Name: visualizing lung cellular adaptations during combined ozone and lps induced murine acute lung injury
Uploaded: 2021-03-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury at JoVE.com

המחקר שנערך ממומן על ידי מענק NSERC של הנשיא, כמו גם קרנות הזנק מהמרכז הקנדי סילביה פדורוך לחדשנות גרעינית. המרכז הקנדי לחדשנות גרעינית ע"ש סילביה פדורק ממומן על ידי חדשנות ססקצ'ואן. הדמיית פלואורסצנטיות בוצעה במרכז ההדמיה WCVM, הממומן על ידי NSERC. ג'סיקה ברוקוס (סטודנטית לתואר שני) ומנטורט קאור (סטודנטית לתואר שני) מומנו על ידי קרנות הסטארט-אפ מהמרכז הקנדי לחדשנות גרעינית ע"ש סילביה פדורק.

תכנון המחקר אושר על ידי מועצת האתיקה לחקר בעלי חיים של אוניברסיטת ססקצ'ואן ודבק בהנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים לשימוש אנושי בבעלי חיים. שישה-שמונה שבועות זכר C57BL / 6J עכברים הושגו. הערה: המתת חסד לכל בעלי חיים המפתחים עייפות חמורה, מצוקה נשימתית או סימנים אחרים של מצוקה חמורה לפני נק...

<ol>
	<li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury.">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).</li><li>Aulakh, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+lung:+"the+first+responders".">Neutrophils in the lung: "the first responders".</a> Cell Tissue Research. , (2017).</li><li>Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiostatin+inhibits+acute+lung+injury+in+a+mouse+model.">Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).</li><li>Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+9+partially+regulates+lung+inflammation+induced+following+exposure+to+chicken+barn+air.">Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air.</a> Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).</li><li>Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+mediates+the+late+phase+of+neutrophil+recruitment+to+the+lung+in+murine+models+of+acute+lung+injury.">Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).</li><li>Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiostatin+inhibits+activation+and+migration+of+neutrophils.">Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils.</a> Cell Tissue Research. , (2013).</li><li>Cakmak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+long-term+PM2.5+and+ozone+exposure+and+mortality+in+the+Canadian+Census+Health+and+Environment+Cohort+(CANCHEC),+by+spatial+synoptic+classification+zone.">Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone.</a> Environment International. 111, 200-211 (2018).</li><li>Dauchet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+exposure+to+air+pollution:+Associations+with+lung+function+and+inflammatory+markers+in+non-smoking,+healthy+adults.">Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults.</a> Environment International. 121, 610-619 (2018).</li><li>Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+air+pollution+on+emergency+room+visits+for+respiratory+illnesses+in+Montreal,+Quebec.">Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).</li><li>Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ozone+on+leukocyte+function+in+exposed+human+subjects.">Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects.</a> Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).</li><li>Rush, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+chronic+exposure+to+air+pollution+and+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome.">Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).</li><li>Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Chronic+Ozone+and+Particulate+Air+Pollution+on+Mortality+in+Patients+With+Sepsis+Across+the+United+States.">The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States.</a> Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).</li><li>Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+ozone+and+asthma+emergency+department+visits+in+Saint+John,+New+Brunswick,+Canada.">Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada.</a> Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).</li><li>Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone+modifies+the+metabolic+and+endocrine+response+to+glucose:+Reproduction+of+effects+with+the+stress+hormone+corticosterone.">Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).</li><li>Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+low-dose+ozone-induced+murine+acute+lung+injury.">Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).</li><li>Aulakh, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+regional+murine+ozone-induced+lung+inflammation+using+[18F]F-FDG+microPET/CT+imaging.">Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).</li><li>Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+responses+to+secondary+endotoxin+challenge+in+rats+exposed+to+pig+barn+air.">Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air.</a> Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, 24 (2008).</li><li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation.">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li><li>Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+intranasal+instillations+in+mice:+effects+of+volume,+time,+body+position,+and+anesthesia.">Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).</li><li>Aulakh, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+CD34+produces+defects+in+platelets,+microparticles,+and+lung+inflammation.">Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation.</a> Cell Tissue Research. , (2020).</li><li>Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+and+recovery+of+the+alveolar+macrophage+phagocytic+system+during+continuous+exposure+to+0.5+ppm+ozone.">Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone.</a> Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).</li><li>Yipp, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lung+is+a+Host+Defense+Niche+for+Immediate+Neutrophil-Mediated+Vascular+Protection.">The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection.</a> Science Immunology. 2 (10), (2017).</li><li>Lee, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiostatin+regulates+the+expression+of+antiangiogenic+and+proapoptotic+pathways+via+targeted+inhibition+of+mitochondrial+proteins.">Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins.</a> Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).</li><li>Hawkins, C. L., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+identification,+and+quantification+of+oxidative+protein+modifications.">Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).</li><li>Hemming, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Pollutant+Ozone+Causes+Damage+to+Lung+Surfactant+Protein+B+(SP-B).">Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B).</a> Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).</li><li>Oosting, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+surfactant+protein+A+to+ozone+in+vitro+and+in+vivo+impairs+its+interactions+with+alveolar+cells.">Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells.</a> American Journal of Physiology. 262 (1), 63-68 (1992).</li><li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+necrotic+neutrophils+release+interleukin-16C+and+macrophage+migration+inhibitory+factor+from+stores+in+the+cytosol.">Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol.</a> Cell Death &amp; Discovery. 1, 15056 (2015).</li><li>Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+CXCR4+in+Normal+and+Abnormal+Development.">Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development.</a> Cells. 8 (2), (2019).</li><li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrapulmonary+manifestations+of+COVID-19.">Extrapulmonary manifestations of COVID-19.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).</li><li>Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).</li><li>Aulakh, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+image+x-radiography+for+functional+lung+imaging.">Multiple image x-radiography for functional lung imaging.</a> Physics in Medicine &amp; Biology. 63 (1), 015009 (2018).</li></ol>

