Name: contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection
Uploaded: 2021-02-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

우리는 hNEC 문화 및 바이러스 문화 관련 작업에 도움을 주신 NUS 이비인후과 및 미생물학 및 면역학과의 연구 직원에게 감사드립니다. 우리는 또한 연구에 필요한 세포 및 혈액 샘플을 제공하는 데 도움을 주신 국립 대학 병원, 이비인후과 국립대학 병원의 외과 의사 및 외과 팀에 감사드립니다. 이 연구는 National Medical Research Council, Singapore No.의 지원을 받았습니다. NMRC / CIRG / 1458 / 2016 (De Yun Wang까지) 및 MOH-OFYIRG19may-0007 (Kai Sen Tan까지). Kai Sen Tan은 유럽 알레르기 및 임상 면역학 (EAACI) Research Fellowship 2019의 펠로우십 지원을 받았습니다.

참고: 이 프로토콜에 사용되는 미디어의 제조법은 표 1 을 참조하십시오. 참고: 12-웰 트랜스웰에서 자란 hNECS는 인플루엔자 바이러스에 감염되었을 때 용해성 인자가 기저실에 쉽게 도달할 수 있도록 최적의 두께로 성장하는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 공동 문화를 위해 12 웰 크기의 트랜스웰을 사용하는 것이 좋습니다.
1. 3T3 피더층의 확립
<ol><li>냉동 주식?...

<ol>
	<li>Monto, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+and+antiviral+drugs+in+pandemic+preparedness.">Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).</li><li>Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+for+the+next+pandemic.">Preparing for the next pandemic.</a> The British Medical Journal. 346, 364 (2013).</li><li>Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+annual+production+cycle+for+influenza+vaccine.">The annual production cycle for influenza vaccine.</a> Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).</li><li>Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+burden+of+seasonal+influenza+in+the+United+States.">Economic burden of seasonal influenza in the United States.</a> Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).</li><li>Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+and+globalization.">COVID-19 and globalization.</a> One Health. 9, 100132 (2020).</li><li>Guo, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+transmission+and+clinical+therapies+on+coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+outbreak+-+an+update+on+the+status.">The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status.</a> Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).</li><li>Guan, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics+of+coronavirus+disease+2019+in+China.">Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China.</a> New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+are+activated+during+human+viral+infections.">MAIT cells are activated during human viral infections.</a> Nature Communications. 7, 11653 (2016).</li><li>Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammadelta+T+cells:+first+line+of+defense+and+beyond.">Gammadelta T cells: first line of defense and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+contribute+to+protection+against+lethal+influenza+infection+in+vivo.">MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo.</a> Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).</li><li>Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+layers+of+heterogeneity+and+subset+diversity+in+human+MAIT+cell+responses+to+distinct+microorganisms+and+to+innate+cytokines.">Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+cells+derived+from+multiple+individuals+exhibit+differential+responses+to+H3N2+influenza+virus+infection+in+vitro.">Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).</li><li>Luukkainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+co-culture+model+of+PBMC+and+stem+cell+derived+human+nasal+epithelium+reveals+rapid+activation+of+NK+and+innate+T+cells+upon+Influenza+A+virus+infection+of+the+nasal+epithelium.">A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+H3N2+influenza+virus-infected+human+nasal+epithelial+cells+from+multiple+subjects+reveals+molecular+pathways+associated+with+tissue+injury+and+complications.">RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications.</a> Cells. 8 (9), 986 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+lipopolysaccharide+on+diesel+exhaust+particle-induced+junctional+dysfunction+in+primary+human+nasal+epithelial+cells.">Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells.</a> Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).</li><li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+fully+differentiated+human+nasal+epithelial+cells+infected+with+rhinovirus+reveals+epithelium-initiated+immune+responses.">In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses.</a> Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomic+and+metagenomic+analyses+of+influenza+virus-infected+nasal+epithelial+cells+from+multiple+individuals+reveal+specific+nasal-initiated+signatures.">Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).</li><li>Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay">https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay</a> (2020)</li><li>Gamage, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+nasal+epithelial+cells+with+SARS-CoV-2+and+a+382-nt+deletion+isolate+lacking+ORF8+reveals+similar+viral+kinetics+and+host+transcriptional+profiles.">Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).</li><li>Zhao, X. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+nasal+epithelial+stem/progenitor+cells+to+produce+functioning+ciliated+cells+in+vitro.">The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro.</a> American Journal of Rhinology &amp; Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).</li></ol>

