Name: reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

우리는 의견과 제안에 대한 Balázsi 실험실, 첫 번째 LPA를 구성하는 데 도움을 준 Karl P. Gerhardt 박사와 Jeffrey J. Tabor 박사, LOV2-degron 플라스미드를 공유 한 Wilfried Weber 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 [R35 GM122561 및 T32 GM008444]의 지원을 받았다. The Laufer Center for Physical and Quantitative Biology; 그리고 국방 과학 및 공학 대학원 (NDSEG) 펠로우십. 오픈 액세스 요금에 대한 자금 조달 : NIH [R35 GM122561].
저자 기여도 : M.T.G.와 G.B.가 프로젝트를 구상했습니다. M.T.G., D.C., L.G.는 실험을 수행했다. M.T.G., D..C., L.G., G.B.는 데이터를 분석하고 원고를 준비했습니다. G.B.와 M.T.G.는 프로젝트를 감독했습니다.

1. 유전자 회로 설계
<ol><li>단일 유전자 회로/플라스미드(예를 들어, 포유동물 DNA 통합 서열 모티프32, 광-반응성 요소33, 또는 기능적 유전자34)로 결합할 유전자 성분을 선택한다.</li>
	<li>임의의 유전 공학 및/또는 분자 클로닝 소프트웨어를 사용하여, 추후 사용 및 참조를 위해 DNA 서열을 저장하고, 각 서열에 주석을 달고, 필요한 모든 특징(예...

이 기사의 독자는 1) 유전자 회로 설계, 구축 및 검증을 포함하여 광유전학 유전자 회로 (및 다른 유전자 발현 시스템)를 특성화하는 데 필수적인 단계에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 2) 안정한 세포주 내로 유전자 회로를 도입하기 위한 세포 공학 (예를 들어, Flp-FRT 재조합); 3) LPA와 같은 광기반 플랫폼을 이용한 조작된 세포의 유도; 4) 형광 현미경을 통한 광 유도 분석의 초기 특성화; 및 5) 유?...

