Name: contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection
Uploaded: 2021-02-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

Vi vil takke vitenskapelig ansatte ved NUS Institutt for otolaryngologi og Institutt for mikrobiologi og immunologi for deres hjelp med hNEC kultur- og viralkulturrelatert arbeid. Vi vil også takke kirurgene og operasjonsteamet ved Nasjonalt universitetssykehus, Institutt for otolaryngologi, for deres hjelp til å gi cellen og blodprøvene som kreves for studien. Denne studien ble finansiert av National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (til De Yun Wang) og MOH-OFYIRG19may-0007 (til Kai Sen Tan). Kai Sen Tan er mottaker av stipendiatstøtte fra European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.

MERK: Se tabell 1 for oppskrifter på medier som brukes i denne protokollen. MERK: HNECS dyrket på 12-brønns transwell har vist seg å vokse til mer optimal tykkelse for løselige faktorer for å nå basalkammeret lett når smittet med influensavirus. Derfor anbefales bruk av 12-brønns transwell for samkultur.
1. Etablering av 3T3 materlaget
<ol><li>Etablering fra frosne aksjer<ol>
<li>Tine en kryopisial av NIH /3T3 fibroblaster fra frosne lagre. Legg til innholdet i k...

<ol>
	<li>Monto, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+and+antiviral+drugs+in+pandemic+preparedness.">Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).</li><li>Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+for+the+next+pandemic.">Preparing for the next pandemic.</a> The British Medical Journal. 346, 364 (2013).</li><li>Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+annual+production+cycle+for+influenza+vaccine.">The annual production cycle for influenza vaccine.</a> Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).</li><li>Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+burden+of+seasonal+influenza+in+the+United+States.">Economic burden of seasonal influenza in the United States.</a> Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).</li><li>Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+and+globalization.">COVID-19 and globalization.</a> One Health. 9, 100132 (2020).</li><li>Guo, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+transmission+and+clinical+therapies+on+coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+outbreak+-+an+update+on+the+status.">The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status.</a> Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).</li><li>Guan, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics+of+coronavirus+disease+2019+in+China.">Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China.</a> New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+are+activated+during+human+viral+infections.">MAIT cells are activated during human viral infections.</a> Nature Communications. 7, 11653 (2016).</li><li>Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammadelta+T+cells:+first+line+of+defense+and+beyond.">Gammadelta T cells: first line of defense and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+contribute+to+protection+against+lethal+influenza+infection+in+vivo.">MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo.</a> Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).</li><li>Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+layers+of+heterogeneity+and+subset+diversity+in+human+MAIT+cell+responses+to+distinct+microorganisms+and+to+innate+cytokines.">Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+cells+derived+from+multiple+individuals+exhibit+differential+responses+to+H3N2+influenza+virus+infection+in+vitro.">Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).</li><li>Luukkainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+co-culture+model+of+PBMC+and+stem+cell+derived+human+nasal+epithelium+reveals+rapid+activation+of+NK+and+innate+T+cells+upon+Influenza+A+virus+infection+of+the+nasal+epithelium.">A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+H3N2+influenza+virus-infected+human+nasal+epithelial+cells+from+multiple+subjects+reveals+molecular+pathways+associated+with+tissue+injury+and+complications.">RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications.</a> Cells. 8 (9), 986 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+lipopolysaccharide+on+diesel+exhaust+particle-induced+junctional+dysfunction+in+primary+human+nasal+epithelial+cells.">Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells.</a> Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).</li><li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+fully+differentiated+human+nasal+epithelial+cells+infected+with+rhinovirus+reveals+epithelium-initiated+immune+responses.">In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses.</a> Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomic+and+metagenomic+analyses+of+influenza+virus-infected+nasal+epithelial+cells+from+multiple+individuals+reveal+specific+nasal-initiated+signatures.">Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).</li><li>Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay">https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay</a> (2020)</li><li>Gamage, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+nasal+epithelial+cells+with+SARS-CoV-2+and+a+382-nt+deletion+isolate+lacking+ORF8+reveals+similar+viral+kinetics+and+host+transcriptional+profiles.">Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).</li><li>Zhao, X. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+nasal+epithelial+stem/progenitor+cells+to+produce+functioning+ciliated+cells+in+vitro.">The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro.</a> American Journal of Rhinology &amp; Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).</li></ol>

Medfødte immunresponser mot virus er et under-undersøkt studiefelt i antiviral behandling. Luftveis epitelceller og medfødte immunceller fungerer sammen for å undertrykke viral replikasjon under en infeksjon, i tillegg til å fungere som en determinant for overaktiv adaptiv respons hvis virusbelastningen ikke holdes i sjakk 12,13,17. Utviklingen av en relevant menneskelig modell for studiet av epitel-medfødt immunkorstale f...

