Name: contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection
Uploaded: 2021-02-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

ברצוננו להודות לצוות המחקר במחלקה לאוטולרנגולוגיה של NUS ולמחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה על עזרתם בעבודה הקשורה לתרבות HNEC ולתרבות ויראלית. ברצוננו גם להודות למנתחים ולצוות הכירורגי בבית החולים האוניברסיטאי הלאומי, המחלקה לאוטולרנגולוגיה, על עזרתם באספקת דגימות התא והדם הנדרשות למחקר. מחקר זה מומן על ידי המועצה הלאומית למחקר רפואי, סינגפור לא. NMRC/CIRG/1458/2016 (לדה יון וואנג) ו-MOH-OFYIRG19may-0007 (לקאי סן טאן). קאי סן טאן הוא מקבל תמיכה מלגה ממלגת מחקר לאלרגיה ואימונולוגיה קלינית (EAACI) אירופאית לשנת 2019.

הערה: עיין בטבלה 1 לקבלת מתכונים של מדיה המשמשת בפרוטוקול זה. הערה: hNECS גדל על טרנסוול 12-well נמצאו לגדול לתוך עובי אופטימלי יותר עבור גורמים מסיסים להגיע לתא הבסיס בקלות כאשר נגועים בנגיף שפעת. לפיכך מומלץ להשתמש בטרנסוול בגודל 12 היטב לתרבות משותפת.
1. הקמת שכבת המזין 3...

<ol>
	<li>Monto, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+and+antiviral+drugs+in+pandemic+preparedness.">Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).</li><li>Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+for+the+next+pandemic.">Preparing for the next pandemic.</a> The British Medical Journal. 346, 364 (2013).</li><li>Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+annual+production+cycle+for+influenza+vaccine.">The annual production cycle for influenza vaccine.</a> Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).</li><li>Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+burden+of+seasonal+influenza+in+the+United+States.">Economic burden of seasonal influenza in the United States.</a> Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).</li><li>Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+and+globalization.">COVID-19 and globalization.</a> One Health. 9, 100132 (2020).</li><li>Guo, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+transmission+and+clinical+therapies+on+coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+outbreak+-+an+update+on+the+status.">The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status.</a> Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).</li><li>Guan, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics+of+coronavirus+disease+2019+in+China.">Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China.</a> New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+are+activated+during+human+viral+infections.">MAIT cells are activated during human viral infections.</a> Nature Communications. 7, 11653 (2016).</li><li>Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammadelta+T+cells:+first+line+of+defense+and+beyond.">Gammadelta T cells: first line of defense and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+contribute+to+protection+against+lethal+influenza+infection+in+vivo.">MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo.</a> Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).</li><li>Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+layers+of+heterogeneity+and+subset+diversity+in+human+MAIT+cell+responses+to+distinct+microorganisms+and+to+innate+cytokines.">Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+cells+derived+from+multiple+individuals+exhibit+differential+responses+to+H3N2+influenza+virus+infection+in+vitro.">Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).</li><li>Luukkainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+co-culture+model+of+PBMC+and+stem+cell+derived+human+nasal+epithelium+reveals+rapid+activation+of+NK+and+innate+T+cells+upon+Influenza+A+virus+infection+of+the+nasal+epithelium.">A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+H3N2+influenza+virus-infected+human+nasal+epithelial+cells+from+multiple+subjects+reveals+molecular+pathways+associated+with+tissue+injury+and+complications.">RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications.</a> Cells. 8 (9), 986 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+lipopolysaccharide+on+diesel+exhaust+particle-induced+junctional+dysfunction+in+primary+human+nasal+epithelial+cells.">Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells.</a> Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).</li><li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+fully+differentiated+human+nasal+epithelial+cells+infected+with+rhinovirus+reveals+epithelium-initiated+immune+responses.">In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses.</a> Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomic+and+metagenomic+analyses+of+influenza+virus-infected+nasal+epithelial+cells+from+multiple+individuals+reveal+specific+nasal-initiated+signatures.">Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).</li><li>Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay">https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay</a> (2020)</li><li>Gamage, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+nasal+epithelial+cells+with+SARS-CoV-2+and+a+382-nt+deletion+isolate+lacking+ORF8+reveals+similar+viral+kinetics+and+host+transcriptional+profiles.">Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).</li><li>Zhao, X. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+nasal+epithelial+stem/progenitor+cells+to+produce+functioning+ciliated+cells+in+vitro.">The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro.</a> American Journal of Rhinology &amp; Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).</li></ol>

