Name: contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection
Uploaded: 2021-02-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

نود أن نشكر موظفي الأبحاث في قسم NUS لطب الأنف والأذن والحنجرة وقسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة على مساعدتهم في العمل المتعلق بثقافة hNEC والثقافة الفيروسية. كما نود أن نشكر الجراحين والفريق الجراحي في مستشفى الجامعة الوطنية ، قسم طب الأنف والأذن والحنجرة ، على مساعدتهم في توفير عينات الخلايا والدم المطلوبة للدراسة. تم تمويل هذه الدراسة من قبل المجلس الوطني للبحوث الطبية ، سنغافورة رقم. NMRC/CIRG/1458/2016 (إلى دي يون وانغ) ووزارة الصحة-OFYIRG19may-0007 (إلى كاي سين تان). كاي سين تان هو حاصل على دعم الزمالة من الزمالة الأوروبية للحساسية والمناعة السريرية (EAACI) 2019.

ملاحظة: ارجع إلى الجدول 1 للاطلاع على وصفات الوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول. ملاحظة: تم العثور على hNECS المزروعة على 12 بئرا ترانسويل تنمو لتصبح سماكة أكثر مثالية للعوامل القابلة للذوبان للوصول إلى الغرفة القاعدية بسهولة عند الإصابة بفيروس الأنفلونزا. ومن ثم يوصى باستخدام 12 ب?...

<ol>
	<li>Monto, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+and+antiviral+drugs+in+pandemic+preparedness.">Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).</li><li>Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+for+the+next+pandemic.">Preparing for the next pandemic.</a> The British Medical Journal. 346, 364 (2013).</li><li>Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+annual+production+cycle+for+influenza+vaccine.">The annual production cycle for influenza vaccine.</a> Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).</li><li>Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+burden+of+seasonal+influenza+in+the+United+States.">Economic burden of seasonal influenza in the United States.</a> Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).</li><li>Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+and+globalization.">COVID-19 and globalization.</a> One Health. 9, 100132 (2020).</li><li>Guo, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+transmission+and+clinical+therapies+on+coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+outbreak+-+an+update+on+the+status.">The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status.</a> Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).</li><li>Guan, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics+of+coronavirus+disease+2019+in+China.">Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China.</a> New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+are+activated+during+human+viral+infections.">MAIT cells are activated during human viral infections.</a> Nature Communications. 7, 11653 (2016).</li><li>Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammadelta+T+cells:+first+line+of+defense+and+beyond.">Gammadelta T cells: first line of defense and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+contribute+to+protection+against+lethal+influenza+infection+in+vivo.">MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo.</a> Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).</li><li>Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+layers+of+heterogeneity+and+subset+diversity+in+human+MAIT+cell+responses+to+distinct+microorganisms+and+to+innate+cytokines.">Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+cells+derived+from+multiple+individuals+exhibit+differential+responses+to+H3N2+influenza+virus+infection+in+vitro.">Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).</li><li>Luukkainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+co-culture+model+of+PBMC+and+stem+cell+derived+human+nasal+epithelium+reveals+rapid+activation+of+NK+and+innate+T+cells+upon+Influenza+A+virus+infection+of+the+nasal+epithelium.">A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+H3N2+influenza+virus-infected+human+nasal+epithelial+cells+from+multiple+subjects+reveals+molecular+pathways+associated+with+tissue+injury+and+complications.">RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications.</a> Cells. 8 (9), 986 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+lipopolysaccharide+on+diesel+exhaust+particle-induced+junctional+dysfunction+in+primary+human+nasal+epithelial+cells.">Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells.</a> Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).</li><li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+fully+differentiated+human+nasal+epithelial+cells+infected+with+rhinovirus+reveals+epithelium-initiated+immune+responses.">In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses.</a> Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomic+and+metagenomic+analyses+of+influenza+virus-infected+nasal+epithelial+cells+from+multiple+individuals+reveal+specific+nasal-initiated+signatures.">Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).</li><li>Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay">https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay</a> (2020)</li><li>Gamage, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+nasal+epithelial+cells+with+SARS-CoV-2+and+a+382-nt+deletion+isolate+lacking+ORF8+reveals+similar+viral+kinetics+and+host+transcriptional+profiles.">Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).</li><li>Zhao, X. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+nasal+epithelial+stem/progenitor+cells+to+produce+functioning+ciliated+cells+in+vitro.">The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro.</a> American Journal of Rhinology &amp; Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).</li></ol>

الاستجابات المناعية الفطرية ضد الفيروسات هي مجال دراسة غير مدروس في الإدارة المضادة للفيروسات. تعمل الخلايا الظهارية في مجرى الهواء والخلايا المناعية الفطرية بشكل متضافر لقمع التكاثر الفيروسي أثناء العدوى ، إلى جانب العمل كمحدد للاستجابة التكيفية المفرطة النشاط إذا لم يتم الاحتفاظ بال...

