Name: contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection
Uploaded: 2021-02-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

Wir danken den wissenschaftlichen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der NUS Abteilung für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde und der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie für ihre Hilfe bei der hNEC-Kultur- und Viruskultur-bezogenen Arbeit. Wir möchten auch den Chirurgen und dem chirurgischen Team des National University Hospital, Abteilung für HNO-Heilkunde, für ihre Unterstützung bei der Bereitstellung der für die Studie erforderlichen Zell- und Blutproben danken. Diese Studie wurde vom National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (an De Yun Wang) und MOH-OFYIRG19may-0007 (an Kai Sen Tan). Kai Sen Tan erhält Stipendien im Rahmen des European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.

HINWEIS: In Tabelle 1 finden Sie die Rezepte der in diesem Protokoll verwendeten Medien. HINWEIS: Es wurde festgestellt, dass hNECS, die auf 12-Well Transwell gezüchtet werden, in eine optimalere Dicke für lösliche Faktoren wachsen, um die Basalkammer leicht zu erreichen, wenn sie mit dem Influenzavirus infiziert sind. Daher wird die Verwendung von 12-Well-Size-Transwell für die Kokultur empfohlen.
1. Aufbau der 3T3-Feederschicht
<ol><li>Betrieb aus Tiefkühlbestände...

<ol>
	<li>Monto, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+and+antiviral+drugs+in+pandemic+preparedness.">Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).</li><li>Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+for+the+next+pandemic.">Preparing for the next pandemic.</a> The British Medical Journal. 346, 364 (2013).</li><li>Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+annual+production+cycle+for+influenza+vaccine.">The annual production cycle for influenza vaccine.</a> Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).</li><li>Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+transmission+and+clinical+therapies+on+coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+outbreak+-+an+update+on+the+status.">The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status.</a> Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).</li><li>Guan, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics+of+coronavirus+disease+2019+in+China.">Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China.</a> New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+are+activated+during+human+viral+infections.">MAIT cells are activated during human viral infections.</a> Nature Communications. 7, 11653 (2016).</li><li>Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammadelta+T+cells:+first+line+of+defense+and+beyond.">Gammadelta T cells: first line of defense and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+contribute+to+protection+against+lethal+influenza+infection+in+vivo.">MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo.</a> Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).</li><li>Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+layers+of+heterogeneity+and+subset+diversity+in+human+MAIT+cell+responses+to+distinct+microorganisms+and+to+innate+cytokines.">Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+cells+derived+from+multiple+individuals+exhibit+differential+responses+to+H3N2+influenza+virus+infection+in+vitro.">Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).</li><li>Luukkainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+co-culture+model+of+PBMC+and+stem+cell+derived+human+nasal+epithelium+reveals+rapid+activation+of+NK+and+innate+T+cells+upon+Influenza+A+virus+infection+of+the+nasal+epithelium.">A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+H3N2+influenza+virus-infected+human+nasal+epithelial+cells+from+multiple+subjects+reveals+molecular+pathways+associated+with+tissue+injury+and+complications.">RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications.</a> Cells. 8 (9), 986 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+lipopolysaccharide+on+diesel+exhaust+particle-induced+junctional+dysfunction+in+primary+human+nasal+epithelial+cells.">Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells.</a> Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).</li><li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+fully+differentiated+human+nasal+epithelial+cells+infected+with+rhinovirus+reveals+epithelium-initiated+immune+responses.">In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses.</a> Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomic+and+metagenomic+analyses+of+influenza+virus-infected+nasal+epithelial+cells+from+multiple+individuals+reveal+specific+nasal-initiated+signatures.">Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).</li><li>Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay">https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay</a> (2020)</li><li>Gamage, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+nasal+epithelial+cells+with+SARS-CoV-2+and+a+382-nt+deletion+isolate+lacking+ORF8+reveals+similar+viral+kinetics+and+host+transcriptional+profiles.">Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).</li><li>Zhao, X. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+nasal+epithelial+stem/progenitor+cells+to+produce+functioning+ciliated+cells+in+vitro.">The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro.</a> American Journal of Rhinology &amp; Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).</li></ol>

Angeborene Immunantworten gegen Viren sind ein wenig erforschtes Forschungsgebiet im antiviralen Management. Die Epithelzellen der Atemwege und die angeborenen Immunzellen arbeiten zusammen, um die Virusreplikation während einer Infektion zu unterdrücken, und dienen nicht nur als Determinante der überaktiven adaptiven Reaktion, wenn die Viruslast nicht in Schach gehaltenwird 12,13,17. Die Entwicklung eines relevanten Humanmod...

