Name: single-molecule dwell-time analysis of restriction endonuclease-mediated dna cleavage
Uploaded: 2021-02-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door Award Number K12GM074869 aan CME van het National Institute of General Medical Sciences. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het National Institute of General Medical Sciences of de National Institutes of Health.

1. Algemene informatie
<ol><li>Oligonucleotide ontwerp OPMERKING: Het 60 basenparen (bp) lange DNA-substraat wordt gevormd uit een paar complementaire oligonucleotiden met een duplexsmelttemperatuur van 75 °C in 100 mM NaCl.<ol><li>Bestel een oligonucleotide gesynthetiseerd met een enkele 5' biotinemodificatie en de andere met een 5'-thiolmodificatie (met een spacer met zes koolstofatomen). Plaats de herkenningsplaats in het midden van het duplexgebied. OPMERKING: De oligonucleotidesequenties voor gebruik met Ec...

<ol>
	<li>Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+restriction+enzymes+became+the+workhorses+of+molecular+biology.">How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (17), 5905-5908 (2005).</li><li>Loenen, W. A., Dryden, D. T., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., Murray, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+of+the+DNA+cutters:+a+short+history+of+the+restriction+enzymes.">Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 3-19 (2014).</li><li>Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REBASE--a+database+for+DNA+restriction+and+modification:+enzymes,+genes+and+genomes.">REBASE--a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, 298-299 (2015).</li><li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sliding+and+jumping+of+single+EcoRV+restriction+enzymes+on+non-cognate+DNA.">Sliding and jumping of single EcoRV restriction enzymes on non-cognate DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), 4118-4127 (2008).</li><li>Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+single+quantum+dot+labeled+EcoRV+sliding+along+DNA+manipulated+by+double+optical+tweezers.">Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 96 (8), 50-52 (2009).</li><li>Blainey, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonspecifically+bound+proteins+spin+while+diffusing+along+DNA.">Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).</li><li>Huang, C. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+DNA+recognition+by+restriction+endonuclease+EcoRI.">Direct visualization of DNA recognition by restriction endonuclease EcoRI.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Medicine. 5 (1), 25-29 (2013).</li><li>Palma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+biomolecular+nanoarrays+for+parallel+single-molecule+investigations.">Selective biomolecular nanoarrays for parallel single-molecule investigations.</a> Journal of American Chemical Society. 133 (20), 7656-7659 (2011).</li><li>Reinhard, B. M., Sheikholeslami, S., Mastroianni, A., Alivisatos, A. P., Liphardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+plasmon+coupling+to+reveal+the+dynamics+of+DNA+bending+and+cleavage+by+single+EcoRV+restriction+enzymes.">Use of plasmon coupling to reveal the dynamics of DNA bending and cleavage by single EcoRV restriction enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2667-2672 (2007).</li><li>van den Broek, B., Noom, M. C., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-tension+dependence+of+restriction+enzyme+activity+reveals+mechanochemical+properties+of+the+reaction+pathway.">DNA-tension dependence of restriction enzyme activity reveals mechanochemical properties of the reaction pathway.</a> Nucleic Acids Research. 33 (8), 2676-2684 (2005).</li><li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage.">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li><li>Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+kinetic+intermediates+in+single-particle+dwell-time+distributions.">Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions.</a> Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).</li><li>Loparo, J. J., van Oijen, A., Hinterdorfer, P., Oijen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+enzymology.">Single-molecule enzymology.</a> Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 165-182 (2009).