바이러스에 대한 선천적 면역 반응은 항 바이러스 관리에 대한 조사가 부족한 연구 분야입니다. 기도 상피 세포와 선천적 면역 세포는 바이러스 부하가 유지되지 않을 경우 과민성 적응 반응의 결정 요인으로 작용하는 것 외에도 감염 중에 바이러스 복제를 억제하기 위해 함께 작용합니다12,13,17. 그러나, 적절한 항바이러스 반...

호흡기 바이러스는 아마도 심각한 건강 관리 및 경제적 부담을 초래하는 가장 널리 퍼진 병원체 중 하나 일 것입니다. 신흥 유행성 균주 (예 : H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19)의 정기적 인 세계적 발병에서부터 매년 인플루엔자의 계절적 변종에 이르기까지 바이러스는 공중 보건에 지속적인 위협이됩니다. 백신이 이러한 세계 공중 보건 문제에 대한 대응의 주요 대부분을 형성하지만, 이러한 대응 조치는 단지 1,2에 불과하다는 점에 유의하는 것은 냉정합니다. 또한, 새로운 감염성 균주의 출현과 백신의 성공적인 개발 사이의 지연은 불가피하며3, 바이러스의 확산을 억제하기 위한 가능한 조치가 매우 제한적인 시기로 이어진다.
이러한 지연은 경제적, 사회적으로 사회에 가해지는 비용에 의해 더욱 강조됩니다. 계절성 독감 만 간접 비용으로 약 80 억 달러, 의료 비용 3.2 억 달러, 미국에서 매년 36.3 천 명의 사망자를 초래합니다4. 이것은 백신 개발 자금을 조달하는 데 필요한 연구 비용을 고려하기 전입니다. 전염병 발생은 심각한 급성 호흡기 증후군 코로 노 바이러스 2 (SARS-CoV-2)5,6,7의 출현과 급속한 확산으로 인한 세계적인 혼란으로 입증 된 바와 같이 매년 세계화의 증가율에 의해 복합적으로 사회에 더욱 심각한 영향을 미칩니다.
최근 연구에 따르면 활성화 된 선천적 T 세포 집단이 더 많은 감염된 환자는 더 나은 질병 결과 8,9,10을 갖는 경향이 있습니다. 더욱이, 선천적 T 세포 집단은 다수의 하위군으로 분류된다: 점막-관련 불변 T (MAIT) 세포, Vδ1 γδ T 세포, Vδ2 γδ T 세포, 및 자연 살해 T (NKT) 세포. 선천적 T 세포의 이들 하위군은 또한 그들의 집단 내에서 이질성을 나타내어, 선천적 면역 반응에 관여하는 세포 집단 사이의 상호작용의 복잡성을 증가시킨다(11). 따라서, 이러한 선천적 T 세포를 활성화시키는 메카니즘 및 선천적 T 세포의 특정 하위군에 대한 지식은 특히 백신 개발 기간 동안 인간 숙주에 대한 이들 바이러스의 감염성 효과를 감소시키기 위한 연구의 다른 길을 제공할 수 있다.
인플루엔자에 의해 감염된 상피 세포는 선천적 T 세포를 빠르게 활성화시키는 인자를 생산한다12,13,14. 이러한 발견을 바탕으로 이 비접촉식 공기-액체 인터페이스(ALI) 공동 배양 모델은 초기 감염 동안 감염된 비강 상피층과 PBMC 사이의 초기 화학적 상호작용(감염된 상피층에 의해 방출되는 가용성 인자에 의해 매개됨)을 모방하는 것을 목표로 합니다. 비강 상피층(막 삽입물에서 배양됨)과 PBMCs(아래 챔버 내) 사이의 물리적 분리와 상피 완전성은 바이러스에 의한 PBMC의 직접적인 감염을 방지하여, 상피 유래 가용성 인자가 PBMC에 미치는 영향에 대한 상세한 연구를 가능하게 한다. 따라서 확인된 인자는 인플루엔자 감염으로부터 보호할 수 있는 적절한 선천적 T 세포 집단을 유도하는데 있어서 그들의 치료 잠재력에 대해 추가로 조사될 수 있다. 따라서이 논문은 상피 유래 가용성 인자로부터의 선천적 T 세포 활성화의 연구를 위한 공동 배양을 확립하는 방법을 상세히 기술하였다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120086</td>
			<td>1.5mL Centrifuge Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366643</td>
			<td>10mL Blood Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3460</td>
			<td>membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120094</td>
			<td>2 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-l-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>533998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes (flow tubes)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-4-62 Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810709008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel CL-611</td>
			<td>FMC Biopolymer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Liquid Overlay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc</td>
			<td>171STND01</td>
			<td>Multiplex Manager Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly Needle 21 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>367287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>554722</td>
			<td>Fixation and Permeabilization Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Neutral Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTP Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM voltohmmeter device</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>1x Lysing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>188271</td>
			<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 50 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>227261</td>
			<td>50 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Start Essential DNA Probes Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6402682001</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Premium</td>
			<td>Research Instruments</td>
			<td>17544203</td>
			<td>Density Gradient Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 (A/Aichi/2/1968)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hNESPCs</td>
			<td>Human Donors</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Epithelial Growth Factor</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>7925</td>
			<td>Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>qPCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex</td>
			<td>Merck Pte Ltd</td>
			<td>HCP2MAG-62K-PX23</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1705</td>
			<td>RT-PCR 5x Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1706</td>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>554723</td>
			<td>Permeabilization Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10x Supplement</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>Random Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RNase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Part of 52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STX2 electrodes</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td>Electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Shaped 96-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection

