Name: single-molecule dwell-time analysis of restriction endonuclease-mediated dna cleavage
Uploaded: 2021-02-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Award Number K12GM074869 til CME fra National Institute of General Medical Sciences. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institute of General Medical Sciences eller National Institutes of Health.

1. Generelle oplysninger
<ol><li>Oligonukleotid design BEMÆRK: Det 60 basepar (bp) lange DNA-substrat er dannet af et par komplementære oligonukleotider med en duplex-smeltetemperatur på 75 °C i 100 mM NaCl.<ol><li>Bestil det ene oligonukleotid syntetiseret med en enkelt 5' biotinmodifikation og det andet med en 5' thiolmodifikation (med et seks-kulstofafstandsstykke). Placer genkendelsesstedet i midten af dupleksområdet. BEMÆRK VENLIGST: Oligonukleotidsekvenserne til brug med EcoRV er vist nedenfor (genken...

<ol>
	<li>Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+restriction+enzymes+became+the+workhorses+of+molecular+biology.">How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (17), 5905-5908 (2005).</li><li>Loenen, W. A., Dryden, D. T., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., Murray, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+of+the+DNA+cutters:+a+short+history+of+the+restriction+enzymes.">Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 3-19 (2014).</li><li>Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REBASE--a+database+for+DNA+restriction+and+modification:+enzymes,+genes+and+genomes.">REBASE--a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, 298-299 (2015).</li><li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sliding+and+jumping+of+single+EcoRV+restriction+enzymes+on+non-cognate+DNA.">Sliding and jumping of single EcoRV restriction enzymes on non-cognate DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), 4118-4127 (2008).</li><li>Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+single+quantum+dot+labeled+EcoRV+sliding+along+DNA+manipulated+by+double+optical+tweezers.">Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 96 (8), 50-52 (2009).</li><li>Blainey, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonspecifically+bound+proteins+spin+while+diffusing+along+DNA.">Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).</li><li>Huang, C. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+DNA+recognition+by+restriction+endonuclease+EcoRI.">Direct visualization of DNA recognition by restriction endonuclease EcoRI.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Medicine. 5 (1), 25-29 (2013).</li><li>Palma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+biomolecular+nanoarrays+for+parallel+single-molecule+investigations.">Selective biomolecular nanoarrays for parallel single-molecule investigations.</a> Journal of American Chemical Society. 133 (20), 7656-7659 (2011).</li><li>Reinhard, B. M., Sheikholeslami, S., Mastroianni, A., Alivisatos, A. P., Liphardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+plasmon+coupling+to+reveal+the+dynamics+of+DNA+bending+and+cleavage+by+single+EcoRV+restriction+enzymes.">Use of plasmon coupling to reveal the dynamics of DNA bending and cleavage by single EcoRV restriction enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2667-2672 (2007).</li><li>van den Broek, B., Noom, M. C., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-tension+dependence+of+restriction+enzyme+activity+reveals+mechanochemical+properties+of+the+reaction+pathway.">DNA-tension dependence of restriction enzyme activity reveals mechanochemical properties of the reaction pathway.</a> Nucleic Acids Research. 33 (8), 2676-2684 (2005).</li><li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage.">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li><li>Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+kinetic+intermediates+in+single-particle+dwell-time+distributions.">Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions.</a> Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).</li><li>Loparo, J. J., van Oijen, A., Hinterdorfer, P., Oijen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+enzymology.">Single-molecule enzymology.