</li><li>Taylor, J. D., Badcoe, I. G., Clarke, A. R., Halford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EcoRV+restriction+endonuclease+binds+all+DNA+sequences+with+equal+affinity.">EcoRV restriction endonuclease binds all DNA sequences with equal affinity.</a> Biochemistry. 30 (36), 8743-8753 (1991).</li><li>Pingoud, A., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+type+II+restriction+endonucleases.">Structure and function of type II restriction endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 29 (18), 3705-3727 (2001).</li><li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy.">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1529 (2009).</li><li>Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+enzymes+replicating+DNA+using+a+single-molecule+DNA+stretching+assay.">Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1689 (2010).</li><li>Baldwin, G. S., Vipond, I. B., Halford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+reaction+analysis+of+the+catalytic+cycle+of+the+EcoRV+restriction+endonuclease.">Rapid reaction analysis of the catalytic cycle of the EcoRV restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 34 (2), 705-714 (1995).</li><li>Winkler, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal-structure+of+Ecorv+endonuclease+and+of+Its+complexes+with+cognate+and+non-cognate+DNA+fragments.">The crystal-structure of Ecorv endonuclease and of Its complexes with cognate and non-cognate DNA fragments.</a> EMBO Journal. 12 (5), 1781-1795 (1993).</li><li>Sioss, J. A., Stoermer, R. L., Sha, M. Y., Keating, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silica-coated,+Au/Ag+striped+nanowires+for+bioanalysis.">Silica-coated, Au/Ag striped nanowires for bioanalysis.</a> Langmuir. 23 (22), 11334-11341 (2007).</li></ol>

Het DNA-substraat voor deze test is gelabeld met een kwantumdot met behulp van een tweestapsreactieschema met behulp van sulfo-SMCC. Deze bifunctionele crosslinker bestaat uit een NHS-estergroep die kan reageren met een primair amine en een maleimidegroep die kan reageren met een sulfhydrylgroep20. De gethioleerde oligonucleotiden die worden gebruikt om het substraat voor te bereiden, worden in geoxideerde vorm verzonden. Het is belangrijk om ze te verkleinen en te zuiveren, zoals beschreven, voor...

Restrictie-endonucleasen (REases) zijn enzymen die sequentiespecifieke dubbelstrengsbreuken in DNA veroorzaken. De ontdekking van REases in de jaren 1970 leidde tot de ontwikkeling van recombinant-DNA-technologie, en deze enzymen zijn nu onmisbare laboratoriuminstrumenten voor genetische modificatie en manipulatie. Type II REases zijn de meest gebruikte enzymen in deze klasse, omdat ze DNA op een vaste locatie splitsen, hetzij binnen of in de buurt van hun herkenningssequentie. Er is echter veel variatie tussen de Type II REases, en ze zijn onderverdeeld in verschillende subtypen op basis van bepaalde enzymatische eigenschappen in plaats van te worden geclassificeerd op basis van hun evolutionaire relaties. Onder elk subtype zijn er frequente uitzonderingen op het classificatieschema en veel enzymen behoren tot meerdere subtypen2. Er zijn duizenden Type II-REases geïdentificeerd en honderden daarvan zijn in de handel verkrijgbaar.
Ondanks de diversiteit onder de Type II REases zijn er echter maar heel weinig REases in detail bestudeerd. Volgens REBASE, de restrictie-enzymendatabase die in 1975 door Sir Richard Roberts werd opgericht3, zijn gepubliceerde kinetische gegevens beschikbaar voor minder dan 20 van deze enzymen. Bovendien, hoewel sommige REases direct zijn waargenomen op het niveau van één molecuul terwijl ze langs het DNA diffundeerden voordat ze hun herkenningssequentie 4,5,6,7 tegenkwamen en eraan bonden, zijn er zeer weinig studies met één molecuul naar hun kinetiek van de splitsingsreactie. De bestaande studies rapporteren ofwel geen adequate statistieken om een gedetailleerde analyse uit te voeren van de variatie in de tijdstippen waarop enkelvoudige splitsingen plaatsvinden 8,9,10 of zijn niet in staat om de volledige verdeling van splijtingstijden11 vast te leggen. Dit type analyse kan de aanwezigheid van relatief langlevende kinetische tussenproducten aan het licht brengen en kan leiden tot een beter begrip van de mechanismen van REase-gemedieerde DNA-splitsing.