תגובות חיסוניות מולדות נגד וירוסים הן תחום מחקר שלא נחקר בניהול אנטי-ויראלי. תאי האפיתל בדרכי הנשימה ותאי החיסון המולדים פועלים בתיאום כדי לדכא שכפול ויראלי במהלך זיהום, מלבד לשמש כגורם דטרמיננטה של תגובה אדפטיבית מוגזמת אם העומס הנגיפי אינו נשמר בבדיקה 12,13,17....

וירוסים נשימתיים הם אולי בין הפתוגנים הנפוצים ביותר הגורמים לנטל בריאותי וכלכלי חמור. מההתפרצויות הגלובליות התקופתיות של זני מגיפה מתפתחים (למשל, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) ועד לזנים העונתיים של שפעת מדי שנה, וירוסים מהווים איום מתמיד על בריאות הציבור. למרות שחיסונים מהווים את עיקר התגובה לאתגרים גלובליים אלה של בריאות הציבור, זה מפוכח לציין כי אמצעי נגד אלה הם רק מגיבים 1,2. יתר על כן, עיכוב בין הופעתו של זן זיהומי חדש לבין הפיתוח המוצלח של החיסון שלו הוא בלתי נמנע3, מה שמוביל לתקופה שבה האמצעים הזמינים לריסון התפשטות הנגיף מוגבלים מאוד.
עיכובים אלה מודגשים עוד יותר על ידי העלויות הנגרמות על החברה-כלכלית והחברתית. השפעת העונתית לבדה אחראית לכ-8 מיליארד דולר בעלויות עקיפות, 3.2 מיליארד דולר בהוצאות רפואיות ו-36.3 אלף מקרי מוות בארצות הברית מדי שנה4. זאת לפני התחשבות בעלויות המחקר הדרושות למימון פיתוח חיסון. התפרצויות מגיפה יש השפעות חמורות עוד יותר על החברה, יחד עם הקצב הגובר של הגלובליזציה מדי שנה, כפי שמעידים השיבושים הגלובליים הנגרמים על ידי הופעתה והתפשטות מהירה של תסמונת נשימה חריפה חמורה coronovirus 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
מחקרים אחרונים הראו כי חולים נגועים שיש להם אוכלוסייה גדולה יותר של תאי T מולדים מופעלים נוטים להיות תוצאה טובה יותרשל המחלה 8,9,10. יתר על כן, אוכלוסיית תאי ה- T המולדת מסווגת לתת-קבוצות מרובות: תאי T (MAIT) הקשורים לריבית, תאי Vδ1 γδ T, תאי Vδ2 γδ T ותאי T הרוצח הטבעי (NKT). תת-קבוצות אלה של תאי T מולדים מציגות גם הטרוגניות בתוך האוכלוסיות שלהם, מה שמגביר את המורכבות של האינטראקציות בין אוכלוסיות התאים המעורבות בתגובה החיסונית המולדת11. לפיכך, המנגנון המפעיל תאי T מולדים אלה והידע של תת-קבוצות ספציפיות של תאי T מולדים עשוי לספק שדרה אחרת של מחקר כדי לצמצם את ההשפעות הזיהומיות של וירוסים אלה על הפונדקאי האנושי, במיוחד בתקופה של פיתוח החיסון.
תאי אפיתל נגועים בשפעת לייצר גורמים המפעילים תאי T מולדים במהירות 12,13,14. בהתבסס על ממצא זה, מודל תרבות משותף זה של ממשק אוויר-נוזלי (ALI) ללא מגע שואף לחקות את האינטראקציות הכימיות המוקדמות (בתיווך גורמים מסיסים שפורסמו על ידי שכבת האפיתל הנגועה) בין שכבת אפיתל האף הנגועה לבין ה- PBMCs במהלך ההדבקה המוקדמת. ההפרדה הפיזית בין שכבת האפיתל באף (בתרבית על תוספות ממברנה) לבין ה- PBMCs (בתא שמתחת) ושלמות האפיתל מונעים זיהום ישיר של ה- PBMCs על ידי הנגיף, ומאפשרים מחקר מפורט של ההשפעות של גורמי מסיסים שמקורם באפיתל על ה- PBMCs. לכן ניתן לחקור עוד יותר את הגורמים המזוהים על הפוטנציאל הטיפולי שלהם בגרימת אוכלוסיית תאי ה- T המולדת המתאימה שעשויה להגן מפני זיהום שפעת. מאמר זה פירט אפוא את השיטות של הקמת תרבות משותפת לחקר הפעלה מולדת של תאי T מגורמים מסיסים שמקורם באפיתל.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120086</td>
			<td>1.5mL Centrifuge Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366643</td>
			<td>10mL Blood Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3460</td>
			<td>membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120094</td>
			<td>2 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-l-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>533998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes (flow tubes)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-4-62 Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810709008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel CL-611</td>
			<td>FMC Biopolymer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Liquid Overlay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc</td>
			<td>171STND01</td>
			<td>Multiplex Manager Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly Needle 21 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>367287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>554722</td>
			<td>Fixation and Permeabilization Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Neutral Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTP Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM voltohmmeter device</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>1x Lysing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>188271</td>
			<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 50 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>227261</td>
			<td>50 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Start Essential DNA Probes Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6402682001</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Premium</td>
			<td>Research Instruments</td>
			<td>17544203</td>
			<td>Density Gradient Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 (A/Aichi/2/1968)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hNESPCs</td>
			<td>Human Donors</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Epithelial Growth Factor</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>7925</td>
			<td>Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>qPCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex</td>
			<td>Merck Pte Ltd</td>
			<td>HCP2MAG-62K-PX23</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1705</td>
			<td>RT-PCR 5x Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1706</td>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>554723</td>
			<td>Permeabilization Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10x Supplement</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>Random Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RNase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Part of 52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STX2 electrodes</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td>Electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Shaped 96-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection

האינטראקציות המוקדמות בין שכבת האפיתל באף לבין תאי החיסון המולדים במהלך זיהומים ויראליים נותרות אזור שלא נחקר. המשמעות של איתות חסינות מולדת בזיהומים ויראליים גדלה באופן משמעותי כמו חולים עם זיהומים בדרכי הנשימה המציגים הפעלה גבוהה של תאי T מולד להראות תוצאה טובה יותר של המחלה. לפיכך, ניתוח אינטראקציות חיסוניות מולדות מוקדמות אלה מאפשר הבהרה של התהליכים השולטים בהם ועשוי להקל על פיתוח מטרות טיפוליות פוטנציאליות ואסטרטגיות לשיכוך או אפילו למניעת התקדמות מוקדמת של זיהומים ויראליים. פרוטוקול זה מפרט מודל רב-תכליתי שניתן להשתמש בו כדי לחקור שיחות צולבות מוקדמות, אינטראקציות והפעלה של תאי חיסון מולדים מגורמים המופרשים על ידי תאי אפיתל נגועים בדרכי הנשימה. באמצעות נגיף שפעת H3N2 (A/Aichi/2/1968) כמודל הנגיף המייצג, הפעלה מולדת של תאים מונו-גרעיניים של דם היקפי בתרבית משותפת (PBMCs) נותחה באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לחקור את תת-קבוצות התאים המופעלים על ידי הגורמים המסיסים המשתחררים מהאפיתל בתגובה לזיהום הנגיפי. התוצאות ממחישות את אסטרטגיית ההצטיידות להבחנה בין תת-קבוצות התאים וחושפות את ההבדלים הברורים בין האוכלוסיות הפעילות של PBMCs לבין השיחה הצולבת שלהם עם האפיתל הנגוע והבקרה. לאחר מכן ניתן לנתח עוד יותר את קבוצות המשנה המופעלות כדי לקבוע את תפקודן, כמו גם שינויים מולקולריים ספציפיים לתאים. ממצאים מחקירה צולבת כזו עשויים לחשוף גורמים החשובים להפעלת אוכלוסיות תאים מולדות חיוניות, המועילות לשליטה ודיכוי התקדמות הזיהום הנגיפי. יתר על כן, גורמים אלה יכולים להיות מיושמים באופן אוניברסלי על מחלות ויראליות שונות, במיוחד על וירוסים חדשים המתעוררים, כדי לדכא את ההשפעה של וירוסים כאלה כאשר הם מסתובבים לראשונה באוכלוסיות אנושיות תמימות.

