Name: contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection
Uploaded: 2021-02-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

Vorremmo ringraziare il personale di ricerca del Dipartimento di Otorinolaringoiatria della NUS e del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia per il loro aiuto con il lavoro relativo alla cultura hNEC e alla cultura virale. Vorremmo anche ringraziare i chirurghi e il team chirurgico del National University Hospital, Dipartimento di Otorinolaringoiatria, per la loro assistenza nel fornire i campioni di cellule e sangue necessari per lo studio. Questo studio è stato finanziato dal National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (a De Yun Wang) e MOH-OFYIRG19may-0007 (a Kai Sen Tan). Kai Sen Tan ha ricevuto una borsa di studio sostenuta dalla European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.

NOTA: fare riferimento alla Tabella 1 per le ricette dei supporti utilizzati in questo protocollo. NOTA: hNECS coltivati su transwell a 12 pozzetti sono stati trovati per crescere in uno spessore più ottimale per i fattori solubili per raggiungere facilmente la camera basale quando infettati dal virus dell'influenza. Quindi si raccomanda l'uso di transwell di dimensioni 12-well per la co-coltura.
1. Istituzione dello strato di alimentazione 3T3
<ol><li>Stabilimento a par...

<ol>
	<li>Monto, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+and+antiviral+drugs+in+pandemic+preparedness.">Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).</li><li>Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+for+the+next+pandemic.">Preparing for the next pandemic.</a> The British Medical Journal. 346, 364 (2013).</li><li>Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+annual+production+cycle+for+influenza+vaccine.">The annual production cycle for influenza vaccine.</a> Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).</li><li>Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+burden+of+seasonal+influenza+in+the+United+States.">Economic burden of seasonal influenza in the United States.</a> Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).</li><li>Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+and+globalization.">COVID-19 and globalization.</a> One Health. 9, 100132 (2020).</li><li>Guo, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+transmission+and+clinical+therapies+on+coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+outbreak+-+an+update+on+the+status.">The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status.</a> Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).</li><li>Guan, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics+of+coronavirus+disease+2019+in+China.">Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China.</a> New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+are+activated+during+human+viral+infections.">MAIT cells are activated during human viral infections.</a> Nature Communications. 7, 11653 (2016).</li><li>Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammadelta+T+cells:+first+line+of+defense+and+beyond.">Gammadelta T cells: first line of defense and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+contribute+to+protection+against+lethal+influenza+infection+in+vivo.">MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo.</a> Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).</li><li>Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+layers+of+heterogeneity+and+subset+diversity+in+human+MAIT+cell+responses+to+distinct+microorganisms+and+to+innate+cytokines.">Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+cells+derived+from+multiple+individuals+exhibit+differential+responses+to+H3N2+influenza+virus+infection+in+vitro.">Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).</li><li>Luukkainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+co-culture+model+of+PBMC+and+stem+cell+derived+human+nasal+epithelium+reveals+rapid+activation+of+NK+and+innate+T+cells+upon+Influenza+A+virus+infection+of+the+nasal+epithelium.">A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+H3N2+influenza+virus-infected+human+nasal+epithelial+cells+from+multiple+subjects+reveals+molecular+pathways+associated+with+tissue+injury+and+complications.">RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications.</a> Cells. 8 (9), 986 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+lipopolysaccharide+on+diesel+exhaust+particle-induced+junctional+dysfunction+in+primary+human+nasal+epithelial+cells.">Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells.</a> Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).</li><li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+fully+differentiated+human+nasal+epithelial+cells+infected+with+rhinovirus+reveals+epithelium-initiated+immune+responses.">In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses.</a> Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomic+and+metagenomic+analyses+of+influenza+virus-infected+nasal+epithelial+cells+from+multiple+individuals+reveal+specific+nasal-initiated+signatures.">Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).</li><li>Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay">https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay</a> (2020)</li><li>Gamage, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+nasal+epithelial+cells+with+SARS-CoV-2+and+a+382-nt+deletion+isolate+lacking+ORF8+reveals+similar+viral+kinetics+and+host+transcriptional+profiles.">Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).</li><li>Zhao, X. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+nasal+epithelial+stem/progenitor+cells+to+produce+functioning+ciliated+cells+in+vitro.">The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro.</a> American Journal of Rhinology &amp; Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).</li></ol>

Le risposte immunitarie innate contro i virus sono un campo di studio poco studiato nella gestione antivirale. Le cellule epiteliali delle vie aeree e le cellule immunitarie innate lavorano di concerto per sopprimere la replicazione virale durante un'infezione, oltre a servire come determinante della risposta adattativa iperattiva se la carica virale non viene tenuta sotto controllo 12,13,17. Tuttavia, lo sviluppo di un modello ...