Atemwegsviren gehören vielleicht zu den am weitesten verbreiteten Krankheitserregern, die eine schwere Belastung für die Gesundheitsversorgung und die Wirtschaft verursachen. Von den periodischen globalen Ausbrüchen neu auftretender epidemischer Stämme (z. B. H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) bis hin zu den saisonalen Influenzastämmen jedes Jahr sind Viren eine ständige Bedrohung für die öffentliche Gesundheit. Obwohl Impfstoffe den Hauptteil der Reaktion auf diese globalen Herausforderungen im Bereich der öffentlichen Gesundheit ausmachen, ist es ernüchternd festzustellen, dass diese Gegenmaßnahmen lediglich reaktionsschnellsind 1,2. Darüber hinaus ist eine Verzögerung zwischen dem Auftreten eines neuen infektiösen Stammes und der erfolgreichen Entwicklung seines Impfstoffsunvermeidlich 3, was zu einer Zeit führt, in der die verfügbaren Maßnahmen zur Eindämmung der Ausbreitung des Virus stark begrenzt sind.
Diese Verzögerungen werden durch die Kosten, die der Gesellschaft - wirtschaftlich und sozial - entstehen, noch verstärkt. Allein die saisonale Grippe ist für etwa 8 Milliarden US-Dollar an indirekten Kosten, 3,2 Milliarden US-Dollar an medizinischen Kosten und 36,3.000 Todesfälle in den Vereinigten Staaten von Amerika jährlichverantwortlich 4. Dies geschieht vor der Berücksichtigung der Forschungskosten, die zur Finanzierung der Impfstoffentwicklung erforderlich sind. Epidemieausbrüche haben noch schwerwiegendere Auswirkungen auf die Gesellschaft, verstärkt durch die von Jahr zu Jahr zunehmende Globalisierungsrate, wie die globalen Störungen zeigen, die durch die Entstehung und schnelle Ausbreitung des schweren Coronovirus 2 (SARS-CoV-2) 5,6,7 verursacht werden.
Neuere Studien haben gezeigt, dass infizierte Patienten mit einer größeren Population von aktivierten angeborenen T-Zellen tendenziell ein besseres Krankheitsergebnis haben 8,9,10. Darüber hinaus wird die angeborene T-Zellpopulation in mehrere Untergruppen eingeteilt: die schleimhautassoziierten invarianten T-Zellen (MAIT), Vδ1 γδ T-Zellen, Vδ2 γδ T-Zellen und die natürlichen Killer-T-Zellen (NKT). Diese Untergruppen angeborener T-Zellen weisen auch eine Heterogenität innerhalb ihrer Populationen auf, was die Komplexität der Interaktionen zwischen den Zellpopulationen, die an der angeborenen Immunantwort beteiligt sind, erhöht 11. Daher kann der Mechanismus, der diese angeborenen T-Zellen aktiviert, und das Wissen über die spezifischen Untergruppen angeborener T-Zellen einen anderen Forschungsweg bieten, um die infektiösen Auswirkungen dieser Viren auf den menschlichen Wirt einzudämmen, insbesondere während der Zeit der Impfstoffentwicklung.
Epithelzellen, die mit Influenza infiziert sind, produzieren Faktoren, die angeborene T-Zellen schnell aktivieren12,13,14. Aufbauend auf diesem Befund zielt dieses kontaktlose Luft-Flüssig-Grenzflächenmodell (ALI) darauf ab, die frühen chemischen Wechselwirkungen (vermittelt durch lösliche Faktoren, die von der infizierten Epithelschicht freigesetzt werden) zwischen der infizierten Nasenepithelschicht und den PBMCs während einer frühen Infektion nachzuahmen. Die physikalische Trennung zwischen der Nasenepithelschicht (kultiviert auf Membraneinsätzen) und den PBMCs (in der darunter liegenden Kammer) und der epithelialen Integrität verhindert eine direkte Infektion der PBMCs durch das Virus und ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Auswirkungen von epithelial abgeleiteten löslichen Faktoren auf die PBMCs. Die identifizierten Faktoren können daher hinsichtlich ihres therapeutischen Potenzials bei der Induktion der geeigneten angeborenen T-Zell-Population, die vor einer Influenza-Infektion schützen kann, weiter untersucht werden. Dieses Papier hat daher die Methoden zur Etablierung einer Kokultur für die Untersuchung der angeborenen T-Zell-Aktivierung aus Epithel-abgeleiteten löslichen Faktoren detailliert beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120086</td>
			<td>1.5mL Centrifuge Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366643</td>
			<td>10mL Blood Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3460</td>
			<td>membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120094</td>
			<td>2 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-l-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>533998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes (flow tubes)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-4-62 Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810709008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel CL-611</td>
			<td>FMC Biopolymer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Liquid Overlay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc</td>
			<td>171STND01</td>
			<td>Multiplex Manager Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly Needle 21 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>367287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>554722</td>
			<td>Fixation and Permeabilization Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Neutral Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTP Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM voltohmmeter device</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>1x Lysing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>188271</td>
			<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 50 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>227261</td>
			<td>50 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Start Essential DNA Probes Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6402682001</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Premium</td>
			<td>Research Instruments</td>
			<td>17544203</td>
			<td>Density Gradient Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 (A/Aichi/2/1968)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hNESPCs</td>
			<td>Human Donors</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Epithelial Growth Factor</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>7925</td>
			<td>Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>qPCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex</td>
			<td>Merck Pte Ltd</td>
			<td>HCP2MAG-62K-PX23</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1705</td>
			<td>RT-PCR 5x Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1706</td>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>554723</td>
			<td>Permeabilization Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10x Supplement</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>Random Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RNase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Part of 52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STX2 electrodes</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td>Electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Shaped 96-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection

Die frühen Wechselwirkungen zwischen der Nasenepithelschicht und den angeborenen Immunzellen während viraler Infektionen bleiben ein wenig erforschtes Gebiet. Die Bedeutung der angeborenen Immunitätssignalisierung bei Virusinfektionen hat erheblich zugenommen, da Patienten mit Atemwegsinfektionen, die eine hohe angeborene T-Zell-Aktivierung aufweisen, ein besseres Krankheitsergebnis zeigen. Daher ermöglicht die Sezierung dieser frühen angeborenen Immuninteraktionen die Aufklärung der Prozesse, die sie steuern, und kann die Entwicklung potenzieller therapeutischer Ziele und Strategien zur Dämpfung oder sogar Verhinderung des frühen Fortschreitens von Virusinfektionen erleichtern. Dieses Protokoll beschreibt ein vielseitiges Modell, mit dem frühe Übersprechen, Interaktionen und die Aktivierung angeborener Immunzellen aus Faktoren, die von viral infizierten Atemwegsepithelzellen abgesondert werden, untersucht werden können. Unter Verwendung eines H3N2-Influenzavirus (A/Aichi/2/1968) als repräsentatives Virusmodell wurde die angeborene Zellaktivierung von kokultivierten mononukleären Zellen im peripheren Blut (PBMCs) mittels Durchflusszytometrie analysiert, um die Untergruppen von Zellen zu untersuchen, die durch die löslichen Faktoren aktiviert werden, die als Reaktion auf die Virusinfektion aus dem Epithel freigesetzt werden. Die Ergebnisse demonstrieren die Gating-Strategie zur Differenzierung der Teilmengen von Zellen und zeigen die deutlichen Unterschiede zwischen den aktivierten Populationen von PBMCs und ihrem Crosstalk mit dem Kontroll- und infizierten Epithel. Die aktivierten Teilmengen können dann weiter analysiert werden, um ihre Funktionen sowie die für die Zellen spezifischen molekularen Veränderungen zu bestimmen. Die Ergebnisse einer solchen Crosstalk-Untersuchung können Faktoren aufdecken, die für die Aktivierung lebenswichtiger angeborener Zellpopulationen wichtig sind und für die Kontrolle und Unterdrückung des Fortschreitens der Virusinfektion von Vorteil sind. Darüber hinaus können diese Faktoren universell auf verschiedene Viruserkrankungen angewendet werden, insbesondere auf neu auftretende Viren, um die Auswirkungen solcher Viren zu dämpfen, wenn sie zum ersten Mal in naiven menschlichen Populationen zirkulieren.