</a> Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 165-182 (2009).</li><li>Taylor, J. D., Badcoe, I. G., Clarke, A. R., Halford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EcoRV+restriction+endonuclease+binds+all+DNA+sequences+with+equal+affinity.">EcoRV restriction endonuclease binds all DNA sequences with equal affinity.</a> Biochemistry. 30 (36), 8743-8753 (1991).</li><li>Pingoud, A., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+type+II+restriction+endonucleases.">Structure and function of type II restriction endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 29 (18), 3705-3727 (2001).</li><li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy.">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1529 (2009).</li><li>Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+enzymes+replicating+DNA+using+a+single-molecule+DNA+stretching+assay.">Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1689 (2010).</li><li>Baldwin, G. S., Vipond, I. B., Halford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+reaction+analysis+of+the+catalytic+cycle+of+the+EcoRV+restriction+endonuclease.">Rapid reaction analysis of the catalytic cycle of the EcoRV restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 34 (2), 705-714 (1995).</li><li>Winkler, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal-structure+of+Ecorv+endonuclease+and+of+Its+complexes+with+cognate+and+non-cognate+DNA+fragments.">The crystal-structure of Ecorv endonuclease and of Its complexes with cognate and non-cognate DNA fragments.</a> EMBO Journal. 12 (5), 1781-1795 (1993).</li><li>Sioss, J. A., Stoermer, R. L., Sha, M. Y., Keating, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silica-coated,+Au/Ag+striped+nanowires+for+bioanalysis.">Silica-coated, Au/Ag striped nanowires for bioanalysis.</a> Langmuir. 23 (22), 11334-11341 (2007).</li></ol>

DNA-substratet til denne analyse er mærket med en kvanteprik ved hjælp af et to-trins reaktionsskema ved hjælp af sulfo-SMCC. Denne bifunktionelle tværbinder består af en NHS-esterdel, der kan reagere med en primær amin, og en maleimiddel, der kan reagere med en sulfhydrylgruppe20. De thiolerede oligonukleotider, der bruges til at fremstille substratet, sendes i deres oxiderede form. Det er vigtigt at reducere og rense dem, som beskrevet, før du fortsætter med koblingsproceduren, ellers vi...

Restriktionsendonukleaser (REaser) er enzymer, der påvirker sekvensspecifikke dobbeltstrengsbrud i DNA. Opdagelsen af REases i 1970'erne førte til udviklingen af rekombinant DNA-teknologi, og disse enzymer er nu uundværlige laboratorieværktøjer til genetisk modifikation og manipulation1. Type II REaser er de mest udbredte enzymer i denne klasse, da de spalter DNA på et fast sted enten inden for eller nær deres genkendelsessekvens. Der er dog stor variation blandt type II REaser, og de er opdelt i flere undertyper baseret på særlige enzymatiske egenskaber snarere end at blive klassificeret efter deres evolutionære forhold. Blandt hver undertype er der hyppige undtagelser fra klassifikationsskemaet, og mange enzymer tilhører flere undertyper2. Tusindvis af type II REaser er blevet identificeret, og hundredvis af dem er kommercielt tilgængelige.
På trods af mangfoldigheden blandt type II REaser er meget få REaser blevet undersøgt i detaljer. Ifølge REBASE, restriktionsenzymdatabasen etableret af Sir Richard Roberts i 19753, er offentliggjorte kinetiske data tilgængelige for færre end 20 af disse enzymer. Desuden, mens nogle REaser er blevet observeret direkte på enkeltmolekyleniveau, mens de diffunderer langs DNA'et før de støder på og binder sig til deres genkendelsessekvens 4,5,6,7, er der meget få enkeltmolekyleundersøgelser af deres spaltningsreaktionskinetik. De eksisterende undersøgelser rapporterer enten ikke tilstrækkelige statistikker til at foretage en detaljeret analyse af variationen i de tidspunkter, hvor enkelte spaltningshændelser finder sted 8,9,10, eller er ikke i stand til at fange den fulde fordeling af spaltningsgange11. Denne type analyse kan afsløre tilstedeværelsen af relativt langlivede kinetiske mellemprodukter og kan føre til bedre forståelse af mekanismerne for REase-medieret DNA-spaltning.
