Name: visualizing lung cellular adaptations during combined ozone and lps induced murine acute lung injury
Uploaded: 2021-03-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury at JoVE.com

Den forskning som bedrivs finansieras av presidentens NSERC-anslag samt startfonder från Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation. Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation finansieras av Innovation Saskatchewan. Fluorescensavbildning utfördes vid WCVM Imaging Centre, som finansieras av NSERC. Jessica Brocos (MSc Student) och Manpreet Kaur (MSc Student) finansierades av start-up-medlen från Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation.

Studiens design godkändes av University of Saskatchewan's Animal Research Ethics Board och följde Canadian Council on Animal Care riktlinjer för humant djurbruk. Sex-åtta veckor gamla manliga C57BL/6J möss upphandlades. OBS: Avliva djur som utvecklar svår slöhet, andningsbesvär eller andra tecken på allvarlig nöd före planerad slutpunkt.
OBS: Förbered följande: 27-18 G nål trubbig (beror på musens trakealdiameter), lämpligt storlek PE-slangar för att passa den trubbiga nålen ...

<ol>
	<li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury.">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).</li><li>Aulakh, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+lung:+"the+first+responders".">Neutrophils in the lung: "the first responders".</a> Cell Tissue Research. , (2017).</li><li>Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiostatin+inhibits+acute+lung+injury+in+a+mouse+model.">Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).</li><li>Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+9+partially+regulates+lung+inflammation+induced+following+exposure+to+chicken+barn+air.">Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air.</a> Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).</li><li>Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+mediates+the+late+phase+of+neutrophil+recruitment+to+the+lung+in+murine+models+of+acute+lung+injury.">Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).</li><li>Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiostatin+inhibits+activation+and+migration+of+neutrophils.">Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils.</a> Cell Tissue Research. , (2013).</li><li>Cakmak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+long-term+PM2.5+and+ozone+exposure+and+mortality+in+the+Canadian+Census+Health+and+Environment+Cohort+(CANCHEC),+by+spatial+synoptic+classification+zone.">Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone.</a> Environment International. 111, 200-211 (2018).</li><li>Dauchet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+exposure+to+air+pollution:+Associations+with+lung+function+and+inflammatory+markers+in+non-smoking,+healthy+adults.">Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults.</a> Environment International. 121, 610-619 (2018).</li><li>Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+air+pollution+on+emergency+room+visits+for+respiratory+illnesses+in+Montreal,+Quebec.">Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).</li><li>Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ozone+on+leukocyte+function+in+exposed+human+subjects.">Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects.</a> Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).</li><li>Rush, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+chronic+exposure+to+air+pollution+and+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome.">Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).</li><li>Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Chronic+Ozone+and+Particulate+Air+Pollution+on+Mortality+in+Patients+With+Sepsis+Across+the+United+States.">The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States.</a> Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).</li><li>Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+ozone+and+asthma+emergency+department+visits+in+Saint+John,+New+Brunswick,+Canada.">Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada.</a> Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).</li><li>Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone+modifies+the+metabolic+and+endocrine+response+to+glucose:+Reproduction+of+effects+with+the+stress+hormone+corticosterone.">Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).</li><li>Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+low-dose+ozone-induced+murine+acute+lung+injury.">Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).</li><li>Aulakh, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+regional+murine+ozone-induced+lung+inflammation+using+[18F]F-FDG+microPET/CT+imaging.">Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).</li><li>Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+responses+to+secondary+endotoxin+challenge+in+rats+exposed+to+pig+barn+air.">Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air.</a> Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, 24 (2008).</li><li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation.">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li><li>Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+intranasal+instillations+in+mice:+effects+of+volume,+time,+body+position,+and+anesthesia.">Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).</li><li>Aulakh, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+CD34+produces+defects+in+platelets,+microparticles,+and+lung+inflammation.">Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation.</a> Cell Tissue Research. , (2020).</li><li>Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+and+recovery+of+the+alveolar+macrophage+phagocytic+system+during+continuous+exposure+to+0.5+ppm+ozone.">Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone.</a> Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).</li><li>Yipp, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lung+is+a+Host+Defense+Niche+for+Immediate+Neutrophil-Mediated+Vascular+Protection.">The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection.</a> Science Immunology. 2 (10), (2017).</li><li>Lee, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiostatin+regulates+the+expression+of+antiangiogenic+and+proapoptotic+pathways+via+targeted+inhibition+of+mitochondrial+proteins.">Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins.</a> Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).</li><li>Hawkins, C. L., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+identification,+and+quantification+of+oxidative+protein+modifications.">Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).</li><li>Hemming, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Pollutant+Ozone+Causes+Damage+to+Lung+Surfactant+Protein+B+(SP-B).">Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B).</a> Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).</li><li>Oosting, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+surfactant+protein+A+to+ozone+in+vitro+and+in+vivo+impairs+its+interactions+with+alveolar+cells.">Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells.</a> American Journal of Physiology. 262 (1), 63-68 (1992).</li><li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+necrotic+neutrophils+release+interleukin-16C+and+macrophage+migration+inhibitory+factor+from+stores+in+the+cytosol.">Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol.</a> Cell Death &amp; Discovery. 1, 15056 (2015).</li><li>Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+CXCR4+in+Normal+and+Abnormal+Development.">Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development.</a> Cells. 8 (2), (2019).</li><li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrapulmonary+manifestations+of+COVID-19.">Extrapulmonary manifestations of COVID-19.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).</li><li>Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).</li><li>Aulakh, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+image+x-radiography+for+functional+lung+imaging.">Multiple image x-radiography for functional lung imaging.</a> Physics in Medicine &amp; Biology. 63 (1), 015009 (2018).</li></ol>