ربما تكون فيروسات الجهاز التنفسي من بين مسببات الأمراض الأكثر انتشارا التي تسبب الرعاية الصحية الشديدة والعبء الاقتصادي. وتشكل الفيروسات، بدءا من الفاشيات العالمية الدورية للسلالات الوبائية الناشئة (مثل H1N1 وH5N1 وH3N2 وMERS وCOVID-19) إلى السلالات الموسمية للإنفلونزا كل عام، تشكل الفيروسات تهديدا مستمرا للصحة العمومية. وعلى الرغم من أن اللقاحات تشكل الجزء الأكبر من الاستجابة لهذه التحديات العالمية في مجال الصحة العامة، فمن الواقعي أن نلاحظ أن هذه التدابير المضادة تستجيب فقطبنسبة 1,2. وعلاوة على ذلك، فإن التأخير بين ظهور سلالة معدية جديدة والتطوير الناجح للقاحها أمر لا مفر منه3، مما يؤدي إلى فترة تكون فيها التدابير المتاحة للحد من انتشار الفيروس محدودة للغاية.
ومما يزيد من تأكيد هذه التأخيرات التكاليف التي تلحق بالمجتمع اقتصاديا واجتماعيا. الإنفلونزا الموسمية وحدها مسؤولة عن ما يقرب من 8 مليارات دولار من التكاليف غير المباشرة ، و 3.2 مليار دولار من التكاليف الطبية ، و 36.3 ألف حالة وفاة في الولايات المتحدة الأمريكية سنويا4. هذا قبل النظر في تكاليف البحث اللازمة لتمويل تطوير اللقاحات. وللفاشيات الوبائية آثار أشد حدة على المجتمع، يضاعفها تزايد معدل العولمة كل عام، كما يتضح من الاضطرابات العالمية الناجمة عن ظهور الفيروس التاجي 2 (SARS-CoV-2) (SARS-CoV-2) وانتشاره السريع.
أظهرت الدراسات الحديثة أن المرضى المصابين الذين لديهم عدد أكبر من الخلايا التائية الفطرية المنشطة يميلون إلى الحصول على نتيجة أفضل للمرض 8,9,10. علاوة على ذلك ، يتم تصنيف مجموعة الخلايا التائية الفطرية إلى مجموعات فرعية متعددة: الخلايا التائية الثابتة المرتبطة بالغشاء المخاطي (MAIT) ، والخلايا التائية Vδ1 γδ ، والخلايا التائية Vδ2 γδ ، والخلايا التائية القاتلة الطبيعية (NKT). تظهر هذه المجموعات الفرعية من الخلايا التائية الفطرية أيضا عدم تجانس داخل سكانها ، مما يزيد من تعقيد التفاعلات بين مجموعات الخلايا المشاركة في الاستجابة المناعية الفطرية11. وبالتالي ، فإن الآلية التي تنشط هذه الخلايا التائية الفطرية ومعرفة المجموعات الفرعية المحددة من الخلايا التائية الفطرية قد توفر وسيلة مختلفة للبحث للحد من الآثار المعدية لهذه الفيروسات على المضيف البشري ، خاصة خلال فترة تطوير اللقاح.
تنتج الخلايا الظهارية المصابة بالإنفلونزا عوامل تنشط الخلايا التائية الفطرية بسرعة12،13،14. وبناء على هذه النتيجة، يهدف نموذج الاستزراع المشترك للواجهة السائلة الهوائية (ALI) الخالي من التلامس إلى محاكاة التفاعلات الكيميائية المبكرة (التي تتوسطها العوامل القابلة للذوبان التي تطلقها الطبقة الظهارية المصابة) بين الطبقة الظهارية الأنفية المصابة و PBMCs أثناء العدوى المبكرة. إن الفصل المادي بين الطبقة الظهارية الأنفية (المستزرعة على إدخالات الغشاء) و PBMCs (في الغرفة الموجودة تحتها) والسلامة الظهارية يمنع العدوى المباشرة ل PBMCs بواسطة الفيروس ، مما يسمح بإجراء دراسة مفصلة لآثار العوامل القابلة للذوبان المشتقة من الظهارة على PBMCs. وبالتالي يمكن إجراء مزيد من التحقيق في العوامل المحددة لإمكاناتها العلاجية في تحفيز مجموعة الخلايا التائية الفطرية المناسبة التي قد تحمي من عدوى الأنفلونزا. لذلك قامت هذه الورقة بتفصيل طرق إنشاء ثقافة مشتركة لدراسة تنشيط الخلايا التائية الفطرية من العوامل القابلة للذوبان المشتقة من الظهارة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120086</td>
			<td>1.5mL Centrifuge Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366643</td>
			<td>10mL Blood Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3460</td>
			<td>membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120094</td>
			<td>2 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-l-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>533998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes (flow tubes)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-4-62 Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810709008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel CL-611</td>
			<td>FMC Biopolymer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Liquid Overlay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc</td>
			<td>171STND01</td>
			<td>Multiplex Manager Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly Needle 21 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>367287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>554722</td>
			<td>Fixation and Permeabilization Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Neutral Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTP Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM voltohmmeter device</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>1x Lysing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>188271</td>
			<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 50 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>227261</td>
			<td>50 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Start Essential DNA Probes Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6402682001</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Premium</td>
			<td>Research Instruments</td>
			<td>17544203</td>
			<td>Density Gradient Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 (A/Aichi/2/1968)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hNESPCs</td>
			<td>Human Donors</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Epithelial Growth Factor</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>7925</td>
			<td>Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>qPCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex</td>
			<td>Merck Pte Ltd</td>
			<td>HCP2MAG-62K-PX23</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1705</td>
			<td>RT-PCR 5x Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1706</td>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>554723</td>
			<td>Permeabilization Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10x Supplement</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>Random Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RNase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Part of 52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STX2 electrodes</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td>Electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Shaped 96-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection

لا تزال التفاعلات المبكرة بين الطبقة الظهارية الأنفية والخلايا المناعية الفطرية أثناء الالتهابات الفيروسية منطقة غير مستكشفة. زادت أهمية إشارات المناعة الفطرية في الالتهابات الفيروسية بشكل كبير حيث أظهر المرضى الذين يعانون من التهابات الجهاز التنفسي الذين يظهرون تنشيطا فطريا عاليا للخلايا التائية نتيجة أفضل للمرض. وبالتالي ، فإن تشريح هذه التفاعلات المناعية الفطرية المبكرة يسمح بتوضيح العمليات التي تحكمها وقد يسهل تطوير أهداف واستراتيجيات علاجية محتملة لتثبيط أو حتى منع التقدم المبكر للعدوى الفيروسية. يفصل هذا البروتوكول نموذجا متعدد الاستخدامات يمكن استخدامه لدراسة الأحاديث المتقاطعة المبكرة والتفاعلات وتنشيط الخلايا المناعية الفطرية من العوامل التي تفرزها الخلايا الظهارية المصابة بمجرى الهواء الفيروسي. باستخدام فيروس الأنفلونزا H3N2 (A/Aichi/2/1968) كنموذج فيروسي تمثيلي، تم تحليل التنشيط الفطري للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي المستزرع (PBMCs) باستخدام قياس التدفق الخلوي للتحقيق في المجموعات الفرعية للخلايا التي يتم تنشيطها بواسطة العوامل القابلة للذوبان التي يتم إطلاقها من الظهارة استجابة للعدوى الفيروسية. وتظهر النتائج استراتيجية البوابات للتمييز بين المجموعات الفرعية للخلايا وتكشف عن الاختلافات الواضحة بين المجموعات المنشطة من PBMCs وحديثها المتبادل مع الظهارة الضابطة والمصابة. يمكن بعد ذلك تحليل المجموعات الفرعية المنشطة لتحديد وظائفها وكذلك التغيرات الجزيئية الخاصة بالخلايا. قد تكشف النتائج المستخلصة من مثل هذا التحقيق المتبادل عن عوامل مهمة لتنشيط مجموعات الخلايا الفطرية الحيوية ، والتي تكون مفيدة في السيطرة على تطور العدوى الفيروسية وقمعها. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه العوامل عالميا على الأمراض الفيروسية المختلفة، وخاصة على الفيروسات الناشئة حديثا، لتخفيف تأثير هذه الفيروسات عندما تنتشر لأول مرة في مجموعات بشرية ساذجة.