Obwohl konventionelle T-Zellen das Hauptrepertoire der adaptiven Immunantwort gegen Virusinfektionen bilden, um die virale Clearance zu erleichtern, arbeitet die angeborene T-Zell-Population über ein breiteres Spektrum, um die Viruslast für eine effektive Clearance in einem späteren Stadium zu unterdrücken. Daher schafft dieses Protokoll speziell eine robuste Bedingung, um angeborene T-Zellen, ihre Aktivierung und ihre funktionelle Population nach einer Influenza-Infektion zu untersuc...

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Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection

Dieses Protokoll beschreibt eine Untersuchung der frühen Wechselwirkungen zwischen viral infizierten Nasenepithelzellen und der angeborenen Zellaktivierung. Einzelne Untergruppen von Immunzellen können anhand ihrer Aktivierung als Reaktion auf Virusinfektionen unterschieden werden. Sie können dann weiter untersucht werden, um ihre Auswirkungen auf frühe antivirale Reaktionen zu bestimmen.

Kontaktfreies Co-Kultur-Modell zur Untersuchung der angeborenen Immunzellaktivierung während einer Infektion mit respiratorischen Viren

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The ...

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um das Übersprechen von Epithelzellen und angeborenen Immunzellen der ersten Linie, insbesondere angeborenen T-Zellen, zu untersuchen, was unser Interesse ist. Bei dieser Technik werden Primärzellen aus menschlichen Quellen verwendet, die eine individuelle Untersuchung des physiologischen Übersprechens ermöglichen, das für das Geschehen beim Menschen relevant ist. Angeborene T-Zellen sind an der Verbesserung des Überlebens von Influenza-infizierten Patienten beteiligt.Zu wissen, wie sie aktiviert werden, könnte bei der Entwicklung einer Anti-Influenza- und antiviralen Therapie helfen. Diese Methode wurde entwickelt, um Faktoren zu identifizieren, die die angeborenen T-Zellen aktivieren können, was bei der Entwicklung von vorbeugenden Maßnahmen gegen Atemwegsvirusinfektionen helfen kann. Infizieren Sie am Tag Null menschliche Nasenepithelzellen oder HNECs.Zählen Sie zunächst die Zellen, indem Sie 150 Mikroliter 1x Trypsin EDTA in die apikale Kammer des Membraneinsatzes und 350 Mikroliter 1x Trypsin EDTA in die Basalkammer des repräsentativen Brunnens geben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten oder bis sich die Zellen von der Membran lösen. Spülen Sie die Zellen auf der Membran durch Auf- und Abpipettieren und sammeln Sie die Suspension in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Fügen Sie 200 Mikroliter DMEM hinzu, um die Trypsin-Aktivität zu löschen. Zählen Sie dann die Zellen über die Trypan-Blaufärbung. Berechnen Sie die erforderliche Multiplizität der Infektion oder MOI des Virus basierend auf der Zellzahl pro Well.Verdünnen Sie den Virenbestand entsprechend mit vollständigem RPMI auf Eis. Für die verbleibenden Vertiefungen für das Infektionsexperiment fügen Sie einen 1x DPBS in die apikalen Kammern der Membraneinsätze hinzu. Bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren und die 1x DPBS entfernen.Ändern Sie das basale Medium in den Membraneinsätzen in vollständiges RPMI-Medium, indem Sie die Einsätze auf eine neue Platte mit vollständigem RPMI zu den Vertiefungen übertragen. Fügen Sie das vorbereitete Virusinokulum in die apikale Kammer des Membraneinsatzes hinzu. Inkubieren Sie bei 35 Grad Celsius in einer 5% Kohlendioxidatmosphäre für eine Stunde und entfernen Sie das virale Inokulum aus der apikalen Kammer.Wechseln Sie das basale Medium des Membraneinsatzes in frisches RPMI-Medium und inkubieren Sie bei 35 Grad Celsius in einer Kohlendioxidatmosphäre von 5% für 24 bis 72 Stunden. Säen Sie die erforderliche Anzahl peripherer mononukleärer Blutzellen oder PBMCs in vollständigem RPMI-Medium, indem Sie die PBMC-Suspension vom ersten Tag an direkt in die Basalkammer jedes Vertiefungslochs infizierter HNECs geben. Bei 37 Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden inkubieren.Um