De metoder som presenteras i den aktuella studien belyser nyttan av multipel fackanalys för att studera flera cellulära händelser under lunginflammation. Vi har sammanfattat resultaten i tabell 2. Vi och många laboratorier har studerat murinsvaret på intranasal LPS-instillation, vilket kännetecknas av snabb rekrytering av lung neutrofiler, som toppar mellan 6-24 h varefter upplösningen sparkar in. Och nyligen har vi visat att subkliniska O3 (vid 0,05 ppm för 2 h) ensam kan inducera bet...

Akut lungskada (ALI) är ett avgörande patologiskt svar från lungor på infektiösa eller andra skadliga stimuli som kännetecknas av samtidig aktivering av koagulerings-, fibrinolytiska och medfödda immunsystem1. Neutrofiler känner omedelbart av mikrobiella såväl som intracellulära skademönster genom den tollliknande receptorn (TLR)familjen 2,3,4. Neutrofiler frigör förformade cytokiner och cytotoxiskt granulatinnehåll, vilket sedan kan orsaka skador på vävnaden. Den efterföljande alveolära skadan är kantad med sekundär celldöd som leder till frisättning av molekyler som adenosin triphosphate (ATP)5, vilket sätter in en ond cirkel av immun-dysregulation.
Ett olöst problem i förståelsen av ALI gäller frågan om hur skadan initieras inom alveolarmembranet. Elektrontransportkomplexet V, F1F0 ATP-syntas, är ett mitokondriellt protein som är känt för att uttryckas allestädes närvarande, på cell (inklusive endotel, leukocyt, epitelialt) plasmamembran under inflammation. Cellcytoskeletonen som består av aktin och tubulin, har många cellforms- och funktionsmodulerande samt mitokondriella proteiner. Vi har nyligen visat att blockad av ATP-syntasen av en endogen molekyl, angiostatin, tystar neutrofilrekrytering, aktivering och lipopolysackarid (LPS) inducerad lunginflammation6. Således kan både biokemiska (ATP-syntas) och immunmekanismer (TLR4) reglera alveolärbarriären under lunginflammation.
Exponering för ozon (O3),en miljöförorening, försämrar lungfunktionen, ökar mottagligheten för lunginfektioner, och korta låga nivåer av O3-exponeringar ökar risken för dödlighet hos personer med underliggande kardiorespiratoriskatillstånd 7,8,9,10,11,12,13,14. Exponering för fysiologiskt relevanta koncentrationer av O3 ger således en meningsfull modell av ALI för att studera grundläggande mekanismer för inflammation7,8. Vårt labb har nyligen etablerat en murinmodell av låg dos O3 inducerad ALI15. Efter att ha utfört en dos och tidssvar på låga O3 koncentrationer observerade vi att exponering för 0,05 ppm O3 för 2 h inducerar akut lungskada som kännetecknas av lunga ATP syntas komplexa V underavdelning β (ATPβ) och angiostatin uttryck, liknar LPS modellen. Intravital lung imaging visade disorganization av alveolar aktin mikrofilament som anger lungskador, och ablation av alveolära septala reaktiva syrearter (ROS) nivåer (som indikerar överföring av baslinjecellsignalering) och mitokondriell membranpotential (som indikerar akut celldöd) efter 2 h exponering för 0, 05 ppm O315 som korrelerade med en heterogen lunga 18FDG retention16, neutrofil rekrytering och cytokinfrisättning, framför allt IL-16 och SDF-1α. Budskapet från våra senaste studier är att O 3 producerar exponentiellt högtoxicitet när den exponeras vid koncentrationer under de tillåtna gränserna på 0,063 ppm över 8 timmar (per dag) för mänsklig exponering. Det är viktigt att det inte finns någon klar förståelse för om dessa subkliniska O3-exponeringar kan modulera TLR4-medierade mekanismer såsom genom bakteriellt endotoxin17. Således studerade vi en dubbel-hit O3 och LPS exponering modell och observerade immun och icke-immun cellulära anpassningar.
Vi beskriver en omfattande fluorescerande mikroskopisk analys av olika lung- och systemiska kroppsutrymmen, nämligen broncho-alveolär lavagevätska (dvs. BAL) som tar prov på de alveolära utrymmena, lungvaskulärt perfusat (dvs. LVP) som tar prov på lungvaskulaturen och det alveolära septala interstitiumet i händelse av en komprometterad endotelbarriär, vänster lung cryosections, för att undersöka bosatta parenkymala och vidhäftande leukocyter kvar i den lavaged lungvävnaden , perifert blod som representerar de cirkulerande leukocyterna och sternal- och lårbensmärgper som provar de proximala och distala platserna för hematopoetisk cellmobilisering under inflammation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>33-plex Bioplex chemokine panel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12002231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO CS (11506188)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 conjugated phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555 conjugated mouse anti-&#945; tubulin clone DM1A</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-829X-555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 J Mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>aliquot in 2 &#181;l stocks and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent wide field microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Narketan)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>100 mg/ml</td>
			<td>Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ATP5&#946; IgG2b (clone 3D5AB1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16-5941-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660 nm protein assay</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>22660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-6093-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-5698-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16-9668-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>53-5931-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced mitotracker orange</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Rompun)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>20 mg/ml</td>
			<td>Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing lung cellular adaptations during combined ozone and lps induced murine acute lung injury