למרות שתאי T קונבנציונליים מהווים את הרפרטואר העיקרי של תגובה חיסונית אדפטיבית נגד זיהום ויראלי כדי להקל על הסיווג הנגיפי, אוכלוסיית תאי ה- T המולדת פועלת על פני ספקטרום רחב יותר כדי לדכא את העומס הנגיפי לשחרור יעיל בשלב מאוחר יותר. לכן, פרוטוקול זה יוצר באופן ספציפי מצב ח?...

Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection

פרוטוקול זה מפרט חקירה של האינטראקציות המוקדמות בין תאי אפיתל האף נגועים ויראלית והפעלת תאים מולדים. ניתן להבחין בין תת-קבוצות בודדות של תאי מערכת החיסון בהתבסס על הפעלתם בתגובה לזיהומים ויראליים. לאחר מכן הם יכולים להיחקר עוד יותר כדי לקבוע את השפעתם על תגובות אנטי ויראליות מוקדמות.

מודל תרבות משותפת ללא מגע לחקר הפעלת תאי מערכת החיסון המולדת במהלך זיהום בנגיף הנשימה

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The ...

פרוטוקול זה נועד לחקור שיחה צולבת של תאי אפיתל ותאי חיסון מולדים מהשורה הראשונה, במיוחד תאי T מולדים, וזה העניין שלנו. תאים ראשוניים ממקורות אנושיים משמשים בטכניקה זו, המאפשרת חקירה פרטנית של הצלב הפיזיולוגי הרלוונטי למה שקורה בבני אדם. תאי T מולדים היו מעורבים בשיפור ההישרדות של חולים נגועים בשפעת.לדעת איך הם מקבלים מופעלים יכול לעזור בפיתוח אנטי שפעת וטיפול אנטי ויראלי. שיטה זו נועדה לזהות גורמים שיכולים להפעיל את תאי ה- T המולדים, אשר עשויים לסייע בפיתוח אמצעי מניעה נגד הידבקות בנגיף בדרכי הנשימה. ביום אפס, להדביק תאי אפיתל האף האנושי, או HNECs.ראשית, לספור תאים על ידי הוספת 150 microliters של 1x טריפסין EDTA לתא apical של תוספת הממברנה ו 350 מיקרוליטרים של 1x טריפסין EDTA לחדר הבסיס של הבאר הייצוגית. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות או עד התאים להתנתק מן הממברנה. לשטוף את התאים על הממברנה על ידי צנרת למעלה ולמטה ולאסוף את ההשעיה בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.הוסף 200 מיקרוליטרים של DMEM כדי להרוות את פעילות הטריפסין. לאחר מכן, לספור תאים באמצעות כתמים כחולים טריפאן. חשב את הריבוי הנדרש של זיהום, או MOI, של הנגיף בהתבסס על ספירת התאים לבאר.לדלל את מלאי הווירוס בהתאם עם RPMI מלא על קרח. עבור הבארות הנותרות לניסוי הזיהום, להוסיף אחד 1x DPBS לתוך החדרים האפיים של מוסיף הממברנה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולהסיר את 1x DPBS.שנה את המדיום הבסיסי בממברנה מוסיף כדי להשלים מדיום RPMI על ידי העברת התוספות לצלחת חדשה עם RPMI מלא הוסיף הבארות. הוסף את inoculum וירוס מוכן לתוך התא האפוי של תוספת הממברנה. יש לדגור ב-35 מעלות צלזיוס באטמוספרה של 5% פחמן דו-חמצני למשך שעה אחת ולהסיר את האינוקלום הנגיפי מתא האפי.שנה את המדיום הבסיסי של תוספת הממברנה למדיום RPMI טרי ודגר ב 35 מעלות צלזיוס באטמוספרה של 5% פחמן דו חמצני במשך 24 עד 72 שעות. זרע את המספר הנדרש של תאים חד גרעיניים בדם היקפי, או PBMCs, במדיום RPMI מלא על ידי הוספה ישירה של השעיית PBMC לתא הבסיס של כל באר של HNECs נגועים מיום אפס. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 עד 48 שעות.כדי לאסוף את supernatant apical, להוסיף 1x DBPS לכל תא apical ודגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, לאסוף את DPBS בצינורות 1.5 מיליליטר. Aliquot supernatant עבור בדיקת פלאק בצינור חדש 1.5 מיליליטר ומיד להקפיא הן את המניה ואת aliquots במינוס 80 מעלות צלזיוס.