I virus respiratori sono forse tra i patogeni più diffusi che causano gravi oneri sanitari ed economici. Dai periodici focolai globali di ceppi epidemici emergenti (ad esempio, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) ai ceppi stagionali di influenza ogni anno, i virus sono una minaccia costante per la salute pubblica. Sebbene i vaccini costituiscano la maggior parte della risposta a queste sfide globali per la salute pubblica, fa riflettere notare che queste contromisure sono semplicemente reattive 1,2. Inoltre, un ritardo tra l'emergere di un nuovo ceppo infettivo e il successo dello sviluppo del suo vaccino è inevitabile3, portando a un periodo in cui le misure disponibili per frenare la diffusione del virus sono altamente limitate.
Questi ritardi sono ulteriormente enfatizzati dai costi che vengono inflitti alla società, economicamente e socialmente. L'influenza stagionale da sola è responsabile di circa 8 miliardi di dollari di costi indiretti, 3,2 miliardi di dollari di spese mediche e 36,3 mila morti negli Stati Uniti d'America ogni anno4. Questo prima di considerare i costi di ricerca necessari per finanziare lo sviluppo del vaccino. Le epidemie hanno effetti ancora più gravi sulla società, aggravati dal crescente tasso di globalizzazione ogni anno, come evidenziato dalle interruzioni globali causate dall'emergere e dalla rapida diffusione del coronovirus della sindrome respiratoria acuta grave 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
Studi recenti hanno dimostrato che i pazienti infetti che hanno una maggiore popolazione di cellule T innate attivate tendono ad avere un esito migliore della malattia 8,9,10. Inoltre, la popolazione innata di cellule T è classificata in più sottogruppi: le cellule T invarianti associate alla mucosa (MAIT), le cellule T Vδ1 γδ, le cellule T Vδ2 γδ e le cellule T natural killer (NKT). Questi sottogruppi di cellule T innate mostrano anche eterogeneità all'interno delle loro popolazioni, aumentando la complessità delle interazioni tra le popolazioni cellulari coinvolte nella risposta immunitaria innata11. Quindi, il meccanismo che attiva queste cellule T innate e la conoscenza dei sottogruppi specifici di cellule T innate possono fornire una diversa via di ricerca per ridurre gli effetti infettivi di questi virus sull'ospite umano, specialmente durante il periodo di sviluppo del vaccino.
Le cellule epiteliali infettate dall'influenza producono fattori che attivano rapidamente le cellule T innate 12,13,14. Basandosi su questa scoperta, questo modello di co-coltura Air-Liquid Interface (ALI) senza contatto mira a imitare le prime interazioni chimiche (mediate da fattori solubili rilasciati dallo strato epiteliale infetto) tra lo strato epiteliale nasale infetto e le PBMC durante l'infezione precoce. La separazione fisica tra lo strato epiteliale nasale (coltivato su inserti di membrana) e le PBMC (nella camera sottostante) e l'integrità epiteliale prevengono l'infezione diretta delle PBMC da parte del virus, consentendo uno studio dettagliato degli effetti dei fattori solubili derivati dall'epitelio sulle PBMC. I fattori identificati possono quindi essere ulteriormente studiati per il loro potenziale terapeutico nell'indurre l'appropriata popolazione di cellule T innate che possono proteggere dall'infezione influenzale. Questo documento ha quindi dettagliato i metodi per stabilire una co-coltura per lo studio dell'attivazione innata delle cellule T da fattori solubili derivati dall'epitelio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120086</td>
			<td>1.5mL Centrifuge Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366643</td>
			<td>10mL Blood Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3460</td>
			<td>membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120094</td>
			<td>2 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-l-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>533998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes (flow tubes)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-4-62 Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810709008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel CL-611</td>
			<td>FMC Biopolymer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Liquid Overlay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc</td>
			<td>171STND01</td>
			<td>Multiplex Manager Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly Needle 21 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>367287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>554722</td>
			<td>Fixation and Permeabilization Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Neutral Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTP Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM voltohmmeter device</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>1x Lysing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>188271</td>
			<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 50 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>227261</td>
			<td>50 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Start Essential DNA Probes Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6402682001</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Premium</td>
			<td>Research Instruments</td>
			<td>17544203</td>
			<td>Density Gradient Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 (A/Aichi/2/1968)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hNESPCs</td>
			<td>Human Donors</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Epithelial Growth Factor</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>7925</td>
			<td>Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>qPCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex</td>
			<td>Merck Pte Ltd</td>
			<td>HCP2MAG-62K-PX23</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1705</td>
			<td>RT-PCR 5x Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1706</td>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>554723</td>
			<td>Permeabilization Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10x Supplement</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>Random Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RNase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Part of 52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STX2 electrodes</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td>Electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Shaped 96-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection

Le prime interazioni tra lo strato epiteliale nasale e le cellule immunitarie innate durante le infezioni virali rimangono un'area poco esplorata. Il significato della segnalazione dell'immunità innata nelle infezioni virali è aumentato sostanzialmente poiché i pazienti con infezioni respiratorie che mostrano un'elevata attivazione innata delle cellule T mostrano un esito migliore della malattia. Quindi, sezionare queste prime interazioni immunitarie innate consente di chiarire i processi che le governano e può facilitare lo sviluppo di potenziali bersagli terapeutici e strategie per smorzare o addirittura prevenire la progressione precoce delle infezioni virali. Questo protocollo descrive un modello versatile che può essere utilizzato per studiare la diafonia precoce, le interazioni e l'attivazione delle cellule immunitarie innate da fattori secreti da cellule epiteliali delle vie aeree infettate viralmente. Utilizzando un virus influenzale H3N2 (A/Aichi/2/1968) come modello di virus rappresentativo, l'attivazione cellulare innata delle cellule mononucleate del sangue periferico co-coltivate (PBMC) è stata analizzata utilizzando la citometria a flusso per studiare i sottoinsiemi di cellule che vengono attivate dai fattori solubili rilasciati dall'epitelio in risposta all'infezione virale. I risultati dimostrano la strategia di gating per differenziare i sottoinsiemi di cellule e rivelano le chiare differenze tra le popolazioni attivate di PBMC e il loro crosstalk con il controllo e l'epitelio infetto. I sottoinsiemi attivati possono quindi essere ulteriormente analizzati per determinare le loro funzioni e i cambiamenti molecolari specifici delle cellule. I risultati di tale indagine crosstalk possono scoprire fattori importanti per l'attivazione di popolazioni cellulari innate vitali, che sono utili nel controllare e sopprimere la progressione dell'infezione virale. Inoltre, questi fattori possono essere universalmente applicati a diverse malattie virali, in particolare ai virus emergenti di recente, per smorzare l'impatto di tali virus quando circolano per la prima volta in popolazioni umane ingenue.

Sebbene le cellule T convenzionali costituiscano il principale repertorio di risposta immunitaria adattativa contro l'infezione virale per facilitare la clearance virale, la popolazione innata di cellule T lavora su uno spettro più ampio per sopprimere la carica virale per una clearance efficace in una fase successiva. Pertanto, questo protocollo crea specificamente una condizione robusta per studiare le cellule T innate, la loro attivazione e la loro popolazione funzionale a seguito del...

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Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection

Questo protocollo descrive in dettaglio un'indagine sulle prime interazioni tra cellule epiteliali nasali infettate viralmente e attivazione cellulare innata. I singoli sottoinsiemi di cellule immunitarie possono essere distinti in base alla loro attivazione in risposta alle infezioni virali. Possono quindi essere ulteriormente studiati per determinare i loro effetti sulle prime risposte antivirali.

Modello di co-coltura senza contatto per lo studio dell'attivazione delle cellule immunitarie innate durante l'infezione da virus respiratorio

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The ...