Op het niveau van één molecuul zijn biochemische processen stochastisch - de wachttijd voor een enkel exemplaar van het proces, τ, is variabel. Van veel metingen van τ kan echter worden verwacht dat ze gehoorzamen aan een kansverdeling, p(τ), die een indicatie geeft van het soort proces dat plaatsvindt. Bijvoorbeeld, een proces in één stap, zoals de afgifte van een productmolecuul uit een enzym, zal gehoorzamen aan de Poisson-statistieken, en p(τ) zal de vorm aannemen van een negatieve exponentiële verdeling:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq1v3.png">
waarbij β de gemiddelde wachttijd is. Merk op dat de snelheid van het proces, k, gelijk zal zijn aan 1/β, het omgekeerde van de gemiddelde wachttijd. Voor processen die meer dan één stap vereisen, zal p(τ) de convolutie zijn van de enkelvoudige exponentiële verdelingen voor elk van de afzonderlijke stappen. Een algemene oplossing voor de convolutie van N enkelvoudige exponentiële vervalfuncties met identieke gemiddelde wachttijden, β, is de gamma-kansverdeling:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq2v3.png">
waarin Γ(N) de gammafunctie is, die de interpolatie van de faculteit van N-1 naar niet-gehele waarden van N beschrijft. Hoewel deze algemene oplossing bij benadering kan worden gebruikt wanneer de gemiddelde wachttijden van individuele stappen vergelijkbaar zijn, moet worden begrepen dat de aanwezigheid van relatief snelle stappen zal worden gemaskeerd door stappen met aanzienlijk langere wachttijden. Met andere woorden, de waarde van N vertegenwoordigt een ondergrens voor het aantal stappen12. Met een adequaat aantal wachttijdmetingen kunnen de parameters β en N worden geschat door de gebeurtenissen samen te voegen en de gammaverdeling aan te passen aan het resulterende histogram of door gebruik te maken van een benadering op basis van maximale waarschijnlijkheid. Dit type analyse kan daarom de aanwezigheid van kinetische stappen aan het licht brengen die niet gemakkelijk kunnen worden opgelost in ensemble-assays en vereist een groot aantal observaties om parameters nauwkeurig te schatten12,13.
Dit artikel beschrijft een methode om quantum-dot-gelabeld DNA en totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie te gebruiken om honderden individuele REase-gemedieerde DNA-splitsingsgebeurtenissen parallel te observeren. Het ontwerp van de test maakt het mogelijk om de resultaten van verschillende experimenten samen te voegen en kan dwell-time-verdelingen maken die duizenden gebeurtenissen bevatten. De hoge fotostabiliteit en helderheid van kwantumdots maken een tijdresolutie van 10 Hz mogelijk zonder dat dit ten koste gaat van het vermogen om splitsingen waar te nemen die zelfs vele minuten na het begin van het experiment plaatsvinden. Goede temporele resolutie en een breed dynamisch bereik, gecombineerd met de mogelijkheid om een grote dataset te verzamelen, maken een nauwkeurige karakterisering van de verblijftijdverdelingen mogelijk om de aanwezigheid van meerdere kinetische stappen in de splitsingspaden van REases aan het licht te brengen, die omloopsnelheden hebben in het bereik van 1 min-1 . In het geval van EcoRV kunnen drie kinetische stappen worden opgelost, die allemaal op een andere manier zijn geïdentificeerd, wat bevestigt dat de test gevoelig is voor de aanwezigheid van dergelijke stappen.
Duplex-DNA-substraten die de herkenningssequentie van belang bevatten, worden geproduceerd door een gebiotinyleerd oligonucleotide te gloeien aan een complementaire streng die is gelabeld met een enkele, covalent gehechte halfgeleider nanokristal kwantumpunt. Deze substraten worden ingebracht in een stroomkanaal dat is gebouwd op een glazen dekglaasje met een gazon van polyethyleenglycol (PEG)-moleculen met een hoog moleculair gewicht die covalent aan het oppervlak zijn bevestigd. De DNA-substraten worden gevangen via een biotine-streptavidine-biotine-binding door een fractie van de PEG-moleculen die een biotine aan hun vrije uiteinde hebben. In TIRF-microscopie zorgt een vluchtige golf die exponentieel vervalt met de afstand tot de glas-vloeistofinterface voor verlichting; De penetratiediepte is in de orde van grootte van de golflengte van het gebruikte licht. Onder deze omstandigheden zullen alleen kwantumdots die aan het oppervlak zijn vastgemaakt door een DNA-molecuul dat op het gefunctionaliseerde glazen oppervlak is vastgelegd, worden opgewonden. Quantum dots die vrij in oplossing zijn, worden niet beperkt binnen het verlichte gebied en zullen daarom niet oplichten. Als het DNA dat een kwantumdot aan het oppervlak bindt, wordt gesplitst, zal die kwantumdot vrij zijn om weg te diffunderen van het oppervlak en zal het uit het fluorescentiebeeld verdwijnen.