השיטות המוצגות במחקר הנוכחי מדגישות את התועלת של ניתוח תאים מרובים כדי לחקור אירועים תאיים מרובים במהלך דלקת ריאות. סיכמנו את הממצאים בטבלה 2. אנחנו ומעבדות רבות חקרנו בהרחבה את התגובה המורינית להטמעת LPS תוך-ענפית, המאופיינת בגיוס מהיר של נויטרופילים לריאות, אשר מגיע לשיאו בין 6-24 ...

פגיעה חריפה בריאות (ALI) היא תגובה פתולוגית מכרעת של ריאות לגירויים זיהומיים או מזיקים אחרים אשר מסומן על ידי הפעלה בו זמנית של מערכת חיסונית קרישה, fibrinolytic ו מולד1. נויטרופילים חשים מיד דפוסי נזק מיקרוביאליים, כמו גם תאיים דרך משפחת קולטן דמוי אגרה (TLR)2,3,4. נויטרופילים משחררים ציטוקינים מעוצבים מראש ותכולת גרגירים ציטוטוקסית, אשר לאחר מכן יכול לגרום נזק לרקמות משניות. הנזק מכתש שלאחר מכן הוא נפגם עם מוות תאי משני המוביל לשחרור של מולקולות כגון אדנוזין טריפוספט (ATP)5, ובכך להגדיר במחזור קסמים של dysregulation החיסון.
בעיה בלתי פתורה בהבנת עלי נוגעת לשאלה כיצד הפציעה מתחילה בתוך קרום מכתסם. קומפלקס הובלת האלקטרונים V, F1F0 ATP סינתאז, הוא חלבון מיטוכונדריאלי הידוע להתבטא בכל מקום, על התא (כולל אנדותל, לויקוציטים, אפיתל) קרום פלזמה במהלך דלקת. ציטוסקלטון התא אשר מורכב actin ו tubulin, מטפח צורת תאים רבים ותפקוד אפנון, כמו גם חלבונים מיטוכונדריאליים, בהתאמה. לאחרונה הראינו כי המצור של סינתאז ATP על ידי מולקולה אנדוגנית, אנגיוסטין, משתיק גיוס נויטרופילים, הפעלה lipopolysaccharide (LPS) הנגרמת דלקת ריאות6. לכן, הן ביוכימי (ATP סינתאז) והן מנגנוני החיסון (TLR4) עשויים לווסת את מחסום מכתש במהלך דלקת ריאות.
חשיפה לאוזון (O3), מזהם סביבתי, פוגע בתפקוד הריאות, מגביר את הרגישות לזיהומים ריאתיים, ורמות נמוכות קצרות של חשיפות O3 מגבירות את הסיכון לתמותה אצל אלה עם תנאים קרדיו-ריזפירטוריים בסיסיים7,8,9,10,11,12,13,14. לכן, חשיפה לריכוזים רלוונטייםמבחינה פיזיולוגית של O 3 מספק מודל משמעותי של ALI ללמוד מנגנונים בסיסיים של דלקת7,8. המעבדה שלנו הקימה לאחרונה מודל מורין של Oבמינון נמוך 3 המושרה ALI15. לאחר ביצוע מינון וזמן תגובה לריכוזים נמוכים O3, ראינו כי חשיפה 0.05 עמודים לדקה O3 עבור 2 שעות, גורם לפגיעה ריאות חריפה המסומנת על ידי ריאות ATP סינתאז קומפלקס V subunit β (ATPβ) וביטוי אנגיוסטטין, בדומה לדגם LPS. הדמיית ריאות תוך-וורידית גילתה חוסר ארגון של מיקרופילמנטים מכתש המעידים על נזק לריאות, אבלציה של מינים תגובתיים מחמצת מכתשית (ROS) רמות (המציין ביטול של איתות תאים בסיסי) ופוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (המציין מוות תאי חריף) לאחר 2 h חשיפה 0.05 עמודים לדקה O315 אשר בקורלציה עם ריאה הטרוגנית 18שימור FDG16, גיוס נויטרופילים ושחרור ציטוקינים, בעיקר IL-16 ו SDF-1α. המסר לקחת הביתה מהמחקרים האחרונים שלנו הוא כי O3 מייצר רעילות גבוהה אקספוננציאלית כאשר נחשף בריכוזים מתחת לגבולות המותרים של 0.063 עמודים לדקה מעל 8 שעות (ליום) לחשיפה אנושית. חשוב לציין, אין הבנה ברורה על האם אלה תת קליני O3 חשיפות יכול לווסת מנגנונים בתיווך TLR4 כגון על ידי אנדוטוקסין חיידקי17. לכן, חקרנו מודל חשיפה O3 ו- LPS כפול וראינו את ההתאמות התאיות החיסוניות והלא חיסוניות.