Questo protocollo è progettato per studiare il crosstalk delle cellule epiteliali e delle cellule immunitarie innate di prima linea, in particolare le cellule T innate, che è il nostro interesse. Le cellule primarie provenienti da fonti umane sono utilizzate in questa tecnica, consentendo l'indagine individuale del crosstalk fisiologico rilevante per ciò che sta accadendo negli esseri umani. Le cellule T innate sono state implicate nel miglioramento della sopravvivenza dei pazienti con infezione da influenza.Sapere come vengono attivati potrebbe aiutare a sviluppare una terapia anti-influenzale e antivirale. Questo metodo è progettato per identificare i fattori che possono attivare le cellule T innate, che possono aiutare a sviluppare misure preventive contro l'infezione da virus respiratorio. Al giorno zero, infettare le cellule epiteliali nasali umane o HNEC.In primo luogo, contare le cellule aggiungendo 150 microlitri di 1x tripsina EDTA alla camera apicale dell'inserto di membrana e 350 microlitri di 1x tripsina EDTA alla camera basale del pozzo rappresentativo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 10 minuti o fino a quando le cellule si staccano dalla membrana. Lavare le cellule sulla membrana tubando su e giù e raccogliere la sospensione in un tubo centrifugo da 1,5 millilitri.Aggiungi 200 microlitri di DMEM per spegnere l'attività della tripsina. Quindi, conta le cellule tramite la colorazione blu trypan. Calcola la molteplicità richiesta di infezione, o MOI, del virus in base al conteggio delle cellule per pozzo.Diluire lo stock di virus di conseguenza con RPMI completo sul ghiaccio. Per i restanti pozzetti per l'esperimento di infezione, aggiungere un DPBS 1x nelle camere apicali degli inserti di membrana. Incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti e rimuovere il DPBS 1x.Cambiare il mezzo basale negli inserti a membrana per completare il mezzo RPMI trasferendo gli inserti su una nuova piastra con RPMI completo aggiunto ai pozzetti. Aggiungere l'inoculo virale preparato nella camera apicale dell'inserto di membrana. Incubare a 35 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% per un'ora e rimuovere l'inoculo virale dalla camera apicale.Cambiare il mezzo basale dell'inserto della membrana in mezzo RPMI fresco e incubare a 35 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% per 24-72 ore. Seminare il numero richiesto di cellule mononucleate del sangue periferico, o PBMC, in mezzo RPMI completo aggiungendo direttamente la sospensione PBMC nella camera basale di ciascun pozzetto di HNEC infetti dal giorno zero. Incubare a 37 gradi Celsius per 24-48 ore.Per raccogliere il surnatante apicale, aggiungere 1x DBPS a ciascuna camera apicale e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, raccogliere il DPBS in tubi da 1,5 millilitri. Aliquotare il surnatante per il saggio della placca in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e congelare immediatamente sia il calcio che le aliquote a meno 80 gradi Celsius.Per raccogliere HNEC in forma di RNA, trasferire l'inserto della membrana in un pozzo pulito. Aggiungere il tampone di lisi dell'RNA alla camera apicale e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Raccogliere il surnatante in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione dell'RNA per l'analisi molecolare.Infine, raccogliere i PBMC raschiando delicatamente la superficie del pozzo con l'ampia base di una punta di pipetta sterile per rimuovere i PBMC attivati che possono essere aderenti alla superficie del pozzo. Raccogliere il mezzo basale contenente PBMC in un tubo di centrifuga da due millilitri. Lavare i pozzetti due volte con 300 microlitri di 1x DPBS e raccogliere il lavaggio nello stesso tubo da due millilitri.Centrifugare il tubo da due millilitri e raccogliere il surnatante in un tubo fresco da due millilitri senza disturbare il pellet cellulare. Conservare il surnatante aspirato a meno 80 gradi Celsius per l'analisi delle citochine e delle chemochine. Risospesciare il pellet di cella rimanente in 200 microlitri da 1x DPBS.Questo protocollo può essere utilizzato per studiare le cellule T innate a seguito di infezione influenzale senza la necessità di cellule epiteliali e immunitarie dello stesso donatore. Un esempio della progressione prevista degli HNESPC man mano che crescono sullo strato di alimentazione 3T3 è mostrato qui. Questi sono stati utilizzati per la differenziazione nella coltura dell'interfaccia aria/liquido per ottenere HNEC multistrato con cellule funzionali, ciliate e caliciformi.Utilizzando gli HNEC, l'attivazione innata delle cellule T può essere studiata utilizzando la citometria a flusso. Questi risultati mostrano il rilevamento di cellule T invarianti associate alla mucosa, o cellule MAIT, V delta uno, cellule T gamma delta e cellule T natural killer o NKT. Queste cellule sono state significativamente aumentate in co-coltura che coinvolge HNEC infettate dal virus dell'influenza.Questa configurazione può quindi essere applicata ad altri ceppi di virus influenzali o popolazioni di cellule immunitarie innate per osservare la loro rispettiva attivazione in condizioni di co-coltura con cellule epiteliali infette. Il calcolo accurato del numero di cellule epiteliali nasali umane per garantire che venga utilizzata la giusta molteplicità di infezione è importante per livelli ottimali e tempi di attivazione. La diafonia tra cellule epiteliali e cellule immunitarie innate sta guadagnando sempre più attenzione, e questo può essere applicato ulteriormente a qualsiasi altro metodo che coinvolga l'immunologia respiratoria acuta o cronica.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Quantificazione della risposta Burst respiratoria come un indicatore di Innate Immune Salute in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

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Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Generazione di Linfonodo grassi Pad Chimere per lo studio del linfonodo stromale origine cellulare

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

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In Analisi Vitro di Myd88 mediata Cellular Immune Response to West Nile virus mutante Strain Infezione

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

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Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infezione

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

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A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

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