBS) ve steril tripsin dahil olmak üzere steril Dulbecco Modifiye Eagle's Medium 'u (DMEM) 37 °C'ye ısıtın. Temiz bankı aktif hale getir.</li>
	<li>Steril tokmaklar kullanarak her kuyuya bir steril cam kapak kayması (10 mm) ekleyerek 6 kuyulu bir plaka hazırlayın.</li>
	<li>Temiz tezgahın altına Cos7 hücreli 10 cm hücre kültürü yemeği koyun. Temiz tezgahın altında, bir vakum cihazı kullanar...

<ol>
	<li>Matsushita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts:+a+collaborative+meta-analysis.">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li><li>Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+up:+regulation+of+podocyte+structure+and+function+by+components+of+the+actin+cytoskeleton.">Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).</li><li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-localization+of+nephrin,+podocin,+and+the+actin+cytoskeleton+-+Evidence+for+a+role+in+podocyte+foot+process+formation.">Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation.</a> American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein+-+nephrin+-+is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Huber, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocin-mediated+recruitment+of+nephrin+into+lipid+rafts+is+required+for+efficient+nephrin+signaling.">Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPHS2,+encoding+the+glomerular+protein+podocin,+is+mutated+in+autosomal+recessive+steroid-resistant+nephrotic+syndrome.">NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome.</a> Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis.">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li><li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Testa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+nanoscopy+in+fixed+and+living+cells+by+exciting+conventional+fluorophores+with+a+single+wavelength.">Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> Embo Reports. 19 (9), (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nanoscale+optical+imaging+of+mouse+and+human+kidney+via+expansion+microscopy.">nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Rinschen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+deep+mapping+of+the+cultured+podocyte+proteome+uncovers+shifts+in+proteostatic+mechanisms+during+differentiation.">Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+protocols+for+imaging+proteins+and+RNA+in+cells+and+tissues.">Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).</li><li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy.">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+(U-ExM).">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

Sunulan yöntem, araştırmacının hücresel proteinleri, örneğin podocin, nephrin ve sitoskeletal bileşenleri, örneğin F-actin'i görselleştirmesini sağlar. Bu protokolde, transfected cos7 hücreleri, yarık diyafram proteinlerinin F-actin ile etkileşimini incelemek için bir model olarak kullanılır. Ne yazık ki, ölümsüzleştirilmiş podosit hücre hatları yeterli miktarda yarık diyafram proteinini ifade etmez19.
Bu yöntemle hücresel proteinler gelen...