אנו מתארים ניתוח מיקרוסקופי פלואורסצנטי מקיף של תאי ריאות ותאי גוף מערכתיים שונים, כלומר נוזל שטיפת ברונכו-מכתש (כלומר, BAL) אשר מדגם את החללים מכתשיים, כלי הדם הריאה perfusate (כלומר, LVP) כי דגימות כלי הדם ריאתי ואת interstitium מחיצה מכתשי במקרה של מחסום אנדותל בסכנה, קריוסקציות ריאות שמאל, להסתכל לתוך לויקוציטים parenchymal תושב חסידים שנותרו ברקמת הריאה שטיפת דם היקפי המייצג את הלויקוציטים במחזור ואת מח העצם ועצם הירך perfusates כי מדגם את האתרים הפרוקסימליים והדיסטליים של גיוס תאים hematopoietic במהלך דלקת, בהתאמה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>33-plex Bioplex chemokine panel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12002231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO CS (11506188)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 conjugated phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555 conjugated mouse anti-&#945; tubulin clone DM1A</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-829X-555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 J Mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>aliquot in 2 &#181;l stocks and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent wide field microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Narketan)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>100 mg/ml</td>
			<td>Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ATP5&#946; IgG2b (clone 3D5AB1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16-5941-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660 nm protein assay</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>22660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-6093-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-5698-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16-9668-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>53-5931-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced mitotracker orange</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Rompun)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>20 mg/ml</td>
			<td>Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing lung cellular adaptations during combined ozone and lps induced murine acute lung injury