Hoewel van veel Type II REases bekend is dat ze DNA binden in afwezigheid van magnesium14, hebben ze allemaal magnesium nodig om DNA-splitsing te mediëren15. Deze REases kunnen het aan het oppervlak geïmmobiliseerde DNA binden in afwezigheid van magnesium. Wanneer magnesiumhoudende buffer door een kanaal wordt gestroomd met REase vooraf gebonden aan het DNA, begint de splitsing onmiddellijk, zoals aangegeven door het verdwijnen van kwantumdots. De synchronisatie die wordt bereikt door de REase-moleculen voor te binden en vervolgens de DNA-splitsing te initiëren door magnesium te introduceren, vergemakkelijkt het meten van de vertragingstijd tot de voltooiing van de DNA-splitsing onafhankelijk voor elk molecuul in de populatie enzymen die in een experiment zijn waargenomen. Fluoresceïne wordt als tracerkleurstof opgenomen in de magnesiumhoudende buffer om de aankomst van magnesium in het gezichtsveld aan te geven. Aangezien er geen enzym is opgenomen in de magnesiumhoudende buffer, geeft de vertragingstijd vanaf de aankomst van de magnesiumhoudende buffer tot het verdwijnen van elke kwantumpunt de tijd aan die nodig is voor een REase die al aan het DNA is gebonden om het DNA te splitsen en de kwantumpunt van het glasoppervlak los te laten. Het verdwijnen van de kwantumdot gebeurt snel en resulteert in een scherpe afname van het intensiteitstraject, wat een duidelijke indicatie geeft van het tijdstip waarop een bepaald DNA-molecuul wordt gesplitst. De bepaling van gebeurtenistijden wordt bereikt door wiskundige analyse van intensiteitstrajecten, en een typisch experiment resulteert in honderden identificeerbare splitsingsgebeurtenissen. De resultaten van meerdere experimenten kunnen worden samengevoegd om adequate statistieken te verschaffen om een schatting van de parameters, N en β, mogelijk te maken door middel van niet-lineaire kleinste kwadraten of maximale waarschijnlijkheidsanalyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltriethoxysilane (APTS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440140-100ML</td>
			<td>Store in dessicator box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 Minute Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>20845</td>
			<td>use for sealing the microfluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>329000ACS</td>
			<td>use for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPXH Model 2800</td>
			<td>catalog number 15-337-410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, glass, 100 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>BIO-SVA-5K</td>
			<td>Succinimidyl valerate has a longer half-life than succinimidyl carbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated oligonucleotide</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom - see protocol for design considerations</td>
			<td>Request 5&#39; Biotin modification and HPLC purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0903-5G</td>
			<td>prepare a 10 mg/mL solution (aq) and heat to 95 &#176;C before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centri-Spin-10 Size Exclusion Spin Columns</td>
			<td>Princeton Separations</td>
			<td>CS-100 or CS-101</td>
			<td>used to purify thiolated oligonucleotides after reducing the disulfide bond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 1.5. mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 1-inch square glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslip holders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diamond point wheel</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>7134</td>
			<td>use for drilling holes in quartz flow cell topper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A39255</td>
			<td>No-Weigh Format, 7.7 mg/vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>drill press rotary tool workstation stand</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>220-01</td>
			<td>facilitates quartz drilling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV (REase used to generate example data)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195T or R0195M</td>
			<td>Use 100,000 units/mL stock to avoid adding excess glycerol Check REBASE for suppliers of other REases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>various</td>
			<td>CAS 64-17-5</td>
			<td>denatured or 95% are acceptable, use for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>BioUltra, anhydrous, store in dessicator box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flea Micro Spinbar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-513-65</td>
			<td>3 mm x 10 mm size to fit beneath coverslip rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescein</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>17324</td>
			<td>use to make experimental buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gravity convection oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9010-0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>handheld rotary multitool</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8220</td>
			<td>use for drilling holes in quartz flow cell topper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImagEM X2 EM-CCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-23B</td>
			<td>air cooling is adequate for this experiment, use HCImage software or similar to control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging spacer, double-sided, adhesive</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jar, glass with screw cap, (approximately 50 mm diameter by 50 mm high)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td>use to make experimental buffer with magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metal tweezers</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methoxy-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>M-SVA-5K</td>