Lungor står ständigt inför direkta och indirekta förolämpningar i form av sterila (partiklar eller reaktiva toxiner) och infektiösa (bakteriella, virala eller svamp) inflammatoriska tillstånd. En överväldigande värd svar kan resultera i komprometterad andning och akut lungskada, som kännetecknas av lung neutrophil rekrytering som ett resultat av pato-logiska värd immun, koagulativ och vävnad remodeling svar. Känsliga mikroskopiska metoder för att visualisera och kvantifiera cellulära anpassningar av murin lungor, som svar på ozon med låg dos (0,05 ppm), en potent miljöförorening i kombination med bakteriell lipopolysackarid, en TLR4-agonist, är avgörande för att förstå värdens inflammatoriska mekanismer och reparationsmekanismer. Vi beskriver en omfattande fluorescerande mikroskopisk analys av olika lungor och systemiska kroppsfack, nämligen broncho-alveolar lavage vätska, lung vaskulär perfusate, vänster lung cryosections och sternal benmärg perfusate. Vi visar skador på alveolära makrofager, neutrofiler, lungparenkymal vävnad, liksom benmärgsceller i samband med ett fördröjt (upp till 36-72 h) immunsvar som kännetecknas av diskreta kemokingradienter i de analyserade facken. Dessutom presenterar vi lungextracellulära matris och cellulära cytoskeletala interaktioner (aktin, tubulin), mitokondriell och reaktiv syre art, anti-koagulativ plasminogen, dess anti-angiogenic peptid fragment angiostatin, mitokondriell ATP syntas komplexa V underenheter, α och β. Dessa surrogatmarkörer, när de kompletteras med adekvata in vitro-cellbaserade analyser och in vivo-djuravbildningstekniker som intravital mikroskopi, kan ge viktig information för att förstå lungsvaret på nya immunmodulerande medel.

Kombinerad O3- och LPS- exponering leder till systemisk inflammation och benmärgsmobilisering vid 72 h: Cellantal i olika fack visade betydande förändringar i perifert blod och lårbensmärgens totala cellantal vid kombinerade O3- och LPS- exponeringar. Även om kombinerade O3- och LPS- exponeringar inte medförde några förändringar i det totala antalet balceller(figur 1A)eller LVP-celler (fi...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury at JoVE.com

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

Kombinerade ozon- och bakteriella endotoxinexponerade möss uppbar bred celldöd, inklusive neutrofiler. Vi observerade cellulära anpassningar såsom störningar av cytoskeletal lamellipodia, ökat cellulära uttryck av komplexa V ATP syntas underavdelning β och angiostatin i broncho-alveolar lavage, undertryckande av lung immun svar och fördröjd neutrophil rekrytering.