הריאות מתמודדות ללא הרף עם עלבונות ישירים ועקיפים בצורה של סטרילי (חלקיקים או רעלנים תגובתי) ומצבים דלקתיים זיהומיות (חיידקיות, ויראליות או פטרייתיות). תגובה מארחת מוחצת עלולה לגרום לנשימה נפגעת ופגיעה חריפה בריאות, המאופיינת בגיוס נויטרופילים לריאות כתוצאה מתגובת החיסון, הקרישה ושיפוץ הרקמות של המארח הפתולוגי. שיטות מיקרוסקופיות רגישות כדי לדמיין ולכמת התאמות תאיות ריאות מורין, בתגובה למינון נמוך (0.05 עמודים לדקה) אוזון, מזהם סביבתי רב עוצמה בשילוב עם lipopolysaccharide חיידקי, אגוניסט TLR4, הם חיוניים כדי להבין את המארח דלקתי ומנגנוני תיקון. אנו מתארים ניתוח מיקרוסקופי פלואורסצנטי מקיף של תאי ריאות ותאי גוף מערכתיים שונים, כלומר נוזל שטיפת הברונכו-מכתשים, זלוף כלי הדם בריאה, קריוסקציות ריאות שמאליות ומח עצם החזה מחלחל. אנו מראים נזק של מקרופאגים מכתשיים, נויטרופילים, רקמת פרמנצ'ימלית ריאות, כמו גם תאי מח עצם בקורלציה עם תגובה חיסונית מושהית (עד 36-72 שעות) המאופיינת על ידי שיפוע כימוקין דיסקרטי בתאים המנותחים. בנוסף, אנו מציגים מטריצה חוץ תאית ריאות ואינטראקציות ציטוסקטליות תאיות (אקטין, טובולין), מיני חמצן מיטוכונדריאליים ומגיבים, פלסמינוגן אנטי-קרישה, אנגיוסטין שבר פפטיד אנטי אנגיוגני שלה, ATP מיטוכונדריאלי קומפלקס V subunits, α β. סמנים פונדקאיים אלה, כאשר בתוספת מבחנים מבוססי תאים במבחנה נאותה וטכניקות הדמיה של בעלי חיים vivo כגון מיקרוסקופיה תוך חיים, יכול לספק מידע חיוני לקראת הבנת תגובת הריאות לסוכנים immunomodulatory הרומן.

חשיפה משולבת O3 ו- LPS מובילה לדלקת מערכתית וגיוס מח עצם במהירות של 72 שעות: ספירת תאים בתאים שונים חשפה שינויים משמעותיים בדם ההיקפי וספירת תאי מח העצם בסך הכל על חשיפות משולבות של O3 ו- LPS. למרות שחשיפות משולבות של O3 ו- LPS לא גורם לשינויים בספיר...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury at JoVE.com

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

אוזון משולב ועכברים חשופים אנדוטוקסין חיידקי מראים מוות תאי נרחב, כולל זה של נויטרופילים. ראינו התאמות תאיות כגון שיבוש של lamellipodia ציטוסלטל, ביטוי תאי מוגבר של subunit סינתאז V ATP מורכב β ואנגיוסטין בשטיפת ברונכו-מכתשית, דיכוי התגובה החיסונית ריאות וגיוס נויטרופילים מעוכבים.

הדמיה של התאמות תאיות ריאות במהלך אוזון משולב ו- LPS המושרה פגיעה ריאות חריפה מורין

