Name: visualizing lung cellular adaptations during combined ozone and lps induced murine acute lung injury
Uploaded: 2021-03-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury at JoVE.com

Den gennemførte forskning er finansieret af præsidentens NSERC tilskud samt start-up midler fra Sylvia Fedoruk canadiske Center for Nuclear Innovation. Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation er finansieret af Innovation Saskatchewan. Fluorescens imaging blev udført på WCVM Imaging Centre, som er finansieret af NSERC. Jessica Brocos (MSc Student) og Manpreet Kaur (MSc Student) blev finansieret af start-up midler fra Sylvia Fedoruk canadiske Center for Nuklear Innovation.

Undersøgelsen design blev godkendt af University of Saskatchewan's Animal Research Ethics Board og overholdt den canadiske Rådet for Animal Care retningslinjer for human dyrefoder. Seks-otte uger gamle mandlige C57BL/6J mus blev indkøbt. BEMÆRK: Aflive dyr, der udvikler alvorlig sløvhed, åndedrætsbesvær eller andre tegn på alvorlig nød før planlagt slutpunkt.
BEMÆRK: Forbered følgende: 27-18 G nålestumpet (afhænger af musens luftrørdiameter), passende størrelse PE-slange, så ...

<ol>
	<li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury.">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).</li><li>Aulakh, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+lung:+"the+first+responders".">Neutrophils in the lung: "the first responders".</a> Cell Tissue Research. , (2017).</li><li>Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiostatin+inhibits+acute+lung+injury+in+a+mouse+model.">Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).</li><li>Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+9+partially+regulates+lung+inflammation+induced+following+exposure+to+chicken+barn+air.">Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air.</a> Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).</li><li>Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+mediates+the+late+phase+of+neutrophil+recruitment+to+the+lung+in+murine+models+of+acute+lung+injury.">Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).</li><li>Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiostatin+inhibits+activation+and+migration+of+neutrophils.">Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils.</a> Cell Tissue Research. , (2013).</li><li>Cakmak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+long-term+PM2.5+and+ozone+exposure+and+mortality+in+the+Canadian+Census+Health+and+Environment+Cohort+(CANCHEC),+by+spatial+synoptic+classification+zone.">Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone.</a> Environment International. 111, 200-211 (2018).</li><li>Dauchet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+exposure+to+air+pollution:+Associations+with+lung+function+and+inflammatory+markers+in+non-smoking,+healthy+adults.">Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults.</a> Environment International. 121, 610-619 (2018).</li><li>Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+air+pollution+on+emergency+room+visits+for+respiratory+illnesses+in+Montreal,+Quebec.">Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).</li><li>Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ozone+on+leukocyte+function+in+exposed+human+subjects.">Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects.</a> Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).</li><li>Rush, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+chronic+exposure+to+air+pollution+and+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome.">Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).</li><li>Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Chronic+Ozone+and+Particulate+Air+Pollution+on+Mortality+in+Patients+With+Sepsis+Across+the+United+States.">The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States.</a> Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).</li><li>Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+ozone+and+asthma+emergency+department+visits+in+Saint+John,+New+Brunswick,+Canada.">Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada.</a> Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).</li><li>Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone+modifies+the+metabolic+and+endocrine+response+to+glucose:+Reproduction+of+effects+with+the+stress+hormone+corticosterone.">Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).</li><li>Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+low-dose+ozone-induced+murine+acute+lung+injury.">Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).</li><li>Aulakh, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+regional+murine+ozone-induced+lung+inflammation+using+[18F]F-FDG+microPET/CT+imaging.">Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).</li><li>Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+responses+to+secondary+endotoxin+challenge+in+rats+exposed+to+pig+barn+air.">Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air.</a> Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, 24 (2008).</li><li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation.">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li><li>Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+intranasal+instillations+in+mice:+effects+of+volume,+time,+body+position,+and+anesthesia.">Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).</li><li>Aulakh, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+CD34+produces+defects+in+platelets,+microparticles,+and+lung+inflammation.">Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation.</a> Cell Tissue Research. , (2020).</li><li>Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+and+recovery+of+the+alveolar+macrophage+phagocytic+system+during+continuous+exposure+to+0.5+ppm+ozone.">Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone.</a> Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).</li><li>Yipp, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lung+is+a+Host+Defense+Niche+for+Immediate+Neutrophil-Mediated+Vascular+Protection.">The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection.</a> Science Immunology. 2 (10), (2017).</li><li>Lee, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiostatin+regulates+the+expression+of+antiangiogenic+and+proapoptotic+pathways+via+targeted+inhibition+of+mitochondrial+proteins.">Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins.</a> Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).</li><li>Hawkins, C. L., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+identification,+and+quantification+of+oxidative+protein+modifications.">Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).</li><li>Hemming, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Pollutant+Ozone+Causes+Damage+to+Lung+Surfactant+Protein+B+(SP-B).">Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B).</a> Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).</li><li>Oosting, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+surfactant+protein+A+to+ozone+in+vitro+and+in+vivo+impairs+its+interactions+with+alveolar+cells.">Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells.</a> American Journal of Physiology. 262 (1), 63-68 (1992).</li><li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+necrotic+neutrophils+release+interleukin-16C+and+macrophage+migration+inhibitory+factor+from+stores+in+the+cytosol.">Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol.</a> Cell Death &amp; Discovery. 1, 15056 (2015).</li><li>Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+CXCR4+in+Normal+and+Abnormal+Development.">Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development.</a> Cells. 8 (2), (2019).</li><li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrapulmonary+manifestations+of+COVID-19.">Extrapulmonary manifestations of COVID-19.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).</li><li>Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).</li><li>Aulakh, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+image+x-radiography+for+functional+lung+imaging.">Multiple image x-radiography for functional lung imaging.</a> Physics in Medicine &amp; Biology. 63 (1), 015009 (2018).</li></ol>