Visualisera lungcellsanpassningar under kombinerad ozon- och LPS-inducerad murin akut lungskada

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

Hej, jag heter Gurpreet. Vårt labb undersöker mekanismer för lunginflammation och reparation. Hej, jag heter Jessica och undersöker ozoninducerade labråtta alveoli med fluorescerande mikroskopiska metoder.Hej allihopa, jag heter Manpreet. Och jag studerar lunginflammation med djuravbildningsmetoder. Lungorna står ständigt inför direkta och indirekta förolämpningar till följd av sterila, såsom ozon, och mikrobiella komponenter, såsom bakteriell lipopolysackarid eller LPS.En överväldigande värd svar kan resultera i komprometterad andning och akut lungskada som kännetecknas av lung neutrophil rekrytering, på grund av oreglerade värd immun, koagulativ och vävnad remodeling. Vi beskriver en omfattande analys av olika fack, nämligen broncho-alveolar lavage vätska, det vill säga BAL, lung vaskulär perfusate, det vill säga LVP, vänster lung cryo avsnitt, perifert blod och sternal och lårben märg. För ozonexponeringar, placera försiktigt möss i den anpassade induktionslådan och exponera kontinuerligt mössen för 0,05 PPM ozon i två timmar.För LPS- exponeringar, bedöva mössen under lätt intraperitoneal ketamin och xylazinblandning. Nu ingjuter 50 mikroliter från LPS-lösningen i mössens yttre nares. Kontrollera möss med 50 mikroliter steril saltlösning.Vid angivna tidpunkter, bedöva mössen med hela dosen av ketamin och xylazinblandning. Nästa sanera mössen och kontrollera om det finns pedalreflexer, det vill säga nypa någon av bakbenssiffrorna och observera för tillbakadragning av lemmen. Ingen reflex betyder djupbedövning.Gör nu ett snitt under bröstbenet och exponera hjärtat. Placera en 25 gauge nål fäst vid hepariniserad spruta i rätt ventrikel och dra blod genom hjärtpunktion. Samla blodet i hepariniserade sprutor och dränera i mikrofugerör för vidare bearbetning.Använd försiktigt pincett eller trubbiga tång för att rensa bort luftstruperegionen från överytrande vävnad. Skär nu genom bröstkorgen för att exponera lungorna. Passera en bomullsligatur under luftstrupen och lämna den sådan för tillfället.Klipp luftstrupen, försald på ungefär en tredjedel av sin längd från lungorna för trakeostomi. Sätt in en 28 gauge polyeten cannula i luftstrupen. Knyt fast bomullsklaturen ordentligt för att hålla kanylen på plats.Se till att du inte kollapsar kanylen. Injicera nu gradvis 0,5 ml PBS i kanylen med hjälp av en en ml spruta. Efter att ha injicerat PBS aspirera ut sprutan så länge den inte motstår sugningen.Samla den insugna vätskan i ett märkt mikrofatrör och upprepa denna procedur ytterligare två gånger. Skär den fallande bröstaorta på platsen mellan bröst- och bukhalvorna för att undvika backup under lungperfusion. Fläcka hålrummet nära den skurna aortan utan blod.Därefter granska lungorna med 0,5 ML rumstemperatur hepariniserad saltlösning, injicera den genom rätt ventrikel. Samla vaskulär perfusate från håligheten vid den fallande bröstaortans snitt. Efter att ha ligatat de högra bronkerna, låt vänster lunga blåsa upp med 0,5 ML paraformaldehyd i fem minuter.Sanera nu bukdelen. Skär bukdelen och skrivbord i den från bäckenbenet. Samla bäckenbenet och isolera vänster och höger lårben i en saltlösning fylld petriskål som hålls på is.Samla ventral revbenskorgen och bröstbenet i en saltlösningsfylld Petri-skål, som också hålls på is. Granska benens skurna ändar med fyra gånger med 0,5 ML saltlösning med välmonterade nålar på 1 ML-sprutor. Samla fraktionerna från varje ben i märkta Falcon-rör, försedda med filter och placerade på is.Centrifug alla prover i 10 minuter vid 3000 RPM. Samla supernatanter och flash frysa dem. Rekonstruera cellerna i minst 200 mikroliter PBS.Utför totala antalet leukocyter. Färga en annan vätska av BAL med en blandning av calceingrön och den röda ethidium homodimer en fläck. Analysera supernatanten för kemokiner och total proteinkoncentration.Centrifugera cellerna för att förbereda två cytospiner på varje glidning och fläck för biokemiska och immunproteiner. Utför modifierad H- och E-färgning på lung cryosections för alla grupper. Disposition 150 till 200 celler manuellt på den kopplade bildpanelen.Kopiera de