على الرغم من أن الخلايا التائية التقليدية تشكل الذخيرة الرئيسية للاستجابة المناعية التكيفية ضد العدوى الفيروسية لتسهيل التطهير الفيروسي ، إلا أن مجموعة الخلايا التائية الفطرية تعمل عبر طيف أوسع لقمع الحمل الفيروسي من أجل إزالة فعالة في مرحلة لاحقة. لذلك ، يخلق هذا البر...

Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection

يفصل هذا البروتوكول التحقيق في التفاعلات المبكرة بين الخلايا الظهارية الأنفية المصابة بالفيروس وتنشيط الخلايا الفطرية. يمكن تمييز المجموعات الفرعية الفردية من الخلايا المناعية بناء على تنشيطها استجابة للعدوى الفيروسية. ويمكن بعد ذلك إجراء مزيد من التحقيقات لتحديد آثارها على الاستجابات المبكرة المضادة للفيروسات.

نموذج الزراعة المشتركة الخالية من التلامس لدراسة تنشيط الخلايا المناعية الفطرية أثناء عدوى فيروس الجهاز التنفسي

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The ...

تم تصميم هذا البروتوكول للتحقيق في الحديث المتبادل للخلايا الظهارية والخلايا المناعية الفطرية من الخط الأول ، وتحديدا الخلايا التائية الفطرية ، وهو ما يهمنا. يتم استخدام الخلايا الأولية من المصادر البشرية في هذه التقنية ، مما يسمح بالتحقيق الفردي في الحديث المتبادل الفسيولوجي ذي الصلة بما يحدث في البشر. تورطت الخلايا التائية الفطرية في تحسين بقاء المرضى المصابين بالأنفلونزا على قيد الحياة.معرفة كيفية تنشيطها يمكن أن تساعد في تطوير العلاج المضاد للإنفلونزا والفيروسات. تم تصميم هذه الطريقة لتحديد العوامل التي يمكن أن تنشط الخلايا التائية الفطرية ، والتي قد تساعد في تطوير تدابير وقائية ضد عدوى فيروس الجهاز التنفسي. في اليوم صفر ، تصيب الخلايا الظهارية الأنفية البشرية ، أو HNECs.أولا ، عد الخلايا عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من 1x trypsin EDTA إلى الغرفة القمية لإدراج الغشاء و 350 ميكرولتر من 1x trypsin EDTA إلى الغرفة القاعدية للبئر التمثيلي. احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أو حتى تنفصل الخلايا عن الغشاء. اغسل الخلايا على الغشاء عن طريق السحب لأعلى ولأسفل وجمع التعليق في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر.أضف 200 ميكرولتر من DMEM لإخماد نشاط التربسين. ثم عد الخلايا عن طريق تلطيخ التربان الأزرق. احسب التعدد المطلوب للعدوى ، أو MOI ، للفيروس بناء على عدد الخلايا لكل بئر.تمييع مخزون الفيروس وفقا لذلك مع RPMI الكامل على الجليد. بالنسبة للآبار المتبقية لتجربة العدوى ، أضف 1x DPBS إلى الغرف القمية لإدراج الغشاء. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وإزالة 1x DPBS.قم بتغيير الوسط القاعدي في إدخالات الغشاء لإكمال وسط RPMI عن طريق نقل الإدخالات إلى لوحة جديدة مع إضافة RPMI كاملة إلى الآبار. أضف لقاح الفيروس المحضر إلى الغرفة القمية لإدراج الغشاء. احتضان في 35 درجة مئوية في جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة وإزالة التلقيح الفيروسي من الغرفة القمي.قم بتغيير الوسط القاعدي لإدراج الغشاء إلى وسط RPMI طازج واحتضنه عند 35 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة 24 إلى 72 ساعة. زرع العدد المطلوب من خلايا الدم الطرفية أحادية النواة ، أو PBMCs ، في وسط RPMI كامل عن طريق إضافة تعليق PBMC مباشرة إلى الغرفة القاعدية لكل بئر من HNECs المصابة من اليوم صفر. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة.لجمع السوبرناتانت القمي ، أضف 1x DBPS إلى كل غرفة قمية واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم ، جمع DPBS في أنابيب 1.5 ملليلتر. Aliquot supernatant لفحص البلاك في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر وتجميد كل من المخزون و aliquots على الفور عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.