바이러스 감염 중 비강 상피층과 선천적 면역 세포 사이의 초기 상호 작용은 아직 탐구되지 않은 영역으로 남아 있습니다. 바이러스 감염에서 선천적 면역 신호전달의 중요성은 높은 선천적 T 세포 활성화를 나타내는 호흡기 감염 환자가 더 나은 질병 결과를 보임에 따라 실질적으로 증가하였다. 따라서, 이러한 초기 선천적 면역 상호작용을 해부하는 것은 이들을 지배하는 과정의 해명을 허용하고, 바이러스 감염의 초기 진행을 감쇠시키거나 심지어 예방하기 위한 잠재적인 치료 표적 및 전략의 개발을 촉진할 수 있다. 이 프로토콜은 바이러스적으로 감염된 기도 상피 세포에 의해 분비되는 인자로부터 초기 누화, 상호작용 및 선천적 면역 세포의 활성화를 연구하는데 사용될 수 있는 다목적 모델을 상세히 기술한다. 대표적인 바이러스 모델로 H3N2 인플루엔자 바이러스(A/Aichi/2/1968)를 사용하여 공동 배양된 말초혈액 단핵구(PBMCs)의 선천적 세포 활성화를 유세포 분석기를 사용하여 바이러스 감염에 반응하여 상피에서 방출되는 가용성 인자에 의해 활성화되는 세포의 하위 집합을 조사하기 위해 분석되었습니다. 이 결과는 세포의 서브셋을 분화시키기 위한 게이팅 전략을 입증하고, PBMCs의 활성화된 집단과 대조군 및 감염된 상피와의 그들의 누화 사이의 명확한 차이를 드러낸다. 그 다음, 활성화된 서브세트는 그들의 기능뿐만 아니라 세포에 특이적인 분자 변화를 결정하기 위해 추가로 분석될 수 있다. 이러한 누화 조사의 결과는 바이러스 감염의 진행을 통제하고 억제하는 데 도움이되는 중요한 선천적 세포 집단의 활성화에 중요한 요인을 발견 할 수 있습니다. 또한, 이러한 요인은 다른 바이러스 질환, 특히 새로 출현하는 바이러스에 보편적으로 적용되어 순진한 인간 집단에서 처음 순환 할 때 그러한 바이러스의 영향을 약화시킬 수 있습니다.