De metoder, der præsenteres i den aktuelle undersøgelse fremhæve nytten af flere rum analyse til at studere flere cellulære begivenheder under lungebetændelse. Vi har sammenfattet resultaterne i tabel 2. Vi og mange laboratorier har grundigt studeret murine reaktion intranasal LPS instillation, som er præget af hurtig rekruttering af lunge neutrofiler, som topper mellem 6-24 timer efter hvilken opløsning spark i. Og for nylig har vi vist, at subklinisk O3 (ved 0,05 ppm i 2 timer) alene ...

Akut lungeskade (ALI) er en afgørende patologisk reaktion fra lungerne på infektiøse eller andre skadelige stimuli, som er præget af samtidig aktivering af koagulativt, fibrinolytisk og medfødt immunforsvar1. Neutrofiler hurtigt forstand mikrobielle samt intracellulære skader mønstre gennem Toll-lignende receptor (TLR) familie2,3,4. Neutrofiler frigiver præfabrikerede cytokiner og cytotoksisk granulatindhold, som derefter kan forårsage skader på væv i sikkerhedsstillelse. Den efterfølgende alveolar skade er skæmmet med sekundær celledød, der fører til frigivelse af molekyler som adenosin triphosphat (ATP)5, og dermed indstilling i en ond cirkel af immun-dysregulering.
Et uløst problem i forståelsen af ALI vedrører spørgsmålet om, hvordan skaden er indledt inden for alveolarmembranen. Elektrontransportkomplekset V, F1F0 ATP-synthase, er et mitokondrieprotein, der vides at udtrykkes allestedsnærværende, på celle (herunder endotel, leukocyt, epitel) plasmamembran under inflammation. Cellen cytoskeleton, som består af actin og tubulin, huser mange celleform og funktion modulerende samt mitokondrie proteiner, henholdsvis. Vi har for nylig vist, at blokade af ATP-synthase af et endogent molekyle, angiostatin, tavsheder neutrofil rekruttering, aktivering og lipopolysaccharid (LPS) induceret lungebetændelse6. Således kan både biokemiske (ATP-synthase) og immunmekanismer (TLR4) regulere alveolarbarrieren under lungebetændelse.
Udsættelse for ozon (O3), et miljøforurenende stof, svækker lungefunktionen, øger modtageligheden for lungeinfektioner, og korte lave niveauer af O3-eksponeringer øger risikoen for dødelighed hos personer med underliggende kardiorespiratoriske tilstande7,8,9,10,11,12,13,14. Således giver eksponering for fysiologisk relevantekoncentrationer af O 3 en meningsfuld model af ALI til undersøgelse af grundlæggende mekanismer forinflammation 7,8. Vores laboratorium har for nylig etableret en murine model af lav-dosis O3 induceret ALI15. Efter at have udført en dosis og tidsrespons på lave O3-koncentrationer observerede vi, at eksponering for 0,05 ppm O3 i 2 timer fremkalder akut lungeskade, der er præget af lunge ATP-synthasekomplekset V-underenhed β (ATPβ) og angiostatinudtryk, svarende til LPS-modellen. Intravital lunge billeddannelse afslørede uorganisering af alveolar actin mikrofilamenter angiver lungeskader, og ablation af alveolar septal reaktive iltarter (ROS) niveauer (angiver abrogation af baseline celle signalering) og mitokondriemembran potentiale (angiver akut celledød) efter 2 timers eksponering for 0,05 ppm O315, som korreleret med en heterogen lunge 18FDG retention16, neutrophil rekruttering og cytokin frigivelse, især IL-16 og SDF-1α. Hjemmebudskabet fra vores seneste undersøgelser er, at O3 producerer eksponentielt høj toksicitet, når de udsættes for koncentrationer under de tilladte grænser på 0,063 ppm over 8 timer (pr. dag) for menneskelig eksponering. Det er vigtigt, at der ikke er nogen klar forståelse af, om disse subkliniske O3-eksponeringer kan modulere TLR4-medierede mekanismer som ved bakteriel endotoxin17. Således har vi studeret en dual-hit O3 og LPS eksponering model og observerede immunforsvaret og ikke-immune cellulære tilpasninger.
Vi beskriver en omfattende fluorescerende mikroskopisk analyse af forskellige lunge- og systemiske karrosserirum, nemlig broncho-alveolar lavagevæsken (dvs. BAL), som prøver alveolar rum, lunge vaskulær perfusate (dvs. LVP), der prøver lungevakulturen og alveolar septal interstitium i tilfælde af en kompromitteret endotel barriere, venstre lunge cryosections, at se på hjemmehørende parenchymal og vedhængende leukocytter tilbage i lavaged lungevæv , perifert blod, som repræsenterer de cirkulerende leukocytter og bryst- og lårbenets knoglemarv, der prøver de proksimale og distale steder af henholdsvis hæmatopoietisk cellemobilisering under betændelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>33-plex Bioplex chemokine panel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12002231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO CS (11506188)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 conjugated phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555 conjugated mouse anti-&#945; tubulin clone DM1A</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-829X-555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 J Mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>aliquot in 2 &#181;l stocks and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent wide field microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Narketan)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>100 mg/ml</td>
			<td>Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ATP5&#946; IgG2b (clone 3D5AB1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16-5941-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660 nm protein assay</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>22660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-6093-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-5698-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16-9668-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>53-5931-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced mitotracker orange</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Rompun)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>20 mg/ml</td>
			<td>Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing lung cellular adaptations during combined ozone and lps induced murine acute lung injury