			<td>Both PEGs should have the same NHS ester so that the rate of reaction is consistent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiposition magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC20818</td>
			<td>CAS 103-47-9, use to make CHES buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>orbital shaker and heater for microcentrifuge tubes</td>
			<td>Q Instruments</td>
			<td>1808-0506</td>
			<td>with 1808-1061 adaptor for 24 x 2.0 mL or 15 x 0.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE60 Polyethylene tubing (inner diameter 0.76 mm, outer diameter 1.22 mm)</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>6258917</td>
			<td>22 G blunt needles are a good fit for this tubing size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10x</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7059</td>
			<td>Use at 1x strength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH9262</td>
			<td>use a 1 M solution to clean coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q21521MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Slide, 1 inch square, 1 mm thick</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72250-10</td>
			<td>holes must be drilled in the corners for inlet and outlet tubing insertion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reinforced plastic tweezers</td>
			<td>Rubis</td>
			<td>K35a</td>
			<td>use for handling coverslips and building microfluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecureSeal Adhesive Sheets</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td>cut to form spacer for microfluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel syringe pump for microfluidics</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1002X-US</td>
			<td>fitted with a 50 mL syringe and a 22 G blunt needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-a-Lyzer MINI Dialysis Devices, 10 kDa MWCO, 0.1 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570 or 69572</td>
			<td>used for buffer exchange during quantum dot coupling to DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0320</td>
			<td>use to make buffer for surface functionalization; 100 mM, pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Macron</td>
			<td>7581-12</td>
			<td>use to make experimental buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic solution (BioUltra, 0.5 M in water)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>94046</td>
			<td>use to make 100 mM sodium phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic solution (BioUltra, 5M in water)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74092</td>
			<td>use to adjust pH of 100 mM sodium phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin from Streptomyces avidinii</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4762</td>
			<td>dissolve at 1 mg/mL and store 25 mL aliqouts at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A39268</td>
			<td>No-Weigh Format, 2 mg/vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe fitted with blunt 21 G needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thiolated oligonucleotide</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom - see protocol for design considerations</td>
			<td>Request 5&#39; Thiol Modifier C6 S-S and HPLC purificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF imaging system with 488 nm laser illumination</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>custom built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris -HCl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60050</td>
			<td>use to make experimental buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4101</td>
			<td>use to make experimental buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td>use to make blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash-N-Dry Coverslip Rack</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70366-16</td>
			<td>used for surface functionalization of coverslips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule dwell-time analysis of restriction endonuclease-mediated dna cleavage

Deze nieuwe op fluorescentie gebaseerde test op basis van totale interne reflectie vergemakkelijkt de gelijktijdige meting van de lengte van de katalytische cyclus voor honderden individuele restrictie-endonuclease (REase) -moleculen in één experiment. Deze test vereist geen eiwitetikettering en kan worden uitgevoerd met een enkel beeldvormingskanaal. Bovendien kunnen de resultaten van meerdere individuele experimenten worden samengevoegd om goed bevolkte verblijftijdverdelingen te genereren. Analyse van de resulterende verblijftijdverdelingen kan helpen het DNA-splitsingsmechanisme op te helderen door de aanwezigheid van kinetische stappen te onthullen die niet direct kunnen worden waargenomen. Voorbeeldgegevens verzameld met behulp van deze test met het goed bestudeerde REase, EcoRV - een dimeer Type IIP-restrictie-endonuclease dat de palindroomsequentie GAT↓ATC splitst (waarbij ↓ de snijplaats is) - komen overeen met eerdere studies. Deze resultaten suggereren dat er ten minste drie stappen zijn in de weg naar DNA-splitsing die wordt geïnitieerd door magnesium te introduceren nadat EcoRV DNA bindt in zijn afwezigheid, met een gemiddelde snelheid van 0,17 s-1 voor elke stap.