På enkeltmolekyleniveau er biokemiske processer stokastiske - ventetiden for en enkelt forekomst af processen at finde sted, τ, er variabel. Mange målinger af τ kan dog forventes at adlyde en sandsynlighedsfordeling, p(τ), der er en indikation af den type proces, der finder sted. For eksempel vil en enkelttrinsproces, såsom frigivelse af et produktmolekyle fra et enzym, adlyde Poisson-statistikker, og p(τ) vil tage form af en negativ eksponentiel fordeling:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq1v3.png">
hvor β er den gennemsnitlige ventetid. Bemærk, at processens hastighed, k, vil være lig med 1/β, det omvendte af den gennemsnitlige ventetid. For processer, der kræver mere end ét trin, vil p(τ) være foldningen af de enkelt-eksponentielle fordelinger for hvert af de enkelte trin. En generel løsning til konvolution af N enkelteksponentielle henfaldsfunktioner med identiske gennemsnitlige ventetider, β, er gammasandsynlighedsfordelingen:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq2v3.png">
hvor Γ(N) er gammafunktionen, som beskriver interpolationen af faktorialet af N-1 til ikke-heltalsværdier af N. Selvom denne generelle løsning kan bruges som en tilnærmelse, når de gennemsnitlige ventetider for de enkelte trin er ens, må det forstås, at tilstedeværelsen af relativt hurtige trin vil blive maskeret af trin med betydeligt længere ventetider. Med andre ord repræsenterer værdien af N en nedre grænse for antallet af trin12. Med et tilstrækkeligt antal ventetidsmålinger kan parametrene β og N estimeres ved at bine hændelserne og tilpasse gammafordelingen til det resulterende histogram eller ved at bruge en maksimal sandsynlighedsestimeringsmetode. Denne type analyse kan derfor afsløre tilstedeværelsen af kinetiske trin, der ikke let kan opløses i ensembleanalyser og kræver et stort antal observationer for at estimere parametre nøjagtigt12,13.
Denne artikel beskriver en metode til at bruge kvante-dot-mærket DNA og total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi til at observere hundredvis af individuelle REase-medierede DNA-spaltningshændelser parallelt. Analysens design gør det muligt at samle resultaterne af flere eksperimenter og kan skabe opholdstidsfordelinger indeholdende tusindvis af begivenheder. Den høje fotostabilitet og lysstyrke af kvanteprikker tillader en tidsopløsning på 10 Hz uden at ofre evnen til at observere spaltningshændelser, der forekommer selv mange minutter efter eksperimentets start. God tidsopløsning og et bredt dynamisk område, kombineret med evnen til at indsamle et stort datasæt, tillader nøjagtig karakterisering af opholdstidsfordelingerne for at afdække tilstedeværelsen af flere kinetiske trin i spaltningsvejene for REaser, som har omsætningshastigheder i området 1 min-1 . I tilfælde af EcoRV kan tre kinetiske trin løses, som alle er blevet identificeret på andre måder, hvilket bekræfter, at analysen er følsom over for tilstedeværelsen af sådanne trin.
Duplex DNA-substrater, der indeholder genkendelsessekvensen af interesse, produceres ved at udgløde et biotinyleret oligonukleotid til en komplementær streng mærket med en enkelt, kovalent fastgjort halvleder nanokrystal kvantepunkt. Disse substrater indføres i en strømningskanal bygget oven på et glasdækglas med en græsplæne af polyethylenglycol (PEG) molekyler med høj molekylvægt fastgjort til overfladen. DNA-substraterne fanges via en biotin-streptavidin-biotin-binding af en brøkdel af PEG-molekylerne, der har et biotin i deres frie ende. I TIRF-mikroskopi giver en flygtig bølge, der henfalder eksponentielt med afstanden fra glas-væske-grænsefladen, belysning; Gennemtrængningsdybden er i rækkefølgen af bølgelængden af det anvendte lys. Under disse forhold vil kun kvanteprikker, der er bundet til overfladen af et DNA-molekyle, der er blevet fanget på den funktionaliserede glasoverflade, blive exciteret. Kvanteprikker, der er frie i opløsning, vil ikke være begrænset inden for det oplyste område og vil derfor ikke lyse. Hvis DNA'et, der binder et kvantepunkt til overfladen, er kløvet, vil det kvantepunkt være frit til at diffundere væk fra overfladen, og det vil forsvinde fra fluorescensbilledet.