다른 공학 분야와 마찬가지로, 합성 생물학은 프로토콜을 표준화하는 것을 목표로하며, 재현성이 높은 기능을 가진 도구를 생물학적 시스템과 관련된 질문을 탐구하는 데 활용할 수 있도록합니다1,2. 많은 조절 시스템이 구축된 합성 생물학의 한 도메인은 유전자 발현 조절3,4의 영역이다. 유전자 발현 조절은 단백질 수준과 가변성 (잡음 또는 변동 계수, CV = σ / μ, 평균에 대한 표준 편차로 측정)을 모두 타겟팅 할 수 있으며, 이는 생리 학적 및 병리학 적 세포 상태에서의 역할로 인해 중요한 세포 특성입니다5,6,7,8. 단백질 수준과 소음4,9,10,11,12을 제어할 수 있는 많은 합성 시스템이 설계되어 여러 도구에서 프로토콜을 표준화할 수 있는 기회를 창출했습니다.
최근에 등장한 유전자 네트워크를 제어 할 수있는 새로운 도구 세트 중 하나는 광유전학으로, 빛을 사용하여 유전자 발현을 제어 할 수 있습니다13,14,15,16,17. 그들의 화학적 전임자들과 유사하게, 광유전학적 유전자 회로는 박테리아에서 포유동물에 이르기까지 모든 세포 유형에 도입될 수 있어, 관심있는 임의의 하류 유전자의 발현을 허용한다18,19. 그러나, 새로운 광유전학적 도구의 급속한 생성으로 인해, 유전 회로 아키텍처, 발현 메카니즘(예를 들어, 플라스미드 기반 대 바이러스 통합) 및 광공급 제어 장비11,16,20,21,22,23,24,25에서 다양한 시스템이 등장하였다. . 따라서 이것은 유전자 회로 구축 및 최적화, 시스템 활용 방법 (예 : 통합 대 일시적인 발현), 유도에 사용되는 실험 도구 및 결과 분석과 같은 광유전 적 기능의 표준화를위한 여지를 남겨 둡니다.
포유동물 세포에서 광유전학 프로토콜의 표준화에 대한 진전을 이루기 위해, 이 프로토콜은 HEK293 세포(인간 배아 신장 세포주)에 통합된 음성 피드백(NF) 유전자 회로를 사용하여 포유동물 세포에서 광유전학 시스템을 엔지니어링하기 위한 실험 파이프라인을 기술한다. NF는 자연 계26,27,28이 매우 풍부하기 때문에 표준화를 입증하기에 이상적인 시스템으로, 단백질 수준을 조정하고 노이즈를 최소화할 수 있습니다. 간단히 말해서, NF는 그 자신의 발현을 충분히 빠르게 감소시키는 리프레서에 의한 정밀한 유전자 발현 조절을 허용하여, 정상 상태로부터 떨어져 있는 임의의 변화를 제한한다. 정상 상태는 각 유도제 농도에 대해 새로운 정상 상태에 도달 할 때까지 더 많은 단백질 생산을 허용하기 위해 리프레서를 비활성화하거나 제거하는 유도제에 의해 변경 될 수 있습니다. 최근에, 유전자 발현의 넓은 동적 반응을 생성하고, 저잡음을 유지하며, 공간 유전자 발현 제어의 잠재력을 허용하는 광 자극에 반응할 수 있는 조작된 NF 광유전학 시스템이 생성되었다11. 광유도성 튜너(LITers)로 알려진 이 도구들은 살아있는 세포4,10,29,30에서 유전자 발현 조절을 허용하고 장기적인 유전자 발현 조절을 보장하기 위해 인간 세포주에 안정적으로 통합된 초기 시스템에서 영감을 얻었다.
여기서, LITer를 일례로 사용하여, 광반응성 유전자 회로를 생성하고, 광플레이트 장치(LPA, 광유전학적 유도 하드웨어)31로 유전자 발현을 유도하고, 맞춤형 광 자극에 대한 조작된, 광유전학적으로 제어가능한 세포주의 반응을 분석하기 위한 프로토콜이 개략적으로 요약된다. 이 프로토콜을 통해 사용자는 탐색하려는 모든 기능 유전자에 대해 LITer 도구를 활용할 수 있습니다. 또한 아래에 요약된 방법 및 광유전학 장비를 통합함으로써 다양한 회로 아키텍처(예를 들어, 포지티브 피드백, 네거티브 조절 등)를 갖는 다른 광유전학 시스템에 적응될 수 있다. 다른 합성 생물학 프로토콜과 유사하게, 여기에 요약된 비디오 기록 및 광유전학 프로토콜은 암 생물학, 배아 발달 및 조직 분화를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 분야의 단일 세포 연구에 적용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>reagent for carrying out PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>reagent for splitting &#38; harvesting mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>reagent for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628113</td>
			<td>equipment for mammalian culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>GR140-500</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foils for 96-well Plates</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>60941-126</td>
			<td>tool used for covering plates in light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td>reagent for selecting bacteria with correct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365PR</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140010</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRAria</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td>tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>649225</td>
			<td>tool for characterizing engineered cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Government Scientific Source</td>
			<td>SIGA4919-1G</td>
			<td>reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22628113</td>
			<td>instrument for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for carrying out IF reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T25 filter cap TC flask</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-4825</td>
			<td>container for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>reagent used for freezing down engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-585-011</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td>container for growing sorted monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software:</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>equipment for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-092</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10687-010</td>
			<td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td>reagent for converting RNA to cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -20 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76210-392</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U74VC</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Refrigerator +4 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76359-220</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-250G</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 3000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2019</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for analyzing experimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413775000</td>
			<td>reagent for immunofluorescence reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td>plasticware container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiTherm Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td>equipment for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-NDL-US-CAN</td>
			<td>equipment for DNA/RNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>bacterial cells for amplifying gene circuit of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>reagent for combining gene circuit fragements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for quantifying gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing fluorescence microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>reagent used for PCR of gene circuit components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVHL-PA</td>
			<td>instrument for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370S</td>
			<td>primary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary KRAS antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0003845M1</td>
			<td>primary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A28137</td>
			<td>equipment for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relative Quantification App</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>kit for extracting RNA of engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8889S</td>
			<td>secondary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary KRAS antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>secondary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets 5.0 mL</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td>reagents used for setting up a variety of chemical reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-1200</td>
			<td>tool for imaging correct PCR bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer (free) or SnapGene</td>
			<td>SnapGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software DNA sequence design and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU-TIZ</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4326317E</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>plate used for light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-290</td>
			<td>equipment for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flp-In 293</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R75007</td>
			<td>Engineered cell line with FRT site</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells

포유동물 세포에서 신뢰할 수 있는 유전자 발현 조절은 사용된 방법에 관계없이 높은 배수 변화, 낮은 잡음 및 결정된 입출력 전달 기능을 갖는 도구를 필요로 한다. 이 목표를 향해, 광유전학적 유전자 발현 시스템은 지난 십 년 동안 포유동물 세포에서 단백질 수준의 시공간적 조절을 위해 많은 주목을 받았다. 그러나, 광유도 유전자 발현을 조절하는 대부분의 기존 회로는 구조적으로 다양하고, 플라스미드로부터 발현되며, 가변 광유전학 장비를 이용하여, 안정한 세포주에서 광유전학적 성분의 특성화 및 표준화를 탐구할 필요성을 창출한다. 여기서, 본 연구는 사례로서 음성 피드백 광유전학 회로를 이용하여 포유동물 세포에서 광유도성 유전자 발현을 조절하기 위한 신뢰할 수 있는 유전자 회로 구축, 통합 및 특성화의 실험 파이프라인을 제공한다. 이 프로토콜은 또한 광유전학 장비 및 광 정권을 표준화하는 것이 유전자 발현 잡음 및 단백질 발현 크기와 같은 유전자 회로 특징을 어떻게 확실하게 나타낼 수 있는지를 보여줍니다. 마지막으로,이 논문은 그러한 기술을 채택하고자하는 광유전학에 익숙하지 않은 실험실에 유용 할 수 있습니다. 여기에 설명된 파이프라인은 포유동물 세포에서 다른 광유전학 회로를 적용하여, 포유동물 세포에서 전사, 프로테오믹 및 궁극적으로 표현형 수준에서 유전자 발현의 보다 안정적이고 상세한 특성화 및 조절을 허용해야 한다.

유전자 회로 어셈블리 및 본 문서 내의 안정한 세포주 생성은 전사 활성, 단일 안정한 FRT 부위를 함유하는 상업적이고 변형된 HEK-293 세포에 기초하였다 (도 1). 유전자 회로는 플라스미드 내에 FRT 부위가 있는 벡터로 구축되어 HEK-293 세포 게놈 내로의 Flp-FRT 통합을 허용하였다. 이 접근법은 FRT 부위가 CRISPR/Cas950과 같은 DNA 편집 기술을 사용하여 게놈의 어느 ?...

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Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

광-반응성 포유동물 세포를 안정적으로 제어하려면 광유전학적 방법의 표준화가 필요하다. 이러한 목표를 향하여, 본 연구는 유전자 회로 구축, 세포 공학, 광유전학 장비 운영 및 검증 분석의 파이프라인을 개괄하여 네거티브 피드백 광유전학 유전자 회로를 이용한 광유도 유전자 발현 연구를 사례 연구로 표준화한다.