لجمع HNECs على شكل الحمض النووي الريبي ، انقل إدراج الغشاء إلى بئر نظيف. أضف المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي إلى الغرفة القمية واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. جمع supernatant في أنبوب جهاز طرد مركزي 1.5 ملليلتر وتخزينه في ناقص 80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي للتحليل الجزيئي.وأخيرا، قم بحصاد PBMCs عن طريق كشط سطح البئر بلطف باستخدام القاعدة العريضة لطرف ماصة معقم لإزاحة PBMCs المنشطة التي قد تكون ملتصقة بسطح البئر. اجمع الوسط القاعدي الذي يحتوي على PBMCs في أنبوب طرد مركزي سعة مليلترين. اغسل الآبار مرتين ب 300 ميكرولتر من 1x DPBS وجمع الغسيل في نفس الأنبوب سعة ملليلترين.الطرد المركزي للأنبوب سعة مليلترين وجمع السوبرناتانت في أنبوب جديد سعة مليلترين دون إزعاج بيليه الخلية. قم بتخزين السوبرناتانت المستنشق عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لتحليل السيتوكين والكيموكين. أعد تعليق بيليه الخلية المتبقية في 200 ميكرولتر من 1x DPBS.يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة الخلايا التائية الفطرية بعد الإصابة بالأنفلونزا دون الحاجة إلى خلايا ظهارية ومناعية من نفس المتبرع. تظهر عينة من التقدم المتوقع ل HNESPCs أثناء نموها على طبقة التغذية 3T3 هنا. تم استخدامها للتمايز في ثقافة واجهة الهواء / السائل للحصول على HNECs متعددة الطبقات مع خلايا وظيفية وهدبية وكأسية.باستخدام HNECs ، يمكن التحقيق في تنشيط الخلايا التائية الفطرية باستخدام قياس التدفق الخلوي. تظهر هذه النتائج الكشف عن الخلايا الثابتة المرتبطة بالغشاء المخاطي T ، أو خلايا MAIT ، وخلايا V delta one ، وخلايا gamma delta T ، والخلايا القاتلة الطبيعية T ، أو NKT. وقد زادت هذه الخلايا زيادة كبيرة في الزراعة المشتركة التي تشمل HNECs المصابة بفيروس الأنفلونزا.يمكن بعد ذلك تطبيق هذا الإعداد على سلالات فيروس الأنفلونزا الأخرى ، أو مجموعات الخلايا المناعية الفطرية لمراقبة تنشيطها في ظل ظروف الزراعة المشتركة مع الخلايا الظهارية المصابة. يعد الحساب الدقيق لعدد الخلايا الظهارية الأنفية البشرية لضمان استخدام التكاثر الصحيح للعدوى أمرا مهما للمستويات المثلى وتوقيت التنشيط. يكتسب الحديث المتبادل بين الخلايا الظهارية والخلايا المناعية الفطرية اهتماما متزايدا ، ويمكن تطبيق ذلك بشكل أكبر على أي طرق أخرى تنطوي على علم المناعة التنفسي الحاد أو المزمن.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

الكمي للاستجابة انفجر الجهاز التنفسي باعتبارها مؤشر الفطري المناعي الصحة في الزرد

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

جيل من العقدة الليمفاوية الدسم سادة الوهم لدراسة العقدة الليمفاوية اللحمية خلية المنشأ

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في الاستجابة المناعية الفطرية في الفأر الضامة

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

في تحليل المختبر من الاستجابة المناعية الخلوية بوساطة Myd88 لفيروس غرب النيل المسخ سلالة العدوى

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

التصوير غير الغازية من الاستجابة المناعية الفطرية في نموذج الزرد يرقات<em&gt; العقدية iniae</em&gt; العدوى

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

نموذج السابقين فيفو الابتدائي بورسال خلية ثقافة دجاج لدراسة الأمراض المعدية بورسال الفيروسات المرضية

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

نموذج الماوس لتقييم الفطرية الاستجابة المناعية للعدوى المكوّرات العنقودية الذهبية

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

نموذج الإدارة عن طريق الفم Galleria mellonella للاستجابات المناعية الفطرية Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

عزل الخلايا أحادية النوى اللوزتين لدراسة استجابات المناعة الفطرية Ex Vivo في الأنسجة اللمفاوية المخاطية البشرية

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...