Selvom mange type II REaser er kendt for at binde DNA i fravær af magnesium14, kræver alle magnesium for at formidle DNA-spaltning15. Disse REaser kan binde det overfladeimmobiliserede DNA i fravær af magnesium. Når magnesiumholdig buffer strømmes gennem en kanal med REase bundet til DNA'et, begynder spaltningen med det samme, hvilket indikeres af forsvinden af kvanteprikker. Synkroniseringen opnået ved at forbinde REase-molekylerne og derefter initiere DNA-spaltning ved at introducere magnesium, letter måling af forsinkelsestiden til færdiggørelsen af DNA-spaltning uafhængigt for hvert molekyle i populationen af enzymer observeret i et eksperiment. Fluorescein indgår som et sporstofstof i den magnesiumholdige buffer for at indikere ankomsten af magnesium i synsfeltet. Da der ikke er noget enzym inkluderet i den magnesiumholdige buffer, angiver forsinkelsestiden fra ankomsten af magnesiumholdig buffer til forsvinden af hver kvanteprik den tid, det tager for en REase, der allerede er bundet til DNA'et, at spalte DNA'et og frigive kvanteprikken fra glasoverfladen. Kvantepunktsforsvinden sker hurtigt og resulterer i et kraftigt fald i intensitetsbanen, hvilket giver en klar indikation af det tidspunkt, hvor et givet DNA-molekyle spaltes. Bestemmelsen af begivenhedstider opnås ved matematisk analyse af intensitetsbaner, og et typisk eksperiment resulterer i hundredvis af identificerbare spaltningshændelser. Resultaterne af flere eksperimenter kan samles for at give tilstrækkelig statistik til at muliggøre estimering af parametrene, N og β, ved enten ikke-lineær mindste kvadraters eller maksimal sandsynlighedsanalyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltriethoxysilane (APTS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440140-100ML</td>
			<td>Store in dessicator box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 Minute Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>20845</td>
			<td>use for sealing the microfluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>329000ACS</td>
			<td>use for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPXH Model 2800</td>
			<td>catalog number 15-337-410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, glass, 100 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>BIO-SVA-5K</td>
			<td>Succinimidyl valerate has a longer half-life than succinimidyl carbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated oligonucleotide</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom - see protocol for design considerations</td>
			<td>Request 5&#39; Biotin modification and HPLC purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0903-5G</td>
			<td>prepare a 10 mg/mL solution (aq) and heat to 95 &#176;C before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centri-Spin-10 Size Exclusion Spin Columns</td>
			<td>Princeton Separations</td>
			<td>CS-100 or CS-101</td>
			<td>used to purify thiolated oligonucleotides after reducing the disulfide bond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 1.5. mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 1-inch square glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslip holders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diamond point wheel</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>7134</td>
			<td>use for drilling holes in quartz flow cell topper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A39255</td>
			<td>No-Weigh Format, 7.7 mg/vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>drill press rotary tool workstation stand</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>220-01</td>
			<td>facilitates quartz drilling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV (REase used to generate example data)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195T or R0195M</td>
			<td>Use 100,000 units/mL stock to avoid adding excess glycerol Check REBASE for suppliers of other REases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>various</td>
			<td>CAS 64-17-5</td>
			<td>denatured or 95% are acceptable, use for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>BioUltra, anhydrous, store in dessicator box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flea Micro Spinbar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-513-65</td>
			<td>3 mm x 10 mm size to fit beneath coverslip rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescein</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>17324</td>
			<td>use to make experimental buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gravity convection oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9010-0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>handheld rotary multitool</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8220</td>
			<td>use for drilling holes in quartz flow cell topper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImagEM X2 EM-CCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-23B</td>
			<td>air cooling is adequate for this experiment, use HCImage software or similar to control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging spacer, double-sided, adhesive</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jar, glass with screw cap, (approximately 50 mm diameter by 50 mm high)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td>use to make experimental buffer with magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metal tweezers</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methoxy-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>M-SVA-5K</td>