기존의 T 세포가 바이러스 제거를 촉진하기 위해 바이러스 감염에 대한 적응 면역 반응의 주요 레퍼토리를 형성하지만, 선천적 인 T 세포 집단은 나중 단계에서 효과적인 클리어런스를 위해 바이러스 부하를 억제하기 위해 더 넓은 스펙트럼에 걸쳐 작동합니다. 따라서, 이 프로토콜은 특히 동일한 기증자로부터의 상피 및 면역 세포 샘플을 필요로 하지 않고 인플루엔자 감...

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Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection

이 프로토콜은 바이러스적으로 감염된 비강 상피 세포와 선천적 세포 활성화 사이의 초기 상호 작용에 대한 조사를 자세히 설명합니다. 면역 세포의 개별 서브세트는 바이러스 감염에 대한 반응에서의 그들의 활성화에 기초하여 구별될 수 있다. 그런 다음 초기 항 바이러스 반응에 미치는 영향을 결정하기 위해 더 조사 할 수 있습니다.

호흡기 바이러스 감염 동안 선천적 면역 세포 활성화의 연구를 위한 비접촉식 공동 배양 모델

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The ...

이 프로토콜은 상피 세포와 첫 번째 라인 선천적 면역 세포, 특히 우리의 관심사 인 선천적 인 T 세포의 누화를 조사하기 위해 고안되었습니다. 인간 근원의 일차 세포는이 기술에 사용되어 인간에서 일어나는 일과 관련된 생리 학적 누화에 대한 개별적인 조사를 가능하게합니다. 선천적 T 세포는 인플루엔자 감염 환자의 생존을 개선하는 데 연루되어 있다.그들이 어떻게 활성화되는지 알면 항 인플루엔자 및 항 바이러스 요법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 선천적 인 T 세포를 활성화시킬 수있는 요인을 식별하도록 설계되었으며, 이는 호흡기 바이러스 감염에 대한 예방 조치를 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 제로 데이에 인간 비강 상피 세포 또는 HNEC를 감염시킵니다.먼저, 150 마이크로리터의 1x 트립신 EDTA를 멤브레인 인서트의 정점 챔버에 첨가하고 350 마이크로리터의 1x 트립신 EDTA를 대표 웰의 기저 챔버에 첨가하여 세포를 계수한다. 세포를 섭씨 37도에서 10분 동안 또는 세포가 막으로부터 분리될 때까지 배양한다. 세포를 위아래로 피펫팅하여 멤브레인 상에 플러시하고 현탁액을 1.5 밀리리터 원심분리 튜브에 수집한다.트립신 활성을 급냉시키기 위해 200 마이크로리터의 DMEM을 첨가한다. 그런 다음, 트리판 블루 염색을 통해 세포를 계수한다. 웰당 세포 수를 기준으로 바이러스의 필요한 감염 다중도 또는 MOI를 계산합니다.얼음 위에 완전한 RPMI로 그에 따라 바이러스 스톡을 희석하십시오. 감염 실험을 위한 나머지 웰의 경우, 멤브레인 인서트의 정점 챔버에 1x DPBS 1개를 첨가한다. 섭씨 37도에서 10분 동안 배양하고 1x DPBS를 제거하였다.멤브레인 인서트의 기본 배지를 완전한 RPMI 배지로 변경하여 인서트를 웰에 완전한 RPMI가 추가된 새로운 플레이트로 옮기면 완전한 RPMI 배지가 된다. 준비된 바이러스 접종물을 막 삽입물의 정점 챔버에 첨가하십시오. 섭씨 35도에서 5% 이산화탄소 분위기에서 한 시간 동안 배양하고 정점 챔버에서 바이러스 접종물을 제거한다.멤브레인 인서트의 기본 배지를 신선한 RPMI 배지로 변경하고 5% 이산화탄소 분위기에서 섭씨 35도에서 24 내지 72시간 동안 배양한다. 필요한 수의 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMCs를 완전한 RPMI 배지에 시드하고, PBMC 현탁액을 감염된 HNECs의 각 웰의 기저 챔버 내로 직접 첨가함으로써 제로로부터 시드한다. 섭씨 37도에서 24 ~ 48 시간 동안 배양하십시오.