skisserade regioner som är av intresse till alla kanaler. Mät de förinställda parametrarna för alla kanaler. Dividera den fluorescerande intensiteten hos den färgade molekylen med DAPI eller CD61.Dessa kallas DAPI eller CD 61 normaliserade fluorescerande intensitetsförhållanden. Rita sedan parametrarna för att utvärdera eventuella förändringar efter exponering. Även om kombinerade exponeringar inte inducerar några förändringar i det totala antalet BAL- eller LVP- eller sternala benmärgsceller, uppvisade mössen systemisk leukocytos vid 24 timmar, vilket följdes av leukopeni 72 timmar efter exponering.Dessa visas i antalet perifera blodkroppar. Antalet lårbensmärgsceller visar den sena spiken vid 72 timmar jämfört med alla tidpunkter. Observera frånvaron av Siglec-F- och CX3CRI-färgning i polymorfonukleära celler vid 24 timmar i bilden av BAL cytospin.BAL och LVP cytospiner visade förekomst av stora CD11b och GR1 positiva mononuclear celler vid noll timmar. Polymorfonukleära celler presenteras som en dominerande celltyp i alla fack efter exponering. BAL totala proteinhalten var högst 36 timmar efter kombinerad exponering.LVP-proteinet var dock oförändrat efter exponering. Nivåerna av eotaxin-2 och interleukin-2 var högst vid de fyra timmarna i LVP. Dessa kemokiner minskades i BAL-fraktionen.Intressant nog ändrades neutrofil alarmerande IL-16 och många medfödda chemokiner i LVP, men inte BAL-fraktionen. Vid baslinjen var mer än 95% av BAL-cellerna mono nukleär visar när aktin, lamellipodia, stress och tubulin fibrer, och de var starkt positiva för minskad mitotracker färgning. Vid fyra timmar observerade vi cirkulära BAL-celler, som hade förlorat aktin, men visade en spridd ut microtubule nätverk som visas i röd och lägre minskad mitotracker färgning.Tidigt efter den kombinerade exponeringen verkade BAL-celler dubbelt positiva för calcein och ethidium homodimer-1, vilket indikerar delvis komprometterade celler. Vid 36 timmar var BAL-cellerna till stor del livskraftiga, det vill säga gröna. Vi observerade diskreta ATP alfa och Ly6G färgning i BAL alveolar makrofager och neutrophils.Vi observerade en minskning av DAPI normaliserade ATP alfa och en ökning av intracellulära Ly6G protein innehåll. De kombinerade exponeringarna inducerade övergående uttryck av Bal, naturlig mördarcell och K1.1, neutrofil ATP, underenhet PETA, spridningsfaktor, Ki-67 och ihållande uttryck av neutrofil GR1, trombocyt CX3CRI och anti-angiogenic angiostatin protein i BAL-celler efter exponering. Även om bronkiolar och alveolar septal skador förväntades, var det förvånande att observera cellulära aggregat i större fartyg 36 timmar efter exponering.Slutligen har vi sammanfattande resultat i den här tabellen. Vi hoppas att vår murinmodell fungerar som en lättillgänglig prototyp som kan reproduceras i nivå två inneslutningslaboratorier för att studera mekanismerna för invasiv celldöd och infektioner. Tack.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influensa viruspropagering i embryonerade hönsägg

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila yttre membranvesiklar: Isolering och analys av deras pro-inflammatoriska Potential på makrofager

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Mycket multiplexerad, superupplösning av T-celler med hjälp av madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisera makrofag extracellulära fällor med konfokalmikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Bedömning av den cytotoxiska och immunmodulerande effekter av ämnen i Human Precision-cut Lung skivor

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

Lungan mikroRNA profilering över the östruscykel i ozon-exponerade möss

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Induktion av mus lung skada genom endotrakeal injektion av bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Design av cecal ligation och punktering och intranasal infektion Dual Model av sepsis-inducerad immunsuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

A Model of Self-limited Acute Lung Injury by Unilateral Intra-bronchial Acid Instillation

En modell av självbegränsade akuta lung skador genom ensidig Intrabronkial syra instillation

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...