כדי לאסוף HNECs בצורת RNA, להעביר את תוספת הממברנה לבאר נקייה. מוסיפים את מאגר תמוגת הרנ"א לתא האפוי ודגורים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאסוף את supernatant בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד מיצוי RNA לניתוח מולקולרי.לבסוף, לקצור PBMCs על ידי גירוד בעדינות את פני השטח של הבאר עם הבסיס הרחב של קצה פיפטה סטרילי כדי לחלץ את המחשבים PBMCs מופעלים שעשויים להיות דבקים על פני השטח של הבאר. לאסוף את המדיום הבסיסי המכיל PBMCs בצינור צנטריפוגה שני מיליליטר. לשטוף את הבארות פעמיים עם 300 microliters של 1x DPBS ולאסוף את הכביסה באותו צינור שני מיליליטר.צנטריפוגה צינור שני מיליליטר ולאסוף את supernatant בצינור שני מילימטר טרי מבלי להפריע גלולה התא. אחסן את הסופר-נרטיב השאפתן במינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוח ציטוקינים וכימוקין. Resuspend גלולה התא הנותרת ב 200 microliters של 1x DPBS.פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד תאי T מולדים בעקבות זיהום שפעת ללא צורך בתאי אפיתל ומערכת החיסון מאותו תורם. מדגם של ההתקדמות הצפויה של HNESPCs כפי שהם גדלים על שכבת מזין 3T3 מוצג כאן. אלה שימשו לבידול בתרבית ממשק האוויר/נוזל כדי להשיג HNECs רב שכבתיים עם תאים פונקציונליים, ciliated, וגביע.באמצעות HNECs, הפעלת תאי T מולדת ניתן לחקור באמצעות cytometry זרימה. תוצאות אלה מראות את הזיהוי של תאי T invariant הקשורים לרית, או תאי MAIT, דלתא V אחד, תאי דלתא גמא T, ואת הרוצח הטבעי T, או תאי NKT. תאים אלה גדלו באופן משמעותי בתרבות משותפת מעורבים HNECs נגועים בנגיף שפעת.התקנה זו יכולה להיות מיושמת לאחר מכן על זני וירוס שפעת אחרים, או אוכלוסיות תאי מערכת החיסון המולדת כדי לבחון את ההפעלה שלהם בהתאמה בתנאי תרבות משותפת עם תאי אפיתל נגועים. חישוב מדויק של מספר תאי האפיתל של האף האנושי כדי להבטיח כי ריבוי נכון של זיהום משמש חשוב עבור רמות אופטימליות ותזמון של הפעלה. שיחה צולבת בין תאי אפיתל לתאי מערכת החיסון המולדים צוברים יותר ויותר תשומת לב, וזה יכול להיות מיושם עוד יותר על כל שיטות אחרות המערבות אימונולוגיה נשימתית חריפה או כרונית.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

כימות תגובת Burst נשימה כאינדיקטור של החיסון מולדת בריאות בדג הזברה

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

הדמיה לא פולשנית של התגובה החיסונית המולדת בדגם דג הזברה הזחל של<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; זיהום

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

מודל תרבות Bursal-תא ראשי לשעבר Vivo עוף ללמוד פתוגנזה וירוס מחלה זיהומית Bursal

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

דגם העכבר כדי להעריך מולדת התגובה החיסונית לזיהום Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

גלרייה mellonella מודל הניהול אוראלי את תגובות מערכת החיסון מולדים Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

בידוד של התאים המוננובית מונמונומנט ללמוד Ex Vivo מולדת תגובות החיסונית ברקמת הלימפה של האדם Mucosal

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...