			<td>Both PEGs should have the same NHS ester so that the rate of reaction is consistent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiposition magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC20818</td>
			<td>CAS 103-47-9, use to make CHES buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>orbital shaker and heater for microcentrifuge tubes</td>
			<td>Q Instruments</td>
			<td>1808-0506</td>
			<td>with 1808-1061 adaptor for 24 x 2.0 mL or 15 x 0.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE60 Polyethylene tubing (inner diameter 0.76 mm, outer diameter 1.22 mm)</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>6258917</td>
			<td>22 G blunt needles are a good fit for this tubing size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10x</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7059</td>
			<td>Use at 1x strength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH9262</td>
			<td>use a 1 M solution to clean coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q21521MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Slide, 1 inch square, 1 mm thick</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72250-10</td>
			<td>holes must be drilled in the corners for inlet and outlet tubing insertion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reinforced plastic tweezers</td>
			<td>Rubis</td>
			<td>K35a</td>
			<td>use for handling coverslips and building microfluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecureSeal Adhesive Sheets</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td>cut to form spacer for microfluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel syringe pump for microfluidics</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1002X-US</td>
			<td>fitted with a 50 mL syringe and a 22 G blunt needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-a-Lyzer MINI Dialysis Devices, 10 kDa MWCO, 0.1 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570 or 69572</td>
			<td>used for buffer exchange during quantum dot coupling to DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0320</td>
			<td>use to make buffer for surface functionalization; 100 mM, pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Macron</td>
			<td>7581-12</td>
			<td>use to make experimental buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic solution (BioUltra, 0.5 M in water)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>94046</td>
			<td>use to make 100 mM sodium phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic solution (BioUltra, 5M in water)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74092</td>
			<td>use to adjust pH of 100 mM sodium phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin from Streptomyces avidinii</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4762</td>
			<td>dissolve at 1 mg/mL and store 25 mL aliqouts at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A39268</td>
			<td>No-Weigh Format, 2 mg/vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe fitted with blunt 21 G needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thiolated oligonucleotide</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom - see protocol for design considerations</td>
			<td>Request 5&#39; Thiol Modifier C6 S-S and HPLC purificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF imaging system with 488 nm laser illumination</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>custom built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris -HCl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60050</td>
			<td>use to make experimental buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4101</td>
			<td>use to make experimental buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td>use to make blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash-N-Dry Coverslip Rack</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70366-16</td>
			<td>used for surface functionalization of coverslips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule dwell-time analysis of restriction endonuclease-mediated dna cleavage

Dette nye totale interne refleksionsfluorescensmikroskopi-baserede assay letter samtidig måling af længden af den katalytiske cyklus for hundredvis af individuelle restriktionsendonukleasemolekyler (REase) i et eksperiment. Denne analyse kræver ikke proteinmærkning og kan udføres med en enkelt billedbehandlingskanal. Derudover kan resultaterne af flere individuelle eksperimenter samles for at generere veludfyldte dvel-dwell-time-fordelinger. Analyse af de resulterende opholdstidsfordelinger kan hjælpe med at belyse DNA-spaltningsmekanismen ved at afsløre tilstedeværelsen af kinetiske trin, der ikke kan observeres direkte. Eksempeldata indsamlet ved hjælp af dette assay med den velundersøgte REase, EcoRV - en dimer Type IIP-restriktionsendonuklease, der spalter den palindromiske sekvens GAT↓ATC (hvor ↓ er skærestedet) - er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser. Disse resultater tyder på, at der er mindst tre trin i vejen til DNA-spaltning, der initieres ved at introducere magnesium, efter at EcoRV binder DNA i dets fravær, med en gennemsnitlig hastighed på 0,17 s-1 for hvert trin.

