Name: contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection
Uploaded: 2021-02-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

We willen de onderzoeksmedewerkers van de NUS-afdeling Otolaryngologie en de afdeling Microbiologie en Immunologie bedanken voor hun hulp bij het hNEC-cultuur- en virale cultuurgerelateerde werk. We willen ook de chirurgen en het chirurgische team in het National University Hospital, Department of Otolaryngology, bedanken voor hun hulp bij het verstrekken van de cel- en bloedmonsters die nodig zijn voor de studie. Deze studie werd gefinancierd door de National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (aan De Yun Wang) en MOH-OFYIRG19may-0007 (aan Kai Sen Tan). Kai Sen Tan is een ontvanger van fellowship-ondersteuning van European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.

OPMERKING: Raadpleeg tabel 1 voor recepten van media die in dit protocol worden gebruikt. OPMERKING: hNECS gekweekt op 12-well transwell blijken te groeien tot een meer optimale dikte voor oplosbare factoren om de basale kamer gemakkelijk te bereiken wanneer ze zijn geïnfecteerd met het influenzavirus. Daarom wordt het gebruik van transwell van 12-wells formaat voor co-cultuur aanbevolen.
1. Vaststelling van de 3T3-feederlaag
<ol><li>Inrichting uit bevroren voorraden<ol>...

<ol>
	<li>Monto, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+and+antiviral+drugs+in+pandemic+preparedness.">Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).</li><li>Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+for+the+next+pandemic.">Preparing for the next pandemic.</a> The British Medical Journal. 346, 364 (2013).</li><li>Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+annual+production+cycle+for+influenza+vaccine.">The annual production cycle for influenza vaccine.</a> Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).</li><li>Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+burden+of+seasonal+influenza+in+the+United+States.">Economic burden of seasonal influenza in the United States.</a> Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).</li><li>Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+and+globalization.">COVID-19 and globalization.</a> One Health. 9, 100132 (2020).</li><li>Guo, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+transmission+and+clinical+therapies+on+coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+outbreak+-+an+update+on+the+status.">The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status.</a> Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).</li><li>Guan, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics+of+coronavirus+disease+2019+in+China.">Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China.</a> New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+are+activated+during+human+viral+infections.">MAIT cells are activated during human viral infections.</a> Nature Communications. 7, 11653 (2016).</li><li>Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammadelta+T+cells:+first+line+of+defense+and+beyond.">Gammadelta T cells: first line of defense and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+contribute+to+protection+against+lethal+influenza+infection+in+vivo.">MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo.</a> Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).</li><li>Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+layers+of+heterogeneity+and+subset+diversity+in+human+MAIT+cell+responses+to+distinct+microorganisms+and+to+innate+cytokines.">Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+cells+derived+from+multiple+individuals+exhibit+differential+responses+to+H3N2+influenza+virus+infection+in+vitro.">Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).</li><li>Luukkainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+co-culture+model+of+PBMC+and+stem+cell+derived+human+nasal+epithelium+reveals+rapid+activation+of+NK+and+innate+T+cells+upon+Influenza+A+virus+infection+of+the+nasal+epithelium.">A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+H3N2+influenza+virus-infected+human+nasal+epithelial+cells+from+multiple+subjects+reveals+molecular+pathways+associated+with+tissue+injury+and+complications.">RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications.</a> Cells. 8 (9), 986 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+lipopolysaccharide+on+diesel+exhaust+particle-induced+junctional+dysfunction+in+primary+human+nasal+epithelial+cells.">Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells.</a> Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).</li><li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+fully+differentiated+human+nasal+epithelial+cells+infected+with+rhinovirus+reveals+epithelium-initiated+immune+responses.">In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses.</a> Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomic+and+metagenomic+analyses+of+influenza+virus-infected+nasal+epithelial+cells+from+multiple+individuals+reveal+specific+nasal-initiated+signatures.">Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).</li><li>Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay">https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay</a> (2020)</li><li>Gamage, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+nasal+epithelial+cells+with+SARS-CoV-2+and+a+382-nt+deletion+isolate+lacking+ORF8+reveals+similar+viral+kinetics+and+host+transcriptional+profiles.">Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).</li><li>Zhao, X. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+nasal+epithelial+stem/progenitor+cells+to+produce+functioning+ciliated+cells+in+vitro.">The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro.</a> American Journal of Rhinology &amp; Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).</li></ol>