Lungerne står konstant over for direkte og indirekte fornærmelser i form af sterile (partikler eller reaktive toksiner) og infektiøse (bakterielle, virale eller svampe) inflammatoriske tilstande. En overvældende vært respons kan resultere i kompromitteret åndedræt og akut lungeskade, som er karakteriseret ved lunge neutrofil rekruttering som følge af pato-logisk vært immun, koagulativ og væv remodeling respons. Følsomme mikroskopiske metoder til at visualisere og kvantificere murin lunge cellulære tilpasninger, som reaktion på lav dosis (0,05 ppm) ozon, en potent miljøforurenende stof i kombination med bakteriel lipopolysaccharid, en TLR4 agonist, er afgørende for at forstå værten inflammatoriske og reparation mekanismer. Vi beskriver en omfattende fluorescerende mikroskopisk analyse af forskellige lunge-og systemiske kropsrum, nemlig broncho-alveolar lavage væske, lunge vaskulær perfusate, venstre lunge cryosections, og brystbenet knoglemarv perfusate. Vi viser skader på alveolar makrofager, neutrofiler, lungeparenchymalt væv samt knoglemarvsceller i korrelation med et forsinket (op til 36-72 h) immunrespons, der er præget af diskrete kemokingradienter i de analyserede rum. Derudover præsenterer vi lunge ekstracellulær matrix og cellulære cytoskeletale interaktioner (actin, tubulin), mitokondrie og reaktive iltarter, antikoagulativ plasminogen, dens anti-angiogene peptidfragment angiostatin, mitokondrie ATP-synthasekomplekset V-underenheder, α og β. Disse surrogat markører, når suppleret med tilstrækkelig in vitro celle-baserede assays og in vivo dyr billeddannelse teknikker såsom intravital mikroskopi, kan give vigtige oplysninger til at forstå lungerespons på nye immunmodulatoriske midler.

Kombineret O3- og LPS-eksponering fører til systemisk inflammation og knoglemarvsmobilisering ved 72 timer: Celletællinger i forskellige rum afslørede betydelige ændringer i perifert blod, og lårbenets knoglemarvs samlede celletal ved kombineret O3- og LPS-eksponering. Selv om kombinerede O3- og LPS-eksponeringer ikke fremkaldte nogen ændringer i det samlede antal BAL-celler (figur 1A) eller ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury at JoVE.com

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

Kombineret ozon og bakteriel endotoxin eksponerede mus viser udbredt celledød, herunder neutrofiler. Vi observerede cellulære tilpasninger såsom forstyrrelse af cytoskeletal lamellipodia, øget cellulær ekspression af komplekse V ATP-syntetiserende underenhed β og angiostatin i broncho-alveolar-lavage, undertrykkelse af lunge immunrespons og forsinket neutrofil rekruttering.