Flowcellen er direkte koblet til et olienedsænkningsobjektiv med høj numerisk blænde 60x forstørrelse på et omvendt mikroskop udstyret med laserbelysning til gennemobjektiv TIRF-billeddannelse (figur 5A). Efter at have introduceret DNA-substratet og vasket overskydende DNA og kvanteprikker væk, er der typisk tusindvis af individuelle kvanteprikker i et synsfelt (figur 5B). Disse kvanteprikker er stabilt fastgjort til glasoverfladen, og de gennemgår ikke m...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage at JoVE.com

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

Ved hjælp af kvante-dot-mærket DNA og total intern refleksionsfluorescensmikroskopi kan vi undersøge reaktionsmekanismen for restriktionsendonukleaser, mens vi bruger umærket protein. Denne enkeltmolekyleteknik giver mulighed for massivt multiplexet observation af individuelle protein-DNA-interaktioner, og data kan samles for at generere velbefolkede opholdstidsfordelinger.

Enkeltmolekyle opholdstidsanalyse af restriktionsendonuklease-medieret DNA-spaltning

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Med denne protokol kan vi direkte observere stedspecifik DNA-spaltning ved restriktionsendonukleaser på enkeltmolekyleniveau. Vores multiplexede tilgang giver os mulighed for at måle den tid, det tager for hundredvis af individuelle REaser at fuldføre den katalytiske cyklus. Multiplexing giver os mulighed for at generere velbefolkede opholdstider til spaltningsfordelinger, som vi kan tilpasse til gammasandsynlighedsfordelingen for at få indsigt i mekanismen for DNA-spaltning.Begynd med at forberede et nyt rør til hvert resuspenderet oligonukleotid ved 50 mikroliter oligonukleotid og 50 mikroliter frisklavet DTT-opløsning til hvert rør, pipetter op og ned for at blande og inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur. Pipetterer forsigtigt hele volumenet af hver prøveblanding på en forberedt kolonne og centrifugeres ved 750 G i to minutter. Efter centrifugering opbevares alle prøver, der ikke vil blive brugt med det samme ved 20 grader Celsius for at forhindre oxidation af thiolgrupperne og dannelse af disulfidbindinger.Pipetter en alikvot på 50 mikroliter af kvanteprikstammen i en dialyseenhed for hver konstruktion, der skal foretages, og sørg for ikke at røre membranen med pipettespidsen. Dialys mod et volumen af CHES buffer, der er mindst 1.000 gange sample volumen under omrøring ved 100 RPM i 15 minutter. Brug en pipetter til forsigtigt at tage de suspenderede kvanteprikker ud af dialyseapparatet og overføre dem til et nyt rør indeholdende en lige stor mængde frisklavet sulfo-SMCC-opløsning, pipettering op og ned for at blande.Inkuber i 1 time ved stuetemperatur med rystning ved 1.000 RPM for at tillade Sulfo-SMCC at reagere med de primære aminer på kvanteprikkerne. Brug derefter en pipetter til forsigtigt at overføre hver prøve til en ny dialyseenhed. For at fjerne overskydende sulfo-SMCC dialyseres mod et volumen af CHES-buffer, der er mindst 1.000 gange volumenet i dialyseapparatet under omrøring i 15 minutter.Udskift bufferen to gange, og udfør dialyse med frisk CHES-buffer tre gange i alt, så dialysen kan fortsætte i 15 minutter efter hver bufferudskiftning. Gentag derefter dialysen med PBS. Ved hjælp af en pipetter opsamles forsigtigt opløsningen indeholdende kvanteprikkerne fra dialyseudstyret, og hver prøve overføres til et nyt rør indeholdende en ækvimolær mængde dilateret oligonukleotid fortyndet i PBS.Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur med omrystning ved 1.000 omdr./min. Tilsæt BSA til hver prøve for en endelig koncentration på 0,5 milligram pr. milliliter. Brug derefter en pipetter til forsigtigt at overføre hver prøve til en frisk dialyseenhed og dialyser mod opbevaringsbuffer.Efter dialyse skal du forsigtigt genvinde hver prøve og placere den i et nyt rør. Opbevar prøverne ved 4 grader Celsius. Kombiner en prøve af kvantepunktmærkede oligonukleotider med et ti gange molært overskud af biotinyleret oligonukleotid.Varm blandingen op i en varmeblok til 75 grader Celsius og hold den ved den temperatur i 5 minutter. Sluk derefter for varmeblokken, og lad blandingen køle langsomt af. Opbevar den færdige konstruktion ved 4 grader Celsius Brug et håndholdt roterende multiværktøj udstyret med et tilspidset diamantspidshjul, bor to huller i modsatte hjørner af kvartsslæden for at fungere som indløb og udløb.Sørg for at fastgøre slæden på plads, smør boret og glid konstant med vand under boring. Efter hvert eksperiment genvindes det forberedte kvartsglas ved at lægge den brugte enhed i blød i acetone for at opløse klæbemidlet og epoxyen. Kassér de resterende komponenter.Kombiner 25 mikroliter streptavidinopløsning med 80 mikroliter PBS og 20 mikroliter blokerende buffer. Beklæd en PEG-behandlet coverslip med denne blanding, og inkuber i et fugtigt miljø i 30 minutter. Under inkubationen af dækglasset skal du forberede billedafstandsstykket til at skabe en flowkanal.Skær et 1 tommer firkantet stykke billedafstandsmateriale, og marker derefter en 2 millimeter bred kanal, der er justeret med enderne af hullerne, der er boret i kvartsobjektglasset. Skær kanalen ud af afstandsmaterialet med en skalpel. Rengør kvartsglasset grundigt med acetone for at fjerne eventuelle rester af klæbemiddel fra tidligere eksperimenter.Træk den ene side af bagsiden af billedafstandsstykket og placer den forsigtigt på kvartsglasset, og pas på ikke at dække indløbs- og udløbshullerne. Vask dækslen med vand og tør med trykluft. Fjern den anden side af bagsiden fra billedafstandsstykket, og læg den mellem kvartsglasset og den funktionaliserede streptavidinbelagte dækseddel ved hjælp af en plastikpincet til at presse enheden sammen og fjerne luftbobler fra klæbemidlet.Skær enden til slangen i en vinkel for at sikre fri strøm af opløsningen. Indsæt derefter 30 centimeter lange polyethylenrør i hvert hul i kvartsglasset. Hold rørene på plads med et rørstativ, og brug derefter epoxy til at forsegle rørene på plads og kanterne på den samlede enhed.Når epoxyen er indstillet, skal du indsætte den stumpe nål på en tom sprøjte i enhedens udløbsrør og nedsænke enden af indløbsrøret i en beholder fyldt med blokeringsbufferen. Træk sprøjtestemplet tilbage for at fylde enheden med blokerende buffer. Lad derefter enheden inkubere i mindst 30 minutter før brug.Fastgør den mikrofluidiske enhed til mikroskopets trinplade med tape. Bring objektivet i kontakt med bunden af enheden, og placer objektivet, så synsfeltet er inden for den mikrofluidiske kanal. Efter tilslutning af udløbsrøret til sprøjtepumpen skylles den mikrofluidiske kanal med en frisk blokerende buffer ved at trække sprøjtestemplet tilbage.Kontroller, at der ikke er nogen bobler fanget i slangen eller i kanalen. Fortynd 1 mikroliter af det forberedte DNA-substrat til 1 ml blokerende buffer. Placer indløbsrøret i det fortyndede DNA-substrat og flyd 800 mikroliter af substratopløsningen gennem kanalen med en hastighed på 200 mikroliter pr. Minut.Lad DNA-opløsningen inkubere i kanalen i 15 minutter efter, at flowet stopper. Efter inkubationen skal der strømmes mindst 800 mikroliter blokerende buffer gennem kanalen med en hastighed på 200 