Name: contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection
Uploaded: 2021-02-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

Vi vil gerne takke forskerstaben i NUS Otolaryngologisk Afdeling og Institut for Mikrobiologi og Immunologi for deres hjælp med hNEC kultur- og viruskulturrelateret arbejde. Vi vil også gerne takke kirurgerne og det kirurgiske team på Rigshospitalet, Otolaryngologisk Afdeling, for deres hjælp med at levere de celle- og blodprøver, der kræves til undersøgelsen. Denne undersøgelse blev finansieret af National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (til De Yun Wang) og MOH-OFYIRG19may-0007 (til Kai Sen Tan). Kai Sen Tan er modtager af stipendiestøtte fra European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.

BEMÆRK: Se tabel 1 for opskrifter af medier, der anvendes i denne protokol. BEMÆRK: hNECS dyrket på 12-brønds transwell har vist sig at vokse til mere optimal tykkelse for opløselige faktorer til let at nå basalkammeret, når de er inficeret med influenzavirus. Derfor anbefales brug af 12-brønds størrelse transwell til co-kultur.
1. Etablering af 3T3-føderlaget
<ol><li>Etablering fra frosne lagre<ol>
<li>Optø et kryovial af NIH / 3T3 fibroblaster fra frosne lagr...

<ol>
	<li>Monto, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+and+antiviral+drugs+in+pandemic+preparedness.">Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).</li><li>Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+for+the+next+pandemic.">Preparing for the next pandemic.</a> The British Medical Journal. 346, 364 (2013).</li><li>Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+annual+production+cycle+for+influenza+vaccine.">The annual production cycle for influenza vaccine.</a> Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).</li><li>Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+burden+of+seasonal+influenza+in+the+United+States.">Economic burden of seasonal influenza in the United States.</a> Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).</li><li>Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+and+globalization.">COVID-19 and globalization.</a> One Health. 9, 100132 (2020).</li><li>Guo, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+transmission+and+clinical+therapies+on+coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+outbreak+-+an+update+on+the+status.">The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status.</a> Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).</li><li>Guan, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics+of+coronavirus+disease+2019+in+China.">Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China.</a> New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+are+activated+during+human+viral+infections.">MAIT cells are activated during human viral infections.</a> Nature Communications. 7, 11653 (2016).</li><li>Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammadelta+T+cells:+first+line+of+defense+and+beyond.">Gammadelta T cells: first line of defense and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+contribute+to+protection+against+lethal+influenza+infection+in+vivo.">MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo.</a> Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).</li><li>Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+layers+of+heterogeneity+and+subset+diversity+in+human+MAIT+cell+responses+to+distinct+microorganisms+and+to+innate+cytokines.">Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+cells+derived+from+multiple+individuals+exhibit+differential+responses+to+H3N2+influenza+virus+infection+in+vitro.">Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).</li><li>Luukkainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+co-culture+model+of+PBMC+and+stem+cell+derived+human+nasal+epithelium+reveals+rapid+activation+of+NK+and+innate+T+cells+upon+Influenza+A+virus+infection+of+the+nasal+epithelium.">A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+H3N2+influenza+virus-infected+human+nasal+epithelial+cells+from+multiple+subjects+reveals+molecular+pathways+associated+with+tissue+injury+and+complications.">RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications.</a> Cells. 8 (9), 986 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+lipopolysaccharide+on+diesel+exhaust+particle-induced+junctional+dysfunction+in+primary+human+nasal+epithelial+cells.">Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells.</a> Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).</li><li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+fully+differentiated+human+nasal+epithelial+cells+infected+with+rhinovirus+reveals+epithelium-initiated+immune+responses.">In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses.</a> Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomic+and+metagenomic+analyses+of+influenza+virus-infected+nasal+epithelial+cells+from+multiple+individuals+reveal+specific+nasal-initiated+signatures.">Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).</li><li>Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay">https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay</a> (2020)</li><li>Gamage, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+nasal+epithelial+cells+with+SARS-CoV-2+and+a+382-nt+deletion+isolate+lacking+ORF8+reveals+similar+viral+kinetics+and+host+transcriptional+profiles.">Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).</li><li>Zhao, X. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+nasal+epithelial+stem/progenitor+cells+to+produce+functioning+ciliated+cells+in+vitro.">The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro.</a> American Journal of Rhinology &amp; Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).</li></ol>

Medfødte immunresponser mod vira er et underunderstuderet fagområde inden for antiviral behandling. Luftvejsepitelcellerne og medfødte immunceller arbejder sammen for at undertrykke viral replikation under en infektion, udover at tjene som en determinant for overaktiv adaptiv respons, hvis den virale belastning ikke holdes i skak 12,13,17. Udviklingen af en relevant human model til undersøgelse af epitel-medfødt immunkrydst...