De flowcel is direct gekoppeld aan een olie-immersieobjectief met een hoge numerieke apertuur en een vergroting van 60x op een omgekeerde microscoop die is uitgerust met laserverlichting voor TIRF-beeldvorming door middel van objectieven (Figuur 5A). Na het introduceren van het DNA-substraat en het wegspoelen van overtollig DNA en kwantumdots, zijn er doorgaans duizenden individuele kwantumdots in een gezichtsveld (Figuur 5B). Deze kwantumdots zijn stabiel beves...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage at JoVE.com

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

Met behulp van kwantum-dot-gelabeld DNA en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie kunnen we het reactiemechanisme van restrictie-endonucleasen onderzoeken met behulp van niet-gelabeld eiwit. Deze techniek met één molecuul maakt massaal gemultiplexte observatie van individuele eiwit-DNA-interacties mogelijk, en gegevens kunnen worden samengevoegd om goed bevolkte verblijftijdverdelingen te genereren.

Single-molecule dwell-time analyse van restrictie endonuclease-gemedieerde DNA-splitsing

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Met dit protocol kunnen we direct plaatsspecifieke DNA-splitsing waarnemen door restrictie-endonucleasen op het niveau van één molecuul. Onze gemultiplexte aanpak stelt ons in staat om de tijd te meten die honderden individuele REases nodig hebben om de katalytische cyclus te voltooien. Multiplexing stelt ons in staat om goed bevolkte verblijftijd tot splitsingsverdelingen te genereren die we kunnen aanpassen aan de gamma-waarschijnlijkheidsverdeling om inzicht te krijgen in het mechanisme van DNA-splitsing.Begin met het bereiden van een vers buisje voor elke geresuspendeerde oligonucleotide op 50 microliter van de oligonucleotide en 50 microliter vers bereide DTT-oplossing in elke buis, pipet op en neer om te mengen en 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Pipeteer het volledige volume van elk monstermengsel voorzichtig op een voorbereide kolom en centrifugeer gedurende twee minuten bij 750G. Bewaar na het centrifugeren alle monsters die niet onmiddellijk worden gebruikt bij 20 graden Celsius om oxidatie van de thiolgroepen en de vorming van disulfidebindingen te voorkomen.Pipetteer een aliquot van 50 microliter van de quantum dot-voorraad in een dialyseapparaat voor elke te maken constructie, en zorg ervoor dat u het membraan niet aanraakt met de pipetpunt. Dialyseer tegen een volume CHES-buffer dat ten minste 1.000 keer het monstervolume is met roeren bij 100 RPM gedurende 15 minuten. Haal met behulp van een pipetter de zwevende quantum dots voorzichtig uit het dialyseapparaat en breng ze over in een verse buis met een gelijk volume vers bereide Sulfo-SMCC-oplossing, pipetteren op en neer om te mengen.Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met schudden bij 1.000 RPM om de Sulfo-SMCC te laten reageren met de primaire aminen op de kwantumdots. Gebruik vervolgens een pipetter om elk monster voorzichtig over te brengen in een nieuw dialyseapparaat. Om overtollig sulfo-SMCC te verwijderen, dialyseert u gedurende 15 minuten tegen een volume CHES-buffer dat ten minste 1.000 keer het volume in het dialyseapparaat is.Vervang de buffer twee keer en voer in totaal drie keer dialyse uit met een verse CHES-buffer, zodat de dialyse na elke bufferwisseling 15 minuten kan doorgaan. Herhaal dan de dialyse met PBS. Haal met behulp van een pipetter voorzichtig de oplossing met de kwantumdots uit het dialyseapparaat en breng elk monster over in een vers buisje met een equimolaire hoeveelheid gedilateerd oligonucleotide verdund in PBS.Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met schudden bij 1.000 RPM. Voeg BSA toe aan elk monster voor een eindconcentratie van 0,5 milligram per milliliter. Gebruik vervolgens een pipetter om elk monster voorzichtig over te brengen in een nieuw dialyseapparaat en dialyseer tegen de opslagbuffer.Herstel na de dialyse voorzichtig elk monster en plaats het in een verse buis. Bewaar de monsters bij 4 graden Celsius. Combineer een monster van quantum dot-gelabelde oligonucleotiden met een tienvoudige molaire overmaat aan gebiotinyleerd oligonucleotide.Verwarm het mengsel in een warmteblok tot 75 graden Celsius en houd het 5 minuten op die temperatuur. Zet vervolgens het warmteblok uit en laat het mengsel langzaam afkoelen. Bewaar de voltooide constructie bij 4 graden Celsius Boor met behulp van een draagbare roterende multitool die is uitgerust met een taps toelopende diamantpuntschijf twee gaten in tegenoverliggende hoeken van de kwartsschuif om als in- en uitlaat te dienen.Zorg ervoor dat de slede op zijn plaats blijft zitten, smeer het bit en glijd constant met water tijdens het boren. Herstel na elk experiment het voorbereide kwartsglaasje door het gebruikte apparaat in aceton te weken om de lijm en epoxy op te lossen. Gooi de resterende onderdelen weg.Combineer 25 microliter streptavidine-oplossing met 80 microliter PBS en 20 microliter blokkeerbuffer. Smeer een met PEG behandelde dekstrook in met dit mengsel en incubeer gedurende 30 minuten in een vochtige omgeving. Bereid tijdens de incubatie van de afdekstrook de beeldafstandhouder voor om een stroomkanaal te creëren.Snijd een vierkant stuk beeldvormingsafstandsmateriaal van 1 inch en markeer vervolgens een 2 millimeter breed kanaal dat is uitgelijnd met de uiteinden van de gaten die in het kwartsglaasje zijn geboord. Snijd het kanaal met een scalpel uit het afstandsmateriaal. Reinig het kwartsglaasje grondig met aceton om eventuele lijmresten van eerdere experimenten te verwijderen.Trek één kant van de achterkant van de afstandhouder en plaats deze voorzichtig op de kwartsgeleider, zorg ervoor dat u de inlaat- en uitlaatgaten niet bedekt. Was het afdekglaasje met water en droog het af met perslucht. Verwijder de andere kant van de achterkant van het afstandsstuk voor beeldvorming en klem deze met een plastic pincet tussen het kwartsglaasje en het functionele streptavidine-gecoate afdekglaasje om het geheel samen te drukken en luchtbellen van de lijm te verwijderen.Snijd het uiteinde van de slang schuin af om een vrije doorstroming van de oplossing te garanderen. Steek vervolgens een 30 centimeter lange polyethyleen slang in elk gat in het kwartsglaasje. Houd de buizen op hun plaats met een buizenrek en gebruik vervolgens epoxy om de buizen op hun plaats en de randen van het gemonteerde apparaat af te dichten.Zodra de epoxy is uitgehard, steekt u de stompe naald op een lege spuit in de uitlaatslang van het apparaat en dompelt u het uiteinde van de inlaatbuis onder in een bak gevuld met de blokkeerbuffer. Trek de zuiger van de spuit naar achteren om het apparaat te vullen met een blokkeerbuffer. Laat het apparaat vervolgens ten minste 30 minuten incuberen voordat u het gebruikt.Bevestig het microfluïdische apparaat met tape aan de plaat van de microscooptafel. Breng het objectief in contact met de onderkant van het apparaat en plaats het objectief zo dat het gezichtsveld zich binnen het microfluïdische kanaal bevindt. Nadat u de uitlaatslang op de spuitpomp hebt aangesloten, spoelt u het microfluïdische kanaal door met een verse blokkeerbuffer door de zuiger van de spuit terug te trekken.Controleer of er geen luchtbellen in de slang of in het kanaal vastzitten. Verdun 1 microliter van het bereide DNA-substraat tot 1 milliliter blokkeerbuffer. Plaats de inlaatbuis in het verdunde DNA-substraat en laat 800 microliter van de substraatoplossing door het kanaal stromen met een snelheid