Albüminüri kardiyovasküler riskin taşıyıcı bir parametresidir ve glomerüler filtrenin bozulmasından kaynaklanır1. Glomerüler filtre fenestratlı endotel, glomerüler bodrum zarı ve podositlerin oluşturduğu yarık diyaframdan oluşur. Podositlerin birincil ve ikincil ayak süreçleri glomerulum2'ninkılcal duvarının etrafına sarılır. Ayak proseslerinin hassas yapısı, birden fazla yarık diyafram proteini ve diğer adaptör proteinleri için çapa görevi gören kortikal akrin demetleri tarafından korunur2. Yarık diyaframın omurga proteinine nephrin denir ve karşıt podositlerin nefrin molekülleriyle homofilik bir şekilde etkileşime girer. Çeşitli adaptör proteinleri aracılığıyla, nephrin aktin sitoskeleton2,3ile bağlantılıdır. Nefrin kodlayıcı gen NPHS1'deki mutasyonlar Finlandiya tip4'ünnefrotik sendromuna yol açar.
Nephrin'in etkileşime giren proteinlerinden biri, stomatin ailesinin saç tokası benzeri bir proteini olan podocin3. Podocin lipid salları için nephrin işe ve actin sitoskeleton5bağlar . Podocin NPHS2 geni tarafından kodlanmıştır. NPHS2'deki mutasyonlar steroid dirençli nefrotik sendroma yol açar6.
Akin adaptör proteinlerini görselleştirmek ve birlikte lokalize etmek için immünofluoresans teknikleri kullanılabilir. Ne yazık ki, ışığın kırınım bariyeri geleneksel floresan mikroskopların çözünürlüğünü 200-350 nm7ile sınırlar. Yeni mikroskopi teknikleri, örneğin uyarılmış emisyon tükenmesi (STED)8, foto-aktif lokalizasyon mikroskopisi (PALM)9, stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (STORM veya dSTORM) veya zemin durumu silme mikroskopisi ve ardından bireysel molekül dönüşü (GSDIM) 9,10,11, yaklaşık 10 nm'ye kadar bir çözünürlük sağlar. Bununla birlikte, bu süper çözünürlük teknikleri çok pahalı mikroskoplar, iyi eğitimli personel gerektirir ve bu nedenle birçok laboratuvarda mevcut değildir.
Genleşme mikroskopisi (ExM), geleneksel mikroskoplarla süper çözünürlüklü görüntüleme sağlayan ve büyük bir araştırma topluluğu için potansiyel olarak kullanılabilen yeni ve basit bir tekniktir12. Protein tutma genleşme mikroskopisinde (proExM), ilgi örneği (hücreler veya doku) sabitlenir ve floroforlarla lekelenir13. Numune içindeki proteinler daha sonra küçük bir molekül (6-(((Acryloyl)amino)heksanoik asit, süksinimsal ester, AcX) tarafından koordine bir şekilde şişme bir hidrojel13'etutturulr. Proteinaz K (ProK) ile enzimmatik sindirim yoluyla, proteinler ve floroforlar genişlemeden sonra jel içindeki göreceli konumlarınıkorurlar 13. Jelin şişmesi sonrasında, numune 4,5 kata (90 kat hacimsel genleşme) kadar genişleyerek yaklaşık 60-70 nm (300 nm/4,5) etkili bir yanal çözünürlüğe sahiptir. Bu tekniğin modifikasyonları, geleneksel mikroskoplarda14,15,16'da20-30 nm çözünürlük oluşturarak 10 kat genişlemeye(1.000kat hacimsel genişleme) bile izin verebilir.
Fare ve insan böbreklerinin glomerüler yapıları ExM17ile görselleştirilmiştir. Bu yazıda, geleneksel bir floresan mikroskobu kullanarak F-actin ve aksin adaptörü protein podocin'in süper çözünürlüklü görüntülerini görselleştirmek için ayrıntılı bir proExM protokolü sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide &#62;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A-20770</td>
			<td>store up to 4 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Engelbrecht</td>
			<td>K12432</td>
			<td>24x32mm #1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamont cutter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>201-0392</td>
			<td>for cutting the cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td>8M Stock can be kept at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marten hair paintbrush</td>
			<td>Leon Hardy</td>
			<td>3 (770)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Menzel&#34; Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Thermo Fischer&#160;</td>
			<td>15654786</td>
			<td>24x24mm #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N`-Methylenbisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objekttr&#228;ger UniMark</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>703010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td>check purity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>produced at the university&#39;s workshop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well glass bottom plates</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin-ExM 546&#160;</td>
			<td>chrometra</td>
			<td>non-available</td>
			<td>1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Podocin produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0372-200UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti guinea-pig CF633</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB4600129-50UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti rabbit 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti nephrin</td>
			<td>Origene</td>
			<td>BP5030</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiview</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXIO Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>non-available</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy

Glomerüler endotel, glomerüler bodrum membranı ve podositlerden oluşan glomerüler filtrenin bozulması albüminüri ile sonuçlanır. Podosit ayak prosesleri, podocin gibi sitoskeletal adaptör proteinlerine bağlanan aktin demetleri içerir. Podocin gibi adaptör proteinleri, nefrin gibi glomerüler yarık diyaframın omurgasını aktin sitoskeleton'a bağlar. Bu ve diğer podositik proteinlerin lokalizasyonunu ve işlevini incelemek, glomerüler filtrenin sağlık ve hastalıktaki rolünün anlaşılması için gereklidir. Sunulan protokol, kullanıcının geleneksel bir mikroskopta süper çözünürlüklü görüntüleme ile hücrelerde akrin, podokin ve nefrin görselleştirmesini sağlar. İlk olarak, hücreler geleneksel bir immünoresans tekniği ile lekelenir. Numunedeki tüm proteinler daha sonra kovalently şişme bir hidrojel'e tutturulır. Proteinaz K ile sindirim yoluyla, yapısal proteinler son adımda jelin izotropik şişmesine izin vererek bölünür. Numunenin suda diyaliz edilmesi, numunenin 4-4,5 kat genişlemesine neden olur ve numune geleneksel bir floresan mikroskobu ile görüntülenebilir ve 70 nm'lik potansiyel bir çözünürlük sağlar.