Respiratoriske vira er måske blandt de mest udbredte patogener, der forårsager alvorlig sundhedspleje og økonomisk byrde. Fra de periodiske globale udbrud af nye epidemiske stammer (f.eks. H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) til de sæsonbestemte influenzastammer hvert år er vira en konstant trussel mod folkesundheden. Selvom vacciner udgør hovedparten af svaret på disse globale folkesundhedsudfordringer, er det tankevækkende at bemærke, at disse modforanstaltninger kun erlydhøre 1,2. Desuden er en forsinkelse mellem fremkomsten af en ny smitsom stamme og den vellykkede udvikling af dens vaccine uundgåelig3, hvilket fører til en periode, hvor de foranstaltninger, der er til rådighed for at bremse spredningen af virusset, er stærkt begrænsede.
Disse forsinkelser understreges yderligere af de omkostninger, der påføres samfundet økonomisk og socialt. Sæsoninfluenzaen alene er ansvarlig for ca. 8 milliarder dollars i indirekte omkostninger, 3,2 milliarder dollars i medicinske omkostninger og 36,3 tusind dødsfald i USA årligt4. Dette er før overvejelse af de forskningsomkostninger, der er nødvendige for at finansiere vaccineudvikling. Epidemiske udbrud har endnu mere alvorlige virkninger på samfundet, forværret af den stigende globaliseringshastighed hvert år, som det fremgår af de globale forstyrrelser forårsaget af fremkomsten og hurtig spredning af alvorligt akut respiratorisk syndrom coronovirus 2 (SARS-CoV-2) 5,6,7.
Nylige undersøgelser har vist, at inficerede patienter med en større population af aktiverede medfødte T-celler har tendens til at have et bedre sygdomsresultat 8,9,10. Desuden er den medfødte T-cellepopulation kategoriseret i flere undergrupper: de slimhinde-associerede invariant t (MAIT) celler, Vδ1 γδ T-celler, Vδ2 γδ T-celler og de naturlige dræber-T-celler (NKT). Disse undergrupper af medfødte T-celler udviser også heterogenitet inden for deres populationer, hvilket øger kompleksiteten af interaktionerne mellem de cellepopulationer, der er involveret i det medfødte immunrespons11. Derfor kan mekanismen, der aktiverer disse medfødte T-celler og kendskabet til de specifikke undergrupper af medfødte T-celler, give en anden forskningsvej for at begrænse de infektiøse virkninger af disse vira på den menneskelige vært, især i perioden med vaccineudvikling.
Epitelceller inficeret med influenza producerer faktorer, der aktiverer medfødte T-celler hurtigt 12,13,14. På baggrund af dette fund har denne kontaktfri Air-Liquid Interface (ALI) co-kulturmodel til formål at efterligne de tidlige kemiske interaktioner (medieret af opløselige faktorer frigivet af det inficerede epitellag) mellem det inficerede nasalepitellag og PBMC'erne under tidlig infektion. Den fysiske adskillelse mellem næseepitellaget (dyrket på membranindsatser) og PBMC'erne (i kammeret nedenunder) og epitelintegriteten forhindrer direkte infektion af PBMC'erne med virussen, hvilket muliggør en detaljeret undersøgelse af virkningerne af epitelafledte opløselige faktorer på PBMC'erne. De identificerede faktorer kan derfor undersøges yderligere for deres terapeutiske potentiale til at fremkalde den passende medfødte T-cellepopulation, der kan beskytte mod influenzainfektion. Dette papir har derfor detaljeret beskrevet metoderne til etablering af en co-kultur til undersøgelse af medfødt T-celleaktivering fra epitelafledte opløselige faktorer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120086</td>
			<td>1.5mL Centrifuge Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366643</td>
			<td>10mL Blood Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3460</td>
			<td>membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120094</td>
			<td>2 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-l-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>533998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes (flow tubes)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-4-62 Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810709008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel CL-611</td>
			<td>FMC Biopolymer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Liquid Overlay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc</td>
			<td>171STND01</td>
			<td>Multiplex Manager Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly Needle 21 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>367287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>554722</td>
			<td>Fixation and Permeabilization Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Neutral Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTP Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM voltohmmeter device</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>1x Lysing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>188271</td>
			<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 50 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>227261</td>
			<td>50 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Start Essential DNA Probes Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6402682001</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Premium</td>
			<td>Research Instruments</td>
			<td>17544203</td>
			<td>Density Gradient Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 (A/Aichi/2/1968)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hNESPCs</td>
			<td>Human Donors</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Epithelial Growth Factor</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>7925</td>
			<td>Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>qPCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex</td>
			<td>Merck Pte Ltd</td>
			<td>HCP2MAG-62K-PX23</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1705</td>
			<td>RT-PCR 5x Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1706</td>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>554723</td>
			<td>Permeabilization Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10x Supplement</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>Random Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RNase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Part of 52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STX2 electrodes</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td>Electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Shaped 96-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection

De tidlige interaktioner mellem næseepitellaget og de medfødte immunceller under virusinfektioner forbliver et underudforsket område. Betydningen af medfødt immunitetssignalering i virusinfektioner er steget betydeligt, da patienter med luftvejsinfektioner, der udviser høj medfødt T-celleaktivering, viser et bedre sygdomsresultat. Derfor tillader dissekering af disse tidlige medfødte immuninteraktioner belysning af de processer, der styrer dem, og kan lette udviklingen af potentielle terapeutiske mål og strategier til at dæmpe eller endda forhindre tidlig progression af virusinfektioner. Denne protokol beskriver en alsidig model, der kan bruges til at studere tidlig krydstale, interaktioner og aktivering af medfødte immunceller fra faktorer udskilt af viralt inficerede luftvejsepitelceller. Ved hjælp af en H3N2-influenzavirus (A/Aichi/2/1968) som den repræsentative virusmodel er medfødt celleaktivering af mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) blevet analyseret ved hjælp af flowcytometri for at undersøge de delmængder af celler, der aktiveres af de opløselige faktorer, der frigives fra epitelet som reaktion på virusinfektionen. Resultaterne demonstrerer gating-strategien til differentiering af delmængder af celler og afslører de klare forskelle mellem de aktiverede populationer af PBMC'er og deres krydstale med kontrol- og inficeret epitel. De aktiverede delmængder kan derefter analyseres yderligere for at bestemme deres funktioner såvel som molekylære ændringer, der er specifikke for cellerne. Resultater fra en sådan crosstalk-undersøgelse kan afdække faktorer, der er vigtige for aktiveringen af vitale medfødte cellepopulationer, som er gavnlige for at kontrollere og undertrykke udviklingen af virusinfektion. Desuden kan disse faktorer anvendes universelt på forskellige virussygdomme, især på nyopståede vira, for at dæmpe virkningen af sådanne vira, når de først cirkulerer i naive menneskelige populationer.

Selvom konventionelle T-celler udgør det vigtigste repertoire af adaptivt immunrespons mod virusinfektion for at lette viral clearance, arbejder den medfødte T-cellepopulation på tværs af et bredere spektrum for at undertrykke den virale belastning for effektiv clearance på et senere tidspunkt. Derfor skaber denne protokol specifikt en robust tilstand til at studere medfødte T-celler, deres aktivering og deres funktionelle population efter influenzainfektion uden behov for epitel- o...

Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection

Denne protokol beskriver en undersøgelse af de tidlige interaktioner mellem viralt inficerede nasale epitelceller og medfødt celleaktivering. Individuelle undergrupper af immunceller kan skelnes ud fra deres aktivering som reaktion på virusinfektioner. De kan derefter undersøges yderligere for at bestemme deres virkninger på tidlige antivirale reaktioner.

Kontaktfri co-kulturmodel til undersøgelse af medfødt immuncelleaktivering under luftvejsvirusinfektion

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The ...