포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

표준화 된 광유전학 프로토콜은 조작 된 포유류 세포 시스템에서 세포 특성을 제어하기 위해 빛을 자극으로 사용하는 데 관심이있는 실험실을 위해 설계되었습니다. 이 프로토콜은 광유전학에 익숙하지 않은 실험실에서 구현하기 쉽고 조작 된 생물학적 시스템의 정확한 공간 시간 제어를위한 방법을 제공합니다. 이 방법은 암 생물학, 시스템 생물학 및 조직 분화를 포함하여 시공간 정보가 중요 할 수있는 특정 연구 분야에서 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.우선, 단일 유전자 회로 또는 플라스미드에 결합할 유전자 성분을 선택한다. 예를 들어, 포유동물 DNA 통합 부위, 광반응 요소, 또는 기능적 유전자. 시작 코돈, 조절 또는 번역 서열과 같은 필요한 모든 기능을 조립하고 검사 한 후 유전 공학 및 분자 클로닝 소프트웨어를 사용하고 나중에 사용할 수 있도록 DNA 서열에 주석을 달고 저장합니다.내장된 분자 클로닝 소프트웨어 기능, 예를 들어 서열 정렬을 통해 플라스미드 구축을 위한 프라이머를 계산적으로 검증한다. 안정한 세포주를 생성하기 위해, 유전자 회로 DNA의 리포좀 혼합물을 적절한 재조합효소와 함께 사용하여 설계 유전자 회로 및 목적 세포를 형질감염시킨다. 세포가 80 내지 100% 합류한 후, 세포를 45%오래된 배지, 45%신선한 배지 및 10%DMSO의 혼합으로 동결시킨다.나머지 세포를 멸균 튜브로 옮기고 단일 세포 분류를 수행하여 단일클론 세포를 96-웰 플레이트로 분리한다. 모노클로날 분류 후 약 두세 주 후, 96-웰 플레이트 내의 웰에는 초점이 있어야합니다. 50 ~ 60 %의 컨플루언시가 달성되면 세포를 12 웰 플레이트로 분할하십시오.마이크로 컨트롤러 프로그래머를 사용하여 조립된 LPA 회로에 펌웨어를 추가합니다. 그런 다음 장착 플레이트, 회로 기판, LED 스페이서, 플레이트 어댑터, 24웰 플레이트, 플레이트 뚜껑, 장착 볼트, 윙 너트 및 스태킹 구성 요소를 사용하여 조립 된 회로 기판에 3D 인쇄 된 부품을 결합하십시오. 광유전학 실험을 시작하려면 Tabor Lab 웹 사이트에서 사용할 수 있는 아이리스 소프트웨어를 사용하여 LPA용 SD 카드를 프로그래밍하고 적절한 조명 조건을 탐색합니다.그런 다음 원하는 실험 개요에 대한 기술 반복실험으로 강도 값을 입력합니다. 총 부피 500 마이크로리터의 24웰 블랙 플레이트에 웰당 약 75,000개의 세포를 첨가한 다음, 세포를 5% 이산화탄소가 있는 가습 배양기에 넣어 2~6시간 동안 침전시킬 수 있도록 한다. 배양이 끝날 때 조직 배양 후드에서 세포를 옮긴 후, 플라스틱 뚜껑을 제거하고 플레이트 상단에 접착 호일 스트립을 추가하여 웰 사이의 광 전달을 최소화하여 빛이 웰 하단에 위치한 LED를 통해서만 들어갈 수 있도록 합니다.플레이트를 LPA의 장착된 3D 부품에 놓은 다음 각 모서리의 장치 나사 위에 맞는 3D 인쇄된 LPA 뚜껑으로 플레이트를 덮습니다. 장치를 전원에 연결하고 LPA 장치의 재설정 버튼을 눌러 업데이트된 LPA 실험 설정이 적용되었는지 확인하고 셀을 인큐베이션합니다. 배양 후, 조직 배양 후드 내부에서, 플레이트로부터 호일 스트립을 제거하고, 플라스틱 뚜껑 상에 응축이 형성되는 것을 방지하기 위해 플레이트를 하나 내지 이분 동안 앉히게 한다.다음으로, 원래의 플라스틱 뚜껑을 다시 플레이트 위에 놓고 적절한 위상 대비 또는 형광 현미경으로 세포를 이미지화하십시오. 유도 후 24 내지 72시간 후, 트립신화에 이어서, 약 500 마이크로리터의 각 웰의 전체 내용물을 세포 스트레이너가 장착된 표지된 튜브로 옮긴다. 그런 다음 적절한 유세포 분석기 소프트웨어를 사용하여 전방 및 측면 산란 게이트를 만들어 파편과 세포 덩어리를 배제하기 위해 적절한 크기와 세분성의 단일 세포를 캡처합니다.게이트가 설정되면 적절한 게이트로 약 10, 000개의 세포를 포획하고 필요한 세포 데이터의 양에 따라 세포 수를 조정하고 각 튜브에서 실험 세포를 반복적으로 포획합니다. 유도 및 트립신화 후, 약 500 마이크로리터의 각 웰의 전체 내용물을 표지된 튜브로 옮긴다. 