Aangeboren immuunresponsen tegen virussen zijn een onderbelicht vakgebied in antivirale management. De luchtwegepitheelcellen en aangeboren immuuncellen werken samen om virale replicatie tijdens een infectie te onderdrukken, naast het dienen als een determinant van overactieve adaptieve respons als de virale lading niet onder controle wordt gehouden 12,13,17. De ontwikkeling van een relevant menselijk model voor de studie van ep...

Respiratoire virussen behoren misschien wel tot de meest voorkomende ziekteverwekkers die ernstige gezondheids- en economische lasten veroorzaken. Van de periodieke wereldwijde uitbraken van opkomende epidemische stammen (bijv. H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) tot de seizoensgebonden stammen van influenza elk jaar, virussen vormen een constante bedreiging voor de volksgezondheid. Hoewel vaccins het grootste deel van het antwoord vormen op deze wereldwijde uitdagingen op het gebied van de volksgezondheid, is het ontnuchterend om op te merken dat deze tegenmaatregelen slechts responsief zijn 1,2. Bovendien is een vertraging tussen de opkomst van een nieuwe infectieuze stam en de succesvolle ontwikkeling van het vaccin onvermijdelijk3, wat leidt tot een periode waarin de beschikbare maatregelen om de verspreiding van het virus te beteugelen zeer beperkt zijn.
Deze vertragingen worden verder benadrukt door de kosten die worden toegebracht aan de samenleving - economisch en sociaal. De seizoensgriep alleen al is verantwoordelijk voor ongeveer $ 8 miljard aan indirecte kosten, $ 3,2 miljard aan medische kosten en 36,3 duizend sterfgevallen in de Verenigde Staten van Amerika per jaar4. Dit is voordat rekening wordt gehouden met de onderzoekskosten die nodig zijn om de ontwikkeling van vaccins te financieren. Epidemische uitbraken hebben nog ernstiger gevolgen voor de samenleving, verergerd door de toenemende globalisering elk jaar, zoals blijkt uit de wereldwijde verstoringen veroorzaakt door de opkomst en snelle verspreiding van ernstig acuut respiratoir syndroom coronovirus 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
Recente studies hebben aangetoond dat geïnfecteerde patiënten met een grotere populatie van geactiveerde aangeboren T-cellen de neiging hebben om een beter ziekteresultaat te hebben 8,9,10. Verder is de aangeboren T-celpopulatie onderverdeeld in meerdere subgroepen: de mucosaal-geassocieerde invariante T (MAIT) cellen, Vδ1 γδ T cellen, Vδ2 γδ T cellen en de natural killer T (NKT) cellen. Deze subgroepen van aangeboren T-cellen vertonen ook heterogeniteit binnen hun populaties, waardoor de complexiteit van de interacties tussen de celpopulaties die betrokken zijn bij de aangeboren immuunresponstoeneemt 11. Vandaar dat het mechanisme dat deze aangeboren T-cellen activeert en de kennis van de specifieke subgroepen van aangeboren T-cellen een andere manier van onderzoek kunnen bieden om de infectieuze effecten van deze virussen op de menselijke gastheer te beperken, vooral tijdens de periode van vaccinontwikkeling.
Epitheelcellen geïnfecteerd door influenza produceren factoren die aangeboren T-cellen snel activeren 12,13,14. Voortbouwend op die bevinding heeft dit contactloze Air-Liquid Interface (ALI) co-kweekmodel tot doel de vroege chemische interacties (gemedieerd door oplosbare factoren die vrijkomen door de geïnfecteerde epitheellaag) tussen de geïnfecteerde nasale epitheellaag en de PBMC's na te bootsen tijdens vroege infectie. De fysieke scheiding tussen de nasale epitheellaag (gekweekt op membraaninzetstukken) en de PBMC's (in de kamer eronder) en de epitheliale integriteit voorkomen directe infectie van de PBMC's door het virus, waardoor een gedetailleerde studie mogelijk is van de effecten van epitheliale oplosbare factoren op de PBMC's. De geïdentificeerde factoren kunnen daarom verder worden onderzocht op hun therapeutisch potentieel bij het induceren van de juiste aangeboren T-celpopulatie die kan beschermen tegen influenza-infectie. Dit artikel heeft daarom de methoden beschreven voor het vaststellen van een co-cultuur voor de studie van aangeboren T-celactivatie van epitheel-afgeleide oplosbare factoren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120086</td>
			<td>1.5mL Centrifuge Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366643</td>
			<td>10mL Blood Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3460</td>
			<td>membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120094</td>
			<td>2 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-l-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>533998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes (flow tubes)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-4-62 Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810709008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel CL-611</td>
			<td>FMC Biopolymer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Liquid Overlay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc</td>
			<td>171STND01</td>
			<td>Multiplex Manager Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly Needle 21 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>367287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>554722</td>
			<td>Fixation and Permeabilization Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Neutral Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTP Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM voltohmmeter device</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>1x Lysing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>188271</td>
			<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 50 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>227261</td>
			<td>50 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Start Essential DNA Probes Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6402682001</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Premium</td>
			<td>Research Instruments</td>
			<td>17544203</td>
			<td>Density Gradient Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 (A/Aichi/2/1968)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hNESPCs</td>
			<td>Human Donors</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Epithelial Growth Factor</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>7925</td>
			<td>Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>qPCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex</td>
			<td>Merck Pte Ltd</td>
			<td>HCP2MAG-62K-PX23</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1705</td>
			<td>RT-PCR 5x Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1706</td>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>554723</td>
			<td>Permeabilization Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10x Supplement</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>Random Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RNase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Part of 52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STX2 electrodes</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td>Electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Shaped 96-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection

De vroege interacties tussen de neusepitheellaag en de aangeboren immuuncellen tijdens virale infecties blijven een onderbelicht gebied. De betekenis van aangeboren immuniteitssignalering bij virale infecties is aanzienlijk toegenomen naarmate patiënten met luchtweginfecties die een hoge aangeboren T-celactivatie vertonen, een beter ziekteresultaat vertonen. Vandaar dat het ontleden van deze vroege aangeboren immuuninteracties de opheldering mogelijk maakt van de processen die ze beheersen en de ontwikkeling van potentiële therapeutische doelen en strategieën voor het dempen of zelfs voorkomen van vroege progressie van virale infecties kan vergemakkelijken. Dit protocol beschrijft een veelzijdig model dat kan worden gebruikt om vroege overspraak, interacties en activering van aangeboren immuuncellen te bestuderen van factoren die worden uitgescheiden door viraal geïnfecteerde luchtwegepitheelcellen. Met behulp van een H3N2-influenzavirus (A /Aichi / 2/1968) als het representatieve virusmodel, is aangeboren celactivering van co-gekweekte perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) geanalyseerd met behulp van flowcytometrie om de subsets van cellen te onderzoeken die worden geactiveerd door de oplosbare factoren die vrijkomen uit het epitheel als reactie op de virale infectie. De resultaten tonen de gating-strategie voor het differentiëren van de subsets van cellen en onthullen de duidelijke verschillen tussen de geactiveerde populaties van PBMC's en hun kruisverwijzing met het controle- en geïnfecteerde epitheel. De geactiveerde subsets kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd om hun functies en moleculaire veranderingen specifiek voor de cellen te bepalen. Bevindingen van een dergelijk kruisverwijzingsonderzoek kunnen factoren blootleggen die belangrijk zijn voor de activering van vitale aangeboren celpopulaties, die gunstig zijn bij het beheersen en onderdrukken van de progressie van virale infectie. Bovendien kunnen deze factoren universeel worden toegepast op verschillende virale ziekten, vooral op nieuw opkomende virussen, om de impact van dergelijke virussen te dempen wanneer ze voor het eerst circuleren in naïeve menselijke populaties.