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

היי, קוראים לי גורפרט. המעבדה שלנו חוקרת מנגנונים של דלקת ריאות ותיקון. היי, שמי ג'סיקה ואני חוקרים חולדת מעבדה הנגרמת על ידי אוזון באלבולי באמצעות שיטות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות.שלום לכולם, קוראים לי מנטרה. ואני חוקר דלקת ריאות בשיטות הדמיה של בעלי חיים. ריאות מתמודדות ללא הרף עם עלבונות ישירים ועקיפים, הנובעים סטרילי, כגון אוזון, ורכיבים מיקרוביאליים, כגון lipopolysaccharide חיידקי או LPS.תגובה מארחת מוחצת עלולה לגרום לנשימה נפגעת ופגיעה חריפה בריאות המאופיינת בגיוס נויטרופילים לריאות, עקב חיסון מארח לא מוסדר, קרישה ושיפוץ רקמות. אנו מתארים ניתוח מקיף של תאים שונים, כלומר נוזל שטיפת ברונכו-מכתש, כלומר BAL, כלי הדם בריאה perfusate, כלומר LVP, קטעי קריו ריאות שמאל, דם היקפי ומח העצם ועצם הירך. לחשיפות לאוזון, הניחו בעדינות עכברים בתיבת האינדוקציה המותאמת אישית וחשפו את העכברים ללא הרף ל-0.05 עמודים לדקה של אוזון למשך שעתיים.לחשיפות LPS, הרדמה את העכברים תחת קטמין תוך-פיוריטונלי קל ותערובת קסילאזין. עכשיו להחדיר 50 microliters את הפתרון LPS לתוך nares החיצוני עכברים. להחדיר עכברי בקרה עם 50 מיקרוליטרים של מלוחים סטריליים.בנקודות זמן שצוינו, הרדמה את העכברים עם המינון המלא של קטמין ותערובת xylazine. לאחר מכן לחטא את העכברים ולבדוק רפלקסים הדוושה, כלומר לצבוט אחת מספרות הגפיים האחוריות, ולבחון נסיגה של האיבר. שום רפלקס לא אומר הרדמה עמוקה.עכשיו לעשות חתך מתחת לעצם החזה ולחשוף את הלב. מניחים מחט 25 מד מחובר מזרק הפריניזציה לתוך החדר הימני ולמשוך דם על ידי ניקוב לב. לאסוף את הדם במזרקים heparinized ולנקז בצינורות microfuge לעיבוד נוסף.יש להשתמש בזהירות בפינצטה או במלקחיים קהים כדי לפנות את אזור קנה הנשימה מרקמה מוגזמת. עכשיו תחתוך דרך כלוב הצלעות כדי לחשוף את הריאות. מעבירים קשירה מכותנה מתחת לקנה הנשימה, ומשאירים אותה כך לעת עתה.לצלוח את קנה הנשימה, במרווחים של כשליש מאורכו מן הריאות לקנה הנשימה. הכנס קנולה פוליאתילן 28 מד לתוך קנה הנשימה. לקשור בחוזקה את קשירה כותנה להחזיק את הצינורית במקום.תוודא שלא תמוטט את הצינורית. עכשיו בהדרגה להזריק 0.5 מ"ל של PBS לתוך הצינורית בעזרת מזרק mL אחד. לאחר הזרקת PBS לשאוף את המזרק כל עוד זה לא להתנגד היניקה.לאסוף את הנוזל שאפתן בצינור microphage שכותרתו, ולחזור על הליך זה פעמיים נוספות. חותכים את העורקים החזיים היורדים במיקום שבין חצאי בית החזה והבטן כדי למנוע גיבוי במהלך זלוף ריאות. כתם את החלל ליד קצה אב העורקים לחתוך ללא דם.הבא לחלחל הריאות עם 0.5 מיליליטר של תמיסת מלח heparinized טמפרטורת החדר, להזריק אותו דרך החדר הימני. לאסוף את כלי הדם לחלחל מן החלל בקצה החתך של אב העורקים יורד. לאחר קשירת הסימפונות הימנית, תן לריאה השמאלית לנפח עם 0.5 מיליליטר של paraformaldehyde במשך חמש דקות.עכשיו לחטא את חלק הבטן. חותכים את חלק הבטן ואת deskin אותו מעצם האגן. לאסוף את עצם האגן ולבודד את עצמות עצם הירך השמאלית והימנית בצלחת פטרי מלא מלוחים כל הזמן על קרח.לאסוף את כלוב צלעות הגחון ועצם החזה לתוך צלחת פטרי מלא מלוחים, אשר נשמר גם על קרח. לחלחל את הקצוות החתוכים של העצמות עם ארבע פעמים עם 0.5 מיליליטר של מלוחים באמצעות מחטים מצויד היטב על 1 מזרקים ML. לאסוף את השברים מכל עצם לתוך צינורות פלקון שכותרתו, מצויד במסננים והניח על קרח.צנטריפוגה כל הדגימות במשך 10 דקות ב 3000 סל"ד. לאסוף את supernatants פלאש להקפיא אותם. לשקם את התאים במינימום של 200 מיקרוליטרים של PBS.בצע ספירות לויקוציטים כוללות. הכתים נוזל נוסף של BAL עם תערובת של ירוק קלצ'ין ואתידיום הומודימר אדום כתם אחד. לנתח את supernatant עבור כימוקינים וריכוז החלבון הכולל.