세포를 400회 G에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 버린 후, 샘플을 화학 흄 후드로 옮긴다.PBS에 희석된 750 내지 1, 000 마이크로리터의 4%PFA에 세포를 재현탁시키고 피펫을 여러 번 상하로 재현탁하여 세포 덩어리를 부수었다. 15분 배양 후, 750 내지 1, 000 마이크로리터의 PBS를 첨가하고, 다시 피펫을 여러 번 상하로 한 다음, 실온에서 400배 G에서 5분 동안 세포를 펠릿 다운시킨다. 상청액을 버린 후, 샘플을 화학적 흄 후드로 옮기고 입증된 바와 같이 세포를 750 내지 1, 000 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 메탄올에 재현탁시키고, 세포를 섭씨 영하 20도 냉동고에서 30분 동안 앉히도록 한다.인큐베이션 후, 750 내지 1, 000 마이크로리터의 PBS를 첨가하면서 여러 번 위아래로 피펫팅하였다. 그 후 세포를 400배 G에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 버리고 샘플을 화학 흄 후드로 옮긴다. 세포를 100 마이크로리터 또는 다른 적합한 희석된 표지된 일차 항체 및 피펫을 여섯 내지 여덟 번 상하로 재현탁시킨 다음, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.다음으로, 750 내지 1, 000 마이크로리터의 인큐베이션 버퍼 및 피펫 용액을 여러 번 상하로 가한 다음, 세포를 400회 G.Next에서 5분 동안 원심분리한 다음, 세포를 500 마이크로리터의 PBS에 재현탁시키고, 여러 번 위아래로 피펫팅하여 덩어리를 깨뜨린다. 각 튜브의 전체 내용물을 세포 스트레이너가있는 표지 된 튜브로 옮깁니다. 세포를 올바른 파장의 레이저로 적절한 유세포 측정 장비로 가져 오십시오.장치에 대해 광학 보정을 수행하였다. 획득한 이미지를 사용하여 LED에 대한 보정 값을 계산하고, 배경 신호를 빼고, 픽셀 강도를 추론했습니다. 변동 계수는 96웰 사이에서 최소였다.보정 소프트웨어는 위치별 LED 변화를 시연하고 각 LED가 동일한 강도로 정규화되도록 그레이스케일 조정을 생성했습니다. 유전자 발현은 LPA 상의 상이한 광 펄스 지속기간에서 형광 현미경을 통해 조작된 라이터 세포에서 유도되었고, 세포를 브라이트필드 및 GFP 발현에 대해 이미지화하였다. 유세포 분석기를 사용하여, 세포를 상이한 펄스 길이 값에서 유도하였고, 유도되지 않은 상태로부터의 네 배 이상의 변화의 집단 수준에서 정량화된 유전자 발현의 용량 반응을 나타내었다.다섯 배 이상의 유전자 발현 잡음 감소에 걸쳐 달성된 음성 피드백은 라이터 시스템에 대한 다양한 광 강도 값과 생생하거나 가벼운 것에 대한 비교함으로써 보여지는 바와 같다. qPCR 분석은 조작된 라이터 세포가 유도되지 않은 상태로부터의 열 배 이상의 유도와 함께 용량-반응성 방식으로 RNA 수준을 발현하고, 유세포 측정법 정량화와 일치한다는 것을 보여주었다. 조작된 라이터 유전자 회로는 청색광의 양이 증가하여 KRAS 단백질 수준과 인산화된 ERK 수치가 증가한 것으로 나타났습니다.성장, 세포 운동성, 상처 치유, 증식, 또는 침윤 검정을 포함하는 몇몇 기능적 분석이 수행될 수 있다. 이러한 방법은 암 생물학, 조직 분화 또는 약물 내성의 메커니즘에 대한 구체적인 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

연구

생체공학

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

에 대한 중공의 생물 반응<em&gt; 생체</em&gt; -처럼 포유류 조직 문화

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

3 차원 펩 티 드 건설 기계에 포유류 세포 배양

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

균일 한 골 재를 생산 하 오 모양의 혈관에 포유류 세포의 문화를 떨고는 궤도

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

안정적인 만성 설치류 전기 생리학에 대 한 주사기-주 사용 메쉬 전자

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...