Bu proExM protokolünün kavramı ve zamanlaması Şekil 1'de tasvir edilmiştir. 5. günde, transfected hücreler ilgi proteinini hedefleyen floresan antikorlarla sabitlenir ve lekelenir (Şekil 1A,B). 6. günde, AcX ile tedavi tüm proteinler üzerinde amin gruplarının oluşumuna yol açar (floroforlar dahil) (Şekil 1A,B)12. Hidrojel poli...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy at JoVE.com

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Sunulan yöntem, floresan etiketli hücresel proteinlerin, geleneksel bir mikroskopta 70 nm çözünürlüğe yol açan genleşme mikroskopisi ile görselleştirilmesini sağlar.

Podosit Proteinleri Nephrin, Actin ve Podocin'in Genleşme Mikroskopisi ile Görüntülenmesi

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Bu genleşme mikroskobik protokolü, araştırmacının glomerüler proteinleri geleneksel bir mikroskopta nano ölçekli çözünürlükle görselleştirmesini sağlar. Genişleme mikroskopisinin temel avantajı, büyük bir araştırma topluluğunun erişebileceği olmasıdır. Jelasyon odası için aralayıcılar yaparak başlayın.Bir numaralı ve 1,5 numaralı cam kapağı elmas bir bıçak kullanarak beş milimetrelik çizgilere bölün. Bir cam kaydırağı bir boyama odasına yerleştirin ve 1,5 numaralı kapak kayma çizgilerini cam kaydırağın üzerine yerleştirin, böylece 2,5 santimetre kare oluştururlar. Pipet, cam kapak kayma çizgilerini birbirine ve cam kaydırağa yapışmak için meydanın köşelerine çift damıtılmış su damlası.1,5 numaralı kapak fişlerinin dikkatlice tutturulması için yaklaşık 20 dakika bekleyin. Pipet her sayı 1.5 kapak kayma şeridinde bir damla su. 1,5 numaralı kapak fişlerinin üzerine dört adet bir numaralı cam kapak kayması şeridi yerleştirin.Jelleşme odası kapağı için, filmdeki herhangi bir kıvrım veya kirden kaçınarak parafin filmi ile bir kapak camı sarın. Ankraj tedavisi için PBS'yi bağışıklık lekeli hücrelerden çıkarın ve kuyu başına 250 mikrolitre ankraj tamponu doğrudan cam kapak kaymasına ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında üç saat kuluçkaya yatırın.Bir kutu kullanarak substratı karanlıkta tutun. İnkübasyondan sonra, ankraj tamponunu çıkarın ve kapak fişini kuyu başına 1,5 mililitre PBS ile bir kez yıkayın. Akrin liflerini lekelemek için EXM uyumlu bir phalloidin çözeltisini çözün ve oda sıcaklığında 45 dakika kuluçkaya bırakın.Bu arada, sodyum akrilatları karıştırma cihazı kullanarak çift damıtılmış suda çözün ve monomer çözeltisini buz üzerinde hazırlayın. Phalloidin'i hücrelerden çıkarın ve oda sıcaklığında iki kez 1,5 mililitre PBS ile yıkayın. Son yıkamadan sonra kuyuda 1,5 mililitre PBS bırakın.Kapak camı kaymasını altı kuyu plakasından kaldırmak ve jelasyon odasına yerleştirmek için kümesler ve bir canül kullanın. Jelleşme çözeltisine ve girdabına kısaca APS ekleyin. Pipet Numune üzerinde 200 mikrolitre jelleşme çözeltisi ve jel içindeki hava kabarcıklarını önleyerek odayı dikkatlice kapatın.Boyama odasına su ekleyin ve jeli polimerize etmek için leke odasını 37 santigrat derecede en az bir saat kuluçkaya bırakın. Leke haznesini inkübatörden çıkar. Jelasyon odası kapağını açmak için, kapak ve aralayıcı arasına bir jilet takın ve kapağı