Visualisering lungcellulære tilpasninger under kombineret ozon og LPS induceret Murine akut lungeskade

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

Hej, mit navn er Gurpreet. Vores laboratorium undersøger mekanismer af lungebetændelse og reparation. Hej, mit navn er Jessica og jeg undersøge ozon-induceret lab rotte alveoler ved hjælp af fluorescerende mikroskopiske metoder.Hej alle, mit navn er Manpreet. Og jeg studerer lungebetændelse med dyrebilleddannelsesmetoder. Lungerne står konstant over for direkte og indirekte fornærmelser, der opstår som følge af sterile, såsom ozon, og mikrobielle komponenter, såsom bakteriel lipopolysaccharid eller LPS.En overvældende vært respons kan resultere i kompromitteret åndedræt og akut lungeskade som karakteriseret ved lunge neutrofil rekruttering, på grund af ureguleret vært immun, koagulativ, og væv remodeling. Vi beskriver en omfattende analyse af forskellige rum, nemlig broncho-alveolar lavagevæsken, det vil sige BAL, lungevakulær perfusate, det vil sige LVP, venstre lunge cryo sektioner, perifert blod og bryst- og lårbens knoglemarven. Ved ozoneksponering anbringes mus forsigtigt i den brugerdefinerede induktionsboks, og musene udsættes kontinuerligt for 0,05 PPM ozon i to timer.Ved LPS-eksponering bedøver musene under let intraperitoneal ketamin og xylazinblanding. Indgyde nu 50 mikroliter fra LPS-opløsningen i musenes eksterne narer. Indgyde kontrol mus med 50 mikroliter steril saltvand.På bestemte tidspunkter bedøver musene med den fulde dosis ketamin og xylazinblanding. Derefter desinficer musene og kontroller for pedalreflekser, det vil sige klemme et af bagbenenes cifre, og observere for tilbagetrækning af lemmerne. Ingen refleks betyder dyb anæstesi.Nu gør et snit under brystbenet og udsætte hjertet. Placer en 25 gauge nål fastgjort til hepariniseret sprøjte i højre hjertekammer og trække blod ved hjerte punktering. Opsamle blodet i hepariniserede sprøjter og afløb i mikrofuge rør til videre behandling.Brug forsigtigt pincet eller stumpe pincet til at rydde trachealområdet fra overliggende væv. Skær nu gennem brystkassen for at afsløre lungerne. Pass en bomuld ligatur under luftrøret, og lad det være sådan for tiden.Klip luftrøret, fordelt på omkring en tredjedel af sin længde fra lungerne for trakeostomi. Sæt en 28 gauge polyethylen kanyle i luftrøret. Bind bomuldsligaturen fast for at holde kanylen på plads.Sørg for, at du ikke kollapser kanylen. Nu injiceres gradvist 0,5 ml PBS i kanylen ved hjælp af en en ml sprøjte. Efter injektion af PBS suges sprøjten ud, så længe den ikke modstår sugningen.Opsaml den indsugningsvæske i et mærket mikrofagør, og gentag denne procedure to gange mere. Skær den faldende thoracic aorta på placeringen mellem bryst- og abdominalhalvdelene for at undgå backup under lungeperfusion. Blot hulrummet nær cut aorta ende fri for blod.Næste perfuse lungerne med 0,5 ML stuetemperatur heparinized saltvand, injicere det gennem højre hjertekammer. Saml det vaskulære perfusate fra hulrummet i den afskårne ende af den faldende bryst aorta. Efter ligating højre bronus, lad venstre lunge pustes op med 0,5 ML paraformaldehyd i fem minutter.Desinficer nu abdominaldelen. Skær mavedelen over og skrivebord i den fra bækkenbenet. Saml bækkenbenet og isoler venstre og højre lårbensben i en saltvandsfyldt petriskål, der holdes på is.Saml det ventrale brystkasse og brystben i en saltvandsfyldt petriskål, som også opbevares på is. Skær de afskårne ender af knoglerne med fire gange med 0,5 ML saltvand ved hjælp af velsiddende nåle på 1 ML sprøjter. Opsamle fraktioner fra hver knogle i mærket Falcon rør, udstyret med filtre og placeret på is.Centrifuge alle prøverne i 10 minutter ved 3000 omdrejninger i minuttet. Saml supernatants og flash fryse dem. Rekonstituere cellerne i mindst 200 mikroliter af PBS.Udfør det samlede antal leukocyte. Pletten en anden væske af BAL med en blanding af calcein grøn og den røde ethidium homodimer en plet. Analyser supernatanten for kemokiner og total proteinkoncentration.Centrifuge cellerne til at forberede to cytospins på hver dias og plet for biokemiske og immunproteiner. Udfør modificeret H og E farvning på lunge cryosections for alle grupper. Konturér manuelt 150 til 200 celler i det