Denne protokol er designet til at undersøge krydstale af epitelceller og førstelinjemedfødte immunceller, specifikt medfødte T-celler, hvilket er vores interesse. Primære celler fra menneskelige kilder anvendes i denne teknik, hvilket muliggør individuel undersøgelse af fysiologisk krydstale, der er relevant for, hvad der sker hos mennesker. Medfødte T-celler har været impliceret i at forbedre overlevelsen af influenzainficerede patienter.At vide, hvordan de bliver aktiveret, kan hjælpe med at udvikle anti-influenza og antiviral terapi. Denne metode er designet til at identificere faktorer, der kan aktivere de medfødte T-celler, hvilket kan hjælpe med at udvikle forebyggende foranstaltninger mod luftvejsvirusinfektion. På dag nul inficerer humane nasale epitelceller eller HNEC'er.Tæl først celler ved at tilsætte 150 mikroliter 1x trypsin EDTA til membranindsatsens apikale kammer og 350 mikroliter 1x trypsin EDTA til basalkammeret i den repræsentative brønd. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i 10 minutter, eller indtil cellerne løsner sig fra membranen. Skyl cellerne på membranen ved at pipettere op og ned og opsaml suspensionen i et 1,5 ml centrifugerør.Tilføj 200 mikroliter DMEM for at slukke trypsinaktiviteten. Tæl derefter celler via trypan blå farvning. Beregn den krævede mangfoldighed af infektion, eller MOI, af virussen baseret på celletallet pr. Brønd.Fortynd virusbestanden i overensstemmelse hermed med komplet RPMI på is. For de resterende brønde til infektionseksperimentet tilsættes en 1x DPBS i de apikale kamre i membranindsatserne. Inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter og fjern 1x DPBS.Skift basalmediet i membranindsatserne for at fuldføre RPMI-mediet ved at overføre indsatserne til en ny plade med komplet RPMI tilsat brøndene. Tilsæt det tilberedte virusinokulum i membranindsatsens apikale kammer. Inkuber ved 35 grader Celsius i en 5% kuldioxidatmosfære i en time og fjern det virale inokulum fra det apikale kammer.Skift membranindsatsens basale medium til frisk RPMI-medium og inkuber ved 35 grader Celsius i en 5% kuldioxidatmosfære i 24 til 72 timer. Frø det krævede antal mononukleære celler i perifert blod eller PBMC'er i komplet RPMI-medium ved direkte at tilsætte PBMC-suspensionen i basalkammeret i hver brønd af inficerede HNEC'er fra dag nul. Inkuber ved 37 grader Celsius i 24 til 48 timer.For at opsamle det apikale supernatant tilsættes 1x DBPS til hvert apikalt kammer og inkuberes ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Saml derefter DPBS i 1,5 milliliter rør. Aliquot supernatanten til plakanalysen i et nyt 1,5 milliliter rør og frys straks både bestanden og aliquoterne ved minus 80 grader Celsius.For at opsamle RNA-dannede HNEC'er skal du overføre membranindsatsen til en ren brønd. Tilsæt RNA-lysisbuffer til det apikale kammer og inkuber ved stuetemperatur i fem minutter. Saml supernatanten i et 1,5 milliliter centrifugerør og opbevar det ved minus 80 grader Celsius indtil RNA-ekstraktion til molekylær analyse.Til sidst høstes PBMC'er ved forsigtigt at skrabe brøndens overflade med den brede base af en steril pipettespids for at løsne de aktiverede PBMC'er, der kan klæbe til brøndoverfladen. Saml det basale medium, der indeholder PBMC'er, i et to milliliter centrifugerør. Skyl brøndene to gange med 300 mikroliter 1x DPBS og opsaml vasken i det samme to milliliter rør.Centrifugering af to-milliliter røret og opsaml supernatanten i et frisk to-milliliter rør uden at forstyrre cellepillen. Opbevar det aspirerede supernatant ved minus 80 grader Celsius til cytokin- og kemokinanalyse. Resuspend den resterende cellepille i 200 mikroliter 1x DPBS.Denne protokol kan bruges til at studere medfødte T-celler efter influenzainfektion uden behov for epitel- og immunceller fra den samme donor. En prøve af den forventede progression af HNESPC'erne, når de vokser på 3T3-føderlaget, er vist her. Disse blev anvendt til differentiering i luft/ væske-grænsefladekulturen for at opnå flerlags HNEC'er med funktionelle, cilierede og bægerceller.Ved hjælp af HNEC'erne kan medfødt T-celleaktivering undersøges ved hjælp af flowcytometri. Disse resultater viser påvisning af slimhinde-associerede invariant t- eller MAIT-celler, V delta one, gamma delta T-celler og de naturlige dræber-T- eller NKT-celler. Disse celler blev signifikant forøget i co-dyrkning, der involverede HNEC'er inficeret med influenzavirus.Denne opsætning kan derefter anvendes på andre influenzavirusstammer eller medfødte immuncellepopulationer for at observere deres respektive aktivering under co-dyrkningsbetingelser med inficerede epitelceller. Nøjagtig beregning af antallet af humane nasalepitelceller for at sikre, at den rigtige mangfoldighed af infektion anvendes, er vigtig for optimale niveauer og timing af aktivering. Crosstalk mellem epitelceller og medfødte immunceller får i stigende grad opmærksomhed, og dette kan anvendes yderligere på andre metoder, der involverer akut eller kronisk respiratorisk immunologi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantificering af den Respiratory burstrespons som en indikator for medfødte immunforsvar Sundhed i zebrafisk

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Generering af lymfeknuder-fedt Pad kimærer for Studiet af lymfeknuder stromacelle Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Brug af RNA-interferens Undersøge Innate immunresponset i musemakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In vitro analyse af MyD88-medieret Cellular immunrespons til West Nile Virus mutantstamme Infektion

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Ikke-invasiv billeddannelse af Innate immunrespons i en zebrafisk Larve Model af<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektion

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

En Ex Vivo kylling primære Bursal-cellekultur Model til at studere smitsomme Bursal Disease Virus patogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

En musemodel at vurdere medfødte immunrespons for Staphylococcus aureus infektioner

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

En barciak Oral Administration Model til Study Commensal-Induced medfødte immunrespons

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Isolering af tonsillar mononukleare celler til at studere Ex Vivo medfødte immunrespons i en human slimhinde lymfoide væv

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...