dikkatlice çıkarın.Aralayıcıları jiletle çıkarın ve tüm ekstra jeli kesin. Jelin kenarlarını ayırmak için bir boya fırçası kullanın. Jel ve kapak camı ile slaytı PBS ile dolu bir tabağa koyun.Daha sonra kopan kapak camını hafifçe sallayarak jelden çıkarın. Jeli slayda takmak için slaydı jelin altına koyun. Jel slayttayken, jilet kullanarak jeli küçük parçalara bölün.Bir parça jeli cam tabanlı altı kuyu plakasının kuyusuna hafifçe itin ve bir boya fırçasıyla açın. Jeli az miktarda PBS ile nemlendirmek için boya fırçasını kullanın. Ters mikroskop kullanarak, genişletme öncesi görüntüler için düşük sayısal diyafram açıklığına sahip genel bakış görüntüleri alın.Sindirim çözeltisini yapmak için proteinaz K'yi sindirim tamponunda mililitre başına dört üniteye seyreltin. Her kuyuya 500 mikrolitre sindirim çözeltisi ekleyin ve jeli çözeltinin içine daldırın. Numuneleri karanlıkta tutmak için kapak kapalıyken oda sıcaklığında gece boyunca sindirin.Sindirim solüsyonunu bir pipetle çıkarın ve atın. Bir mililitre çift damıtılmış su ekleyin ve daldırılmış jeli oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya bırakın. Suyu çıkarın ve bir mililitre taze, çift damıtılmış su ekleyin.Bir genişleme platosununa ulaşılana kadar her 10 dakikada bir su alışverişine devam edin ve jelin optik olarak netleşmesine neden olun. Suyu jelden çıkarın ve hemen mikroskopiye başlayın. Ters mikroskop kullanarak, genişleme öncesi durumdaki hücreleri bulmak için düşük büyütmede bir hava hedefi kullanın.Daha iyi çözünürlük için 40 X ve 63 X hedefine geçin. İlginin dalga boyu ile heyecanlandırın ve görüntüyü kamera üzerinden alın. Bu EXM protokolü dört kata kadar genişleme sağlar.Genişletme faktörünü belirlemek için genişlemeden önce ve sonra hücreleri görüntüleyesiniz. Yetersiz ankraj ve homojenizasyon hücrelerin bozulmasına ve yırtılmasına yol açabilir. Yırtılmış hücrelerin temsili örnekleri burada gösterilmiştir.Bu yöntem, podokin ve nefrin gibi F-actin ve akrin adaptör proteinlerinin kolokalizasyonunu araştırmak için kullanılabilir. Podocin yeşil, actin mavi ve nephrin kırmızı ile tasvir edilir. Beyaz alanlar kolokalizasyonu gösterir.Floresan sinyal yoğunluğu ve bolluğu başarılı EXM için anahtardır. Floresan boyaların ACX üzerinden verimli bir şekilde tutturulduğu bu protokol için kritik öneme sahiptir. Elimizde çözünür ACX üç ila dört aya kadar iyidir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Vitro F-aktin üzerinde erken Endosomes polimerizasyon

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Amiloid doku Imaging ile Işıksaçan konjuge Oligothiophenes Hyperspectral tarafından Confocal mikroskobu ve floresan ömür boyu görüntüleme lekeli

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Hücre Dışı Veziküllerin Görüntülenmesi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Hücre İçi Hızlı Fotokimyasal Oksidasyon ile Hücresel Proteinlerin Karakterizasyonu

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Floresan Etiketli Proteinlerin Yapay Fosfolipid Mikrovezikülleri ile Etkileşiminin Kantitatif Akış Sitometrisi Kullanılarak Analiz Edilmesi

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...