flettede billedpanel.Kopier de skitserede områder af interesse til alle kanalerne. Mål de forudindstillede parametre for alle kanalerne. Divider fluorescerende intensiteten af det farvede molekyle med DAPI eller CD61.Disse kaldes DAPI- eller CD 61-normaliserede lysstofprocenter. Næste plot parametrene til at evaluere eventuelle ændringer efter eksponering. Selv om kombineret eksponering ikke fremkaldte nogen ændringer i det samlede antal BAL-, LVP- eller hækale knoglemarvsceller, viste musene systemisk leukocytose efter 24 timer, som blev efterfulgt af leukopeni 72 timer efter eksponering.Disse vises i de perifere blodlegemer. Lårbenet knoglemarvsceller tæller viser den sene spike på 72 timer i forhold til alle de tidspunkter. Bemærk fraværet af Siglec-F og CX3CRI farvning i polymorphonuclear celler på 24 timer i billedet af BAL cytospin.BAL og LVP cytospins viste tilstedeværelsen af store CD11b og GR1 positive mononukleare celler på nul timer. Polymorfonerare celler præsenteret som en fremherskende celletype i alle rum efter eksponering. BAL's samlede proteinindhold var højest 36 timer efter kombineret eksponering.LVP-proteinet var imidlertid uændret efter eksponering. Niveauer af eotaxin-2 og interleukin-2 var højest på de fire timer i LVP. Disse kemokiner blev reduceret i BAL-fraktionen.Interessant, den neutrofile alarmerende IL-16 og mange medfødte kemokiner blev ændret i LVP, men ikke BAL fraktion. Ved baseline mere end 95% af BAL celler var mono nukleare viser kortikale actin, lamellipodia, stress og tubulin fibre, og de var stærkt positive for reduceret mitotracker farvning. På fire timer observerede vi cirkulære BAL-celler, som havde mistet actin, men viste et spredt mikrotubulenetværk som vist i rød og lavere reduceret mitotracker farvning.Tidligt efter den kombinerede eksponering optrådte BAL-celler dobbelt positive for calcein og ethidium homodimer-1, hvilket indikerer delvist kompromitterede celler. På 36 timer, bal celler var stort set levedygtige, det er grønt. Vi observerede diskret ATP alpha og Ly6G farvning i BAL alveolar makrofager, og neutrofiler.Vi observerede en reduktion i DAPI normaliseret ATP alpha og en stigning i intracellulært Ly6G proteinindhold. De kombinerede eksponeringer inducerede forbigående udtryk for Bal, naturlige dræberceller og K1.1, neutrophil ATP, subenhed PETA, spredningsfaktor, Ki-67 og vedvarende udtryk for neutrofil GR1, blodplade CX3CRI og anti-angiogent angiostatinprotein i BAL-celler efter eksponering. Selv om bronchiolar og alveolar septal skader var forventet, var det overraskende at observere cellulære aggregater i større fartøjer på 36 timer efter eksponering.Endelig har vi sammenfattende resultater i denne tabel. Vi håber, at vores murine model fungerer som en let tilgængelig prototype, der kan reproduceres i niveau to indeslutning labs for at studere mekanismerne for invasiv celledød og infektioner. Tak.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza virusformering i befrugtede hønseæg

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila ydermembranvesikler: Isolering og analyse af deres pro-inflammatorisk potentiale på makrofager

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Meget multiplexeret, superopløselig billeddannelse af T-celler ved hjælp af madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisere makrofag ekstracellulære fælder ved hjælp af konfokalmikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Vurdering af den cytotoksiske og immunmodulerende virkninger af stoffer i menneskelige præcision-cut lunge skiver

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

Lunge mikroRNA profilering på tværs af the Estrous cyklus i ozon-eksponerede mus

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Induktion af mus lungeskade ved Endotracheal injektion af bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Design af cecal ligation og punktering og intranasal infektion Dual model af sepsis-induceret immunsuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

A Model of Self-limited Acute Lung Injury by Unilateral Intra-bronchial Acid Instillation

En model for selv begrænset akut lungeskade ved ensidig instillation af intra-bronkial syre

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...