정점 상청액을 수집하려면 각 정점 챔버에 1x DBPS를 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 DPBS를 1.5 밀리리터 튜브에 수집하십시오. 플라크 분석을 위해 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 분취시키고 영하 80도에서 주식과 분취량을 즉시 동결시킵니다.RNA 형태의 HNEC를 수집하려면 멤브레인 삽입물을 깨끗한 웰로 옮깁니다. RNA 용해 완충액을 정점 챔버에 첨가하고 실온에서 다섯 분 동안 인큐베이션한다. 상층액을 1.5밀리리터 원심분리 튜브에 모아 분자 분석을 위해 RNA가 추출될 때까지 섭씨 영하 80도에 보관합니다.마지막으로, 멸균 피펫 팁의 넓은 베이스로 웰의 표면을 부드럽게 긁어내어 웰 표면에 부착될 수 있는 활성화된 PBMCs를 제거함으로써 PBMCs를 수확한다. PBMCs를 함유하는 기초 배지를 두 밀리리터 원심분리 튜브에 수집한다. 300 마이크로리터의 1x DPBS로 웰을 두 번 플러시하고 동일한 2 밀리리터 튜브에서 세척을 수집하십시오.두 밀리리터 튜브를 원심분리하고, 세포 펠릿을 방해하지 않고 신선한 두 밀리리터 튜브에서 상청액을 수집한다. 흡기 된 상청액을 사이토 카인 및 케모카인 분석을 위해 영하 80도에 보관하십시오. 나머지 세포 펠릿을 200 마이크로리터의 1x DPBS에 재현탁시킨다.이 프로토콜은 동일한 기증자로부터의 상피 및 면역 세포를 필요로 하지 않고 인플루엔자 감염 후 선천적 T 세포를 연구하는데 사용될 수 있다. HNESPCs가 3T3 피더 층 상에서 성장할 때 예상되는 진행의 샘플이 여기에 도시되어 있다. 이들은 기능성, 섬모 및 잔 세포를 가진 다층 HNEC를 얻기 위해 공기 / 액체 계면 배양에서 분화에 사용되었습니다.HNECs를 사용하여, 선천적 T 세포 활성화는 유세포 분석기를 사용하여 조사될 수 있다. 이들 결과는 점막-관련 불변 T, 또는 MAIT 세포, V 델타원, 감마 델타 T 세포, 및 자연 살해 T, 또는 NKT 세포의 검출을 보여준다. 이들 세포는 인플루엔자 바이러스에 감염된 HNECs를 수반하는 공동 배양에서 유의하게 증가하였다.이 설정은 이어서 다른 인플루엔자 바이러스 균주 또는 선천적 면역 세포 집단에 적용되어 감염된 상피 세포와의 공동 배양 조건 하에서 이들의 각각의 활성화를 관찰할 수 있다. 감염의 올바른 다중성이 사용되도록 하기 위해 인간 비강 상피 세포의 수를 정확하게 계산하는 것은 최적의 수준과 활성화 타이밍에 중요하다. 상피 세포와 선천적 면역 세포 사이의 누화는 점점 더 주목을 받고 있으며, 이는 급성 또는 만성 호흡기 면역학을 포함하는 다른 방법에 추가로 적용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

제브라 피쉬의 선천성 면역 건강의 지표로 호흡 버스트 응답의 정량화

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

의 Zebrafish의 애벌레 모델의 선천성 면역 반응의 비 침습적 영상<em&gt; 연쇄상 구균 iniae</em&gt; 감염

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

마우스 모델을 평가 타고 난 면역 반응 포도 상 구 균 감염

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

갤러리아 mellonella 구강 관리 모델 Study Commensal-Induced 타고 난 면역 반응에

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

편도선 단핵 세포의 격리는 인간 점막 림프구 조직에서 Ex Vivo 타고난 면역 반응을 연구합니다

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...