mikroliter i minuttet for at skylle det ubundne DNA ud af kanalen. Juster mikroskopets fokus, så de overfladebundne kvanteprikker er tydeligt synlige.Skyl den mikrofluidiske enhed med 800 mikroliter eksperimentel buffer uden magnesium ved en strømningshastighed på 200 mikroliter pr. Minut. Tilsæt REase til en alikvot af eksperimentel buffer uden magnesium og bland forsigtigt ved pipettering. Flow 800 mikroliter på 400 enheder pr. milliliter EcoRV gennem kanalen med en strømningshastighed på 200 mikroliter pr. minut.Start eksperimentet ved at strømme den eksperimentelle buffer indeholdende magnesium og fluorescein med en strømningshastighed på 200 mikroliter i minuttet. Begynd at indsamle data umiddelbart efter start af sprøjtepumpen. Stop dataindsamling efter at have strømmet 800 mikroliter buffer.Efter at have introduceret DNA-substratet i flowcellen og vasket overskydende DNA og kvanteprikker væk, er der typisk tusindvis af individuelle kvanteprikker i et synsfelt. De er stabilt fastgjort til glasoverfladen og gennemgår ikke mærkbar dæmpning eller betydelig blegning under hele eksperimentet. Når REasen har strømmet gennem kanalen i fravær af magnesium, kan mindst 95 % af de kvanteprikker, der var til stede i begyndelsen af eksperimentet, stadig ses i slutningen af observationsperioden.Men når den magnesiumholdige buffer flyder umiddelbart efter REase, forsvinder op til halvdelen af kvanteprikkerne ved slutningen af observationsperioden, svarende til hvad der observeres, når REase og magnesium flyder gennem kanalen sammen. Kvantepunktsforsvinden sker hurtigt og resulterer i et kraftigt fald i intensitetsbanen, hvilket giver en klar indikation af det tidspunkt, hvor et givet DNA-molekyle spaltes. Dette eksperiment blev udført med den velundersøgte type II P REase EcoRV.Både ikke-lineær mindste kvadraters kurvetilpasning og maksimal sandsynlighedsparameterestimering blev brugt til at udtrække værdierne af n og beta fra dataene. De to parameterestimeringsmetoder var i overensstemmelse. Ved at bruge den ikke-lineære mindste kvadraters pasform var n 3,52 og beta var 5,78 sekunder.Ved at bruge estimatet af maksimal sandsynlighed var n 3,41 og beta var 6,06 sekunder. Denne analyse kan give bevis for tilstedeværelsen af mellemliggende trin langs spaltningsvejen. Udførelse af denne analyse under skiftende reaktionsforhold kan hjælpe med at fastslå arten af reaktionsmellemprodukter, der ikke kan observeres direkte.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust og høj overførselshastighed enkelt molekyle Flow strækker Assay gennemførelse for at studere Transport af molekyler langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Enkelt-molekyle Manipulation af G-quadruplexes af magnetiske pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Bestemmelse, hvis DNA farves med en Cyanine farvestof kan fordøjes med restriktionsenzymer

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering af proteiner for enkelt molekyle kraft spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion af dynein og Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer til observation af et enkelt molekyle

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

En In Vitro Single-Molecule Imaging Assay til analyse af cap-afhængige oversættelse kinetik

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enkeltmolekyle fluorescens energioverførsel undersøgelse af ribosom proteinsyntese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Enkeltmolekylebilleddannelse af EWS-FLI1-kondensater, der samles på DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...