צנטריפוגה התאים להכין שני ציטוספין על כל שקופית וכתם עבור חלבונים ביוכימיים ומערכת החיסון. בצע כתמי H ו- E ששונו על קריוסקציות ריאות לכל הקבוצות. חלוקה ידנית לרמות של 150 עד 200 תאים בחלונית התמונה הממוזגת.העתק את אזורי העניין המתוארים לכל הערוצים. מדדו את הפרמטרים המוגדרים מראש לכל הערוצים. חלק את עוצמת הפלואורסצנט של המולקולה המוכתמת על-ידי זו של DAPI או CD61.אלה נקראים יחסי עוצמת פלואורסצנטיות מנורמלים של DAPI או CD 61. הבא להתוות את הפרמטרים כדי להעריך את כל השינויים לאחר החשיפה. אמנם, חשיפות משולבות לא לגרום לשינויים בספירת תאי מח העצם BAL, LVP או עצם החזה הכולל, העכברים הציגו לויקוציטוזיס מערכתי ב 24 שעות, אשר ואחריו לויקופניה ב 72 שעות לאחר החשיפה.אלה מוצגים בספירת תאי הדם ההיקפיים. ספירת תאי מח העצם בעצם הירך מראה את העלייה המאוחרת ב-72 שעות בהשוואה לכל נקודות הזמן. אנא שימו לב להיעדרם של כתמי סיגלק-F ו-CX3CRI בתאי פולימורפונוקלאריים בשעה 24 שעות בתמונה של ציטוספין BAL.CYTOSpins BAL ו- LVP הראו נוכחות של תאים חד-גרעיניים CD11b ו- GR1 חיוביים באפס שעות. תאים פולימורפוניקלאריים המוצגים כסוג תא דומיננטי בכל התאים לאחר החשיפה. תכולת החלבון הכוללת של BAL הייתה הגבוהה ביותר ב-36 שעות לאחר החשיפה המשולבת.עם זאת, חלבון LVP לא השתנה לאחר החשיפה. רמות האאוטקסין-2 והאינטרלוקין-2 היו הגבוהות ביותר בארבע השעות ב-LVP. כימוקינים אלה הופחתו בשבר BAL.באופן מעניין, הנויטרופילים המדאיגים IL-16 וכימוקינים מולדים רבים שונו ב- LVP, אך לא בשבר BAL. בבסיס יותר מ 95% של תאי BAL היו מונו גרעיני מראה אקטין קליפת המוח, lamellipodia, מתח סיבי טובולין, והם היו חיוביים מאוד עבור כתמים mitotracker מופחת. בארבע שעות, הבחנו בתאי BAL עגולים, שאיבדו אקטין, אך הראו רשת microtubule פרושה כפי שמוצג בכתם מיטוטרקר מופחת אדום ונמוך יותר.מוקדם לאחר החשיפה המשולבת, תאי BAL הופיעו חיובי כפול עבור calcein ואתידיום homodimer-1, אשר מציין תאים בסכנה חלקית. ב 36 שעות, תאי BAL היו קיימא במידה רבה, כלומר ירוק. ראינו כתמי ATP אלפא ו-Ly6G נפרדים במקרופאגים מכתשים BAL, ונויטרופילים.ראינו ירידה ב-DAPI מנורמל ATP אלפא ועלייה בתכולת חלבון Ly6G תאית. החשיפות המשולבות המושרות ביטויים חולפים של Bal, תא רוצח טבעי K1.1, ATP נויטרופילים, תת יחידה PETA, גורם התפשטות, Ki-67 וביטויים מתמשכים של GR1 נויטרופילים, טסיות CX3CRI וחלבון אנגיוסטין אנטי אנגיוגני בתאי BAL לאחר החשיפה. למרות נזקי מחיצה ברונכיולר מכתשי היה צפוי, זה היה מפתיע לראות אגרגטים הסלולר בכלי גדול יותר ב 36 שעות לאחר החשיפה.לבסוף, יש לנו תוצאות מסכמות בטבלה זו. אנו מקווים כי מודל המורין שלנו משמש אב טיפוס נגיש בקלות שניתן לשחזר במעבדות בלימה ברמה 2 לחקר המנגנונים של מוות תאי פולשני וזיהומים. תודה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

מאוד מרבב, סופר ברזולוציה הדמיה של תאים T באמצעות madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

הערכת ציטוטוקסיות ואפקטים Immunomodulatory של חומרים אמבריולוגיה דיוק-לחתוך פרוסות

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

ריאות microRNA פרופיל לרוחב ייחום בעכברים החשופים אוזון

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

אינדוקציה של פגיעה בריאות העכבר על ידי הזרקת אנדוקנה של ליאומיצין

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

עיצוב של הIntranasal וניקוב, מודל כפול של דיכוי חיסוני מושרה באלח דם

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

A Model of Self-limited Acute Lung Injury by Unilateral Intra-bronchial Acid Instillation

מודל של פגיעה עצמית מוגבלת בריאה חריפה על ידי ברונכיט חד צדדית של חומצה בסימפונות

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...