den apikalen Überstand zu sammeln, fügen Sie 1x DBPS zu jeder apikalen Kammer hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Dann sammeln Sie das DPBS in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Aliquot den Überstand für den Plaque-Assay in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen und frieren Sie sofort sowohl die Brühe als auch die Aliquots bei minus 80 Grad Celsius ein.Um RNA-förmige HNECs zu sammeln, bringen Sie den Membraneinsatz in einen sauberen Brunnen. Fügen Sie RNA-Lysepuffer in die apikale Kammer hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Sammeln Sie den Überstand in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius bis zur RNA-Extraktion für die molekulare Analyse.Ernten Sie schließlich PBMCs, indem Sie die Oberfläche des Bohrlochs mit der breiten Basis einer sterilen Pipettenspitze vorsichtig abkratzen, um die aktivierten PBMCs zu entfernen, die an der Bohrlochoberfläche haften können. Sammeln Sie das PBMCs enthaltende Basalmedium in einem Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit 300 Mikrolitern 1x DPBS und sammeln Sie die Wäsche im selben Zwei-Milliliter-Rohr.Zentrifugieren Sie das Zwei-Milliliter-Röhrchen und sammeln Sie den Überstand in einem frischen Zwei-Milliliter-Röhrchen, ohne das Zellpellet zu stören. Lagern Sie den angesaugten Überstand bei minus 80 Grad Celsius für die Zytokin- und Chemokinanalyse. Resuspendiert das verbleibende Zellpellet in 200 Mikrolitern von 1x DPBS.Dieses Protokoll kann verwendet werden, um angeborene T-Zellen nach einer Influenza-Infektion zu untersuchen, ohne dass Epithel- und Immunzellen desselben Spenders benötigt werden. Eine Stichprobe der erwarteten Progression der HNESPCs, wenn sie auf der 3T3-Feederschicht wachsen, ist hier gezeigt. Diese wurden zur Differenzierung in der Luft/Flüssigkeits-Grenzflächenkultur verwendet, um mehrschichtige HNECs mit funktionellen, Flimmer- und Becherzellen zu erhalten.Mit Hilfe der HNECs kann die angeborene T-Zell-Aktivierung mittels Durchflusszytometrie untersucht werden. Diese Ergebnisse zeigen den Nachweis von schleimhautassoziierten invarianten T- oder MAIT-Zellen, V-Delta-Eins-, Gamma-Delta-T-Zellen und dem natürlichen Killer T oder NKT-Zellen. Diese Zellen waren in der Co-Kultur mit HNECs, die mit dem Influenzavirus infiziert waren, signifikant erhöht.Dieses Setup kann dann auf andere Influenzavirusstämme oder angeborene Immunzellpopulationen angewendet werden, um ihre jeweilige Aktivierung unter Co-Kulturbedingungen mit infizierten Epithelzellen zu beobachten. Eine genaue Berechnung der Anzahl der menschlichen Nasenepithelzellen, um sicherzustellen, dass die richtige Infektionsvielfalt verwendet wird, ist wichtig für ein optimales Niveau und den Zeitpunkt der Aktivierung. Das Übersprechen zwischen Epithelzellen und angeborenen Immunzellen gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit, und dies kann auf alle anderen Methoden der akuten oder chronischen Atemwegsimmunologie angewendet werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Die Quantifizierung der Atem Burst Antwort als Indikator für Angeborene Immunsystem Gesundheit in Zebrafisch

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Forschung

Immunologie und Infektion

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektions

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Ein Ex-Vivo Huhn Primärkultur Bursitis-Zelle Modell zur Bursitis Infektionskrankheit Virus Pathogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Ein Mausmodell zu beurteilen, angeborene Immunantwort auf Staphylococcus Aureus -Infektion

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Ein Galleria Mellonella mündliche Administrationsmodell zu Study Commensal-Induced angeborene Immunantwort

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Isolierung von Tonsillar Mononukleären Zellen zur Untersuchung von Ex-Vivo-angeborenen Immunantworten in einem menschlichen Mukosal-Lymphgewebe

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...