van 200 microliter per minuut.Laat de DNA-oplossing 15 minuten in het kanaal incuberen nadat de stroom is gestopt. Na de incubatie stroomt u ten minste 800 microliter blokkeerbuffer door het kanaal met een snelheid van 200 microliter per minuut om het ongebonden DNA uit het kanaal te spoelen. Pas de focus van de microscoop aan zodat de aan het oppervlak gebonden quantum dots duidelijk zichtbaar zijn.Spoel het microfluïdische apparaat met 800 microliter experimentele buffer zonder magnesium met een stroomsnelheid van 200 microliter per minuut. Voeg de REase toe aan een aliquot experimentele buffer zonder magnesium en meng voorzichtig door te pipetteren. Laat 800 microliter van 400 eenheden per milliliter EcoRV door het kanaal stromen met een debiet van 200 microliter per minuut.Start het experiment door de experimentele buffer met magnesium en fluoresceïne te laten stromen met een stroomsnelheid van 200 microliter per minuut. Begin direct na het starten van de spuitpomp met het vastleggen van gegevens. Stop de gegevensverzameling na het stromen van 800 microliter buffer.Na het introduceren van het DNA-substraat in de stroomcel en het wegspoelen van overtollig DNA en kwantumdots, zijn er meestal duizenden individuele kwantumpunten in een gezichtsveld. Ze zijn stabiel bevestigd aan het glasoppervlak en ondergaan tijdens het experiment geen merkbare dimming of significante bleking. Wanneer het REase door het kanaal is gestroomd in afwezigheid van magnesium, is ten minste 95% van de kwantumdots die aan het begin van het experiment aanwezig waren, nog steeds te zien aan het einde van de observatieperiode.Wanneer de magnesiumhoudende buffer echter onmiddellijk na de REase wordt gestroomd, verdwijnt tot de helft van de kwantumdots aan het einde van de observatieperiode, vergelijkbaar met wat wordt waargenomen wanneer REase en magnesium samen door het kanaal worden gestroomd. Het verdwijnen van de kwantumdot gebeurt snel en resulteert in een scherpe afname van het intensiteitstraject, wat een duidelijke indicatie geeft van het tijdstip waarop een bepaald DNA-molecuul wordt gesplitst. Dit experiment werd uitgevoerd met het goed bestudeerde type II P REase EcoRV.Zowel de niet-lineaire kleinste kwadratencurve-aanpassing als de schatting van de maximale waarschijnlijkheidsparameter werden gebruikt om de waarden van n en bèta uit de gegevens te extraheren. De twee methoden voor het schatten van parameters waren in overeenstemming. Met behulp van de niet-lineaire kleinste kwadraten fit, was n 3,52 en bèta 5,78 seconden.Met behulp van de maximale waarschijnlijkheidsschatting was n 3,41 en bèta 6,06 seconden. Deze test kan bewijs leveren voor de aanwezigheid van tussenstappen langs het splitsingspad. Het uitvoeren van deze test onder veranderende reactieomstandigheden kan helpen bij het vaststellen van de aard van reactietussenproducten die niet direct kunnen worden waargenomen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Een eenvoudige, robuuste en hoge doorvoer enkel molecuul Flow uitrekkende Assay uitvoering voor de studie van vervoer van moleculen langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Single-molecuul manipulatie van G-quadruplexes door magnetische pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Bepalen als DNA gekleurd met een Cyanine kleurstof kan worden verteerd met enzymen van de beperking

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Een in vitro single-molecule imaging assay voor de analyse van cap-afhankelijke vertaalkinetiek

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study van ribosoom eiwitsynthese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Single-molecule Imaging van EWS-FLI1 condensaten assembleren op DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...