Hoewel conventionele T-cellen het belangrijkste repertoire vormen van adaptieve immuunrespons tegen virale infectie om virale klaring te vergemakkelijken, werkt de aangeboren T-celpopulatie over een breder spectrum om de virale lading te onderdrukken voor effectieve klaring in een later stadium. Daarom creëert dit protocol specifiek een robuuste voorwaarde om aangeboren T-cellen, hun activering en hun functionele populatie na influenza-infectie te bestuderen, zonder epitheliale en immuun...

Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection

Dit protocol beschrijft een onderzoek naar de vroege interacties tussen viraal geïnfecteerde neusepitheelcellen en aangeboren celactivatie. Individuele subsets van immuuncellen kunnen worden onderscheiden op basis van hun activering als reactie op virale infecties. Ze kunnen vervolgens verder worden onderzocht om hun effecten op vroege antivirale reacties te bepalen.

Contactvrij co-kweekmodel voor de studie van innate immuuncelactivering tijdens respiratoire virusinfectie

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The ...

Dit protocol is ontworpen om overspraak van epitheelcellen en eerstelijns aangeboren immuuncellen te onderzoeken, met name aangeboren T-cellen, wat ons interesseert. Primaire cellen uit menselijke bronnen worden gebruikt in deze techniek, waardoor individueel onderzoek van fysiologische overspraak relevant is voor wat er bij mensen gebeurt. Aangeboren T-cellen zijn betrokken bij het verbeteren van de overleving van influenza-geïnfecteerde patiënten.Weten hoe ze worden geactiveerd, kan helpen bij het ontwikkelen van anti-influenza en antivirale therapie. Deze methode is ontworpen om factoren te identificeren die de aangeboren T-cellen kunnen activeren, wat kan helpen bij het ontwikkelen van preventieve maatregelen tegen respiratoire virusinfectie. Infecteer op dag nul menselijke neusepitheelcellen of HNECs.Tel eerst cellen door 150 microliter 1x trypsine EDTA toe te voegen aan de apicale kamer van de membraaninzet en 350 microliter 1x trypsine EDTA aan de basale kamer van de representatieve put. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten of totdat de cellen loskomen van het membraan. Spoel de cellen op het membraan door op en neer te pipetteren en vang de suspensie op in een centrifugebuis van 1,5 milliliter.Voeg 200 microliter DMEM toe om de trypsine-activiteit te dempen. Tel vervolgens cellen via trypan blauwe kleuring. Bereken de vereiste veelheid van infectie, of MOI, van het virus op basis van het celgetal per put.Verdun de virusvoorraad dienovereenkomstig met volledige RPMI op ijs. Voeg voor de resterende putten voor het infectie-experiment één 1x DPBS toe aan de apicale kamers van de membraaninzetstukken. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten en verwijder de 1x DPBS.Verander het basale medium in de membraaninzetstukken om het RPMI-medium te voltooien door de wisselplaten over te brengen naar een nieuwe plaat met volledige RPMI toegevoegd aan de putten. Voeg het bereide virus-entmateriaal toe aan de apicale kamer van de membraaninzet. Incubeer bij 35 graden Celsius in een 5% koolstofdioxideatmosfeer gedurende een uur en verwijder het virale entmateriaal uit de apicale kamer.Verander het basale medium van de membraaninzet in vers RPMI-medium en incubeer bij 35 graden Celsius in een 5% kooldioxide-atmosfeer gedurende 24 tot 72 uur. Zaai het vereiste aantal mononucleaire bloedcellen, of PBMC's, in volledig RPMI-medium door de PBMC-suspensie vanaf dag nul rechtstreeks toe te voegen aan de basale kamer van elke put geïnfecteerde HNEC's. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 24 tot 48 uur.Om het apicale supernatant te verzamelen, voegt u 1x DBPS toe aan elke apicale kamer en incubeert u gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Verzamel vervolgens de DPBS in buizen van 1,5 milliliter. Aliquoteer het supernatant voor de plaquetest in een nieuwe buis van 1,5 milliliter en vries zowel de bouillon als de aliquots onmiddellijk in bij min 80 graden Celsius.Om RNA-vormige HNEC's te verzamelen, brengt u de membraaninzet over naar een schone put. Voeg RNA-lysisbuffer toe aan de apicale kamer en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verzamel het supernatant in een centrifugebuis van 1,5 milliliter en bewaar het bij min 80 graden Celsius tot RNA-extractie voor moleculaire analyse.Oogst ten slotte PBMC's door het oppervlak van de put voorzichtig te schrapen met de brede basis van een steriele pipetpunt om de geactiveerde PBMC's los te maken die zich mogelijk aan het putoppervlak hechten. Verzamel het basale medium met PBMC's in een centrifugebuis van twee milliliter. Spoel de putjes twee keer door met 300 microliter 1x DPBS en verzamel de was in dezelfde buis van twee milliliter.Centrifugeer de buis van twee milliliter en verzamel het supernatant in een verse buis van twee milliliter zonder de celkorrel te verstoren. Bewaar het geaspireerde supernatant bij min 80 graden Celsius voor cytokine- en chemokineanalyse. Resuspend de resterende celkorrel in 200 microliter 1x DPBS.Dit protocol kan worden gebruikt om aangeboren T-cellen na influenza-infectie te bestuderen zonder de noodzaak van epitheliale en immuuncellen van dezelfde donor. Een voorbeeld van de verwachte progressie van de HNESPC's terwijl ze groeien op de 3T3-feederlaag wordt hier weergegeven. Deze werden gebruikt voor differentiatie in de lucht/ vloeistof interface cultuur om meerlagige HNEC's te verkrijgen met functionele, trilhaar- en gobletcellen.Met behulp van de HNECs kan aangeboren T-celactivering worden onderzocht met behulp van flowcytometrie. Deze resultaten tonen de detectie van mucosaal-geassocieerde invariante T- of MAIT-cellen, V delta één, gamma delta T-cellen en de natural killer T- of NKT-cellen. Deze cellen waren significant verhoogd in co-kweek met HNECs geïnfecteerd met influenzavirus.Deze opstelling kan vervolgens worden toegepast op andere influenzavirusstammen of aangeboren immuuncelpopulaties om hun respectieve activering onder co-kweekomstandigheden met geïnfecteerde epitheelcellen te observeren. Nauwkeurige berekening van het aantal menselijke neusepitheelcellen om ervoor te zorgen dat de juiste multipliciteit van infectie wordt gebruikt, is belangrijk voor optimale niveaus en timing van activering. Kruisverwijzing tussen epitheelcellen en aangeboren immuuncellen krijgt steeds meer aandacht, en dit kan verder worden toegepast op andere methoden waarbij acute of chronische respiratoire immunologie betrokken is.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kwantificering van de Respiratory Burst Response als een indicator van het aangeboren immuunsysteem Gezondheid in zebravis

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analyse van Myd88 gemedieerde cellulaire immuunrespons op West Nile Virus mutantstam Infectie

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons in een zebravis larven Model van<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infectie

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Een Ex Vivo kip primaire Bursal-celkweek Model studie Bursal infectieziekte Virus pathogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Een muismodel te beoordelen ingeboren immuunreactie op Staphylococcus aureus -infectie

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Een mondelinge beheermodel voor wasmot te Study Commensal-Induced aangeboren immuunresponsen

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Isolatie van tonsillaire mononucleaire cellen om ex vivo ingeboren immuunreacties te bestuderen in een menselijk mucosale lymfoïde weefsel

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...