Respiratoriske virus er kanskje blant de mest utbredte patogenene som forårsaker alvorlig helsehjelp og økonomisk byrde. Fra de periodiske globale utbruddene av fremvoksende epidemiske stammer (f.eks. H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) til de sesongmessige belastningene av influensa hvert år, er virus en konstant trussel mot folkehelsen. Selv om vaksiner utgjør hoveddelen av responsen på disse globale folkehelseutfordringene, er det nøkternt å merke seg at disse mottiltakene bare er responsive 1,2. Videre er en forsinkelse mellom fremveksten av en ny smittsom stamme og den vellykkede utviklingen av vaksinen uunngåelig3, noe som fører til en periode da tiltak tilgjengelig for å dempe spredningen av viruset er svært begrenset.
Disse forsinkelsene understrekes videre av kostnadene som påføres samfunnet økonomisk og sosialt. Sesonginfluensaen alene er ansvarlig for omtrent 8 milliarder dollar i indirekte kostnader, 3,2 milliarder dollar i medisinske kostnader og 36,3 tusen dødsfall i USA årlig4. Dette er før vurdering av forskningskostnadene som er nødvendige for å finansiere vaksineutvikling. Epidemiske utbrudd har enda mer alvorlige effekter på samfunnet, forsterket av den økende globaliseringsraten hvert år, noe som fremgår av de globale forstyrrelsene forårsaket av fremveksten og rask spredning av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronovirus 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
Nyere studier har vist at infiserte pasienter som har en større populasjon av aktiverte medfødte T-celler har en tendens til å ha et bedre sykdomsutfall 8,9,10. Videre er den medfødte T-cellepopulasjonen kategorisert i flere undergrupper: de mucosal-assosierte invariante T (MAIT) cellene, Vδ1 γδ T-celler, Vδ2 γδ T-celler og de naturlige killer T (NKT) cellene. Disse undergruppene av medfødte T-celler viser også heterogenitet i populasjonene, noe som øker kompleksiteten i interaksjonene mellom cellepopulasjonene som er involvert i den medfødte immunresponsen11. Derfor kan mekanismen som aktiverer disse medfødte T-cellene og kunnskapen om de spesifikke undergruppene av medfødte T-celler gi en annen måte å forske på for å begrense de smittsomme effektene av disse virusene på den menneskelige verten, spesielt i løpet av vaksineutviklingsperioden.
Epitelceller infisert av influensa produserer faktorer som aktiverer medfødte T-celler raskt 12,13,14. Basert på dette funnet, har denne kontaktfrie Air-Liquid Interface (ALI) samkulturmodellen som mål å etterligne de tidlige kjemiske interaksjonene (mediert av løselige faktorer utgitt av det infiserte epitellaget) mellom det infiserte neseepitellaget og PBMC-ene under tidlig infeksjon. Den fysiske separasjonen mellom neseepitelelaget (dyrket på membraninnlegg) og PBMC-ene (i kammeret under) og epitelintegriteten forhindrer direkte infeksjon av PBMC-ene av viruset, noe som gir en detaljert studie av effekten av epitelavledede løselige faktorer på PBMC-ene. De identifiserte faktorene kan derfor undersøkes nærmere for deres terapeutiske potensial i å indusere den aktuelle medfødte T-cellepopulasjonen som kan beskytte mot influensainfeksjon. Dette dokumentet har derfor detaljert metodene for å etablere en medkultur for studiet av medfødt T-celleaktivering fra epitel-avledede løselige faktorer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120086</td>
			<td>1.5mL Centrifuge Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366643</td>
			<td>10mL Blood Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3460</td>
			<td>membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120094</td>
			<td>2 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-l-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>533998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes (flow tubes)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-4-62 Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810709008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel CL-611</td>
			<td>FMC Biopolymer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Liquid Overlay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc</td>
			<td>171STND01</td>
			<td>Multiplex Manager Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly Needle 21 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>367287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>554722</td>
			<td>Fixation and Permeabilization Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Neutral Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTP Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM voltohmmeter device</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>1x Lysing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>188271</td>
			<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 50 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>227261</td>
			<td>50 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Start Essential DNA Probes Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6402682001</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Premium</td>
			<td>Research Instruments</td>
			<td>17544203</td>
			<td>Density Gradient Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 (A/Aichi/2/1968)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hNESPCs</td>
			<td>Human Donors</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Epithelial Growth Factor</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>7925</td>
			<td>Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>qPCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex</td>
			<td>Merck Pte Ltd</td>
			<td>HCP2MAG-62K-PX23</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1705</td>
			<td>RT-PCR 5x Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1706</td>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>554723</td>
			<td>Permeabilization Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10x Supplement</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>Random Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RNase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Part of 52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STX2 electrodes</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td>Electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Shaped 96-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection

De tidlige interaksjonene mellom neseepitelandslaget og de medfødte immuncellene under virusinfeksjoner forblir et underutforsuppet område. Betydningen av medfødt immunitetssignalering ved virusinfeksjoner har økt betydelig ettersom pasienter med luftveisinfeksjoner som viser høy medfødt T-celleaktivering, viser et bedre sykdomsutfall. Derfor tillater dissekering av disse tidlige medfødte immuninteraksjonene belysningen av prosessene som styrer dem og kan lette utviklingen av potensielle terapeutiske mål og strategier for demping eller til og med forhindre tidlig progresjon av virusinfeksjoner. Denne protokollen beskriver en allsidig modell som kan brukes til å studere tidlig krysstale, interaksjoner og aktivering av medfødte immunceller fra faktorer utskilt av viralt infiserte luftveisepitelceller. Ved hjelp av et H3N2 influensavirus (A/Aichi/2/1968) som representativ virusmodell, har medfødt celleaktivering av samkulturerte perifere mononukleære celler i perifert blod (PBMCer) blitt analysert ved hjelp av strømningscytometri for å undersøke undergruppene av celler som aktiveres av de løselige faktorene som frigjøres fra epitelet som svar på virusinfeksjonen. Resultatene viser gating strategien for å differensiere undergrupper av celler og avsløre de klare forskjellene mellom de aktiverte populasjonene av PBMCs og deres krysstale med kontroll og infisert epitel. De aktiverte delsettene kan deretter analyseres ytterligere for å bestemme deres funksjoner samt molekylære endringer som er spesifikke for cellene. Funn fra en slik krysstaleundersøkelse kan avdekke faktorer som er viktige for aktivering av vitale medfødte cellepopulasjoner, som er gunstige for å kontrollere og undertrykke utviklingen av virusinfeksjon. Videre kan disse faktorene brukes universelt på forskjellige virussykdommer, spesielt for nylig fremvoksende virus, for å dempe virkningen av slike virus når de først sirkulerer i naive menneskelige populasjoner.

Selv om konvensjonelle T-celler danner det viktigste repertoaret av adaptiv immunrespons mot virusinfeksjon for å lette viral clearance, fungerer den medfødte T-cellepopulasjonen over et bredere spekter for å undertrykke virusbelastningen for effektiv clearance på et senere tidspunkt. Derfor skaper denne protokollen spesielt en robust tilstand for å studere medfødte T-celler, deres aktivering og deres funksjonelle befolkning etter influensainfeksjon, uten å trenge epitel- og immunc...

Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection

Denne protokollen beskriver en undersøkelse av de tidlige interaksjonene mellom viralt infiserte neseepitelceller og medfødt celleaktivering. Individuelle undergrupper av immunceller kan skille seg ut basert på deres aktivering som svar på virusinfeksjoner. De kan deretter undersøkes nærmere for å fastslå deres effekter på tidlige antivirale responser.

Kontaktfri samkulturmodell for studiet av medfødt immuncelleaktivering under luftveisvirusinfeksjon

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The ...

Denne protokollen er designet for å undersøke krysstale av epitelceller og førstelinje medfødte immunceller, spesielt medfødte T-celler, som er vår interesse. Primære celler fra menneskelige kilder brukes i denne teknikken, slik at individuell undersøkelse av fysiologisk krysstale er relevant for hva som skjer hos mennesker. Medfødte T-celler har vært involvert i å forbedre overlevelsen til influensainfiserte pasienter.Å vite hvordan de blir aktivert kan bidra til å utvikle anti-influensa og antiviral terapi. Denne metoden er designet for å identifisere faktorer som kan aktivere de medfødte T-cellene, noe som kan bidra til å utvikle forebyggende tiltak mot luftveisvirusinfeksjon. På dag null, infisere menneskelige nese epitelceller, eller HNECs.Først teller du celler ved å legge til 150 mikroliter 1x trypsin EDTA til det apikale kammeret i membraninnsatsen og 350 mikroliter 1x trypsin EDTA til basalkammeret til den representative brønnen. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius i 10 minutter eller til cellene løsner fra membranen. Skyll cellene på membranen ved å pipettere opp og ned og samle suspensjonen i et sentrifugerør på 1,5 milliliter.Tilsett 200 mikroliter DMEM for å slukke trypsinaktivitet. Tell deretter celler via trypan blå farging. Beregn den nødvendige multiplisiteten av infeksjon, eller MOI, av viruset basert på celleantall per brønn.Fortynn virusbestanden tilsvarende med fullstendig RPMI på is. For de resterende brønnene for infeksjonsforsøket, legg til en 1x DPBS i de apikale kamrene i membraninnsatsene. Inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter og fjern 1x DPBS.Endre basalmediet i membraninnsatsene for å fullføre RPMI-mediet ved å overføre innsatsene til en ny plate med fullstendig RPMI lagt til brønnene. Tilsett det tilberedte viruset inoculum i det apikale kammeret i membraninnsatsen. Inkuber ved 35 grader Celsius i en 5% karbondioksid atmosfære i en time og fjern viral inoculum fra det apikale kammeret.Endre basalmediet til membraninnsatsen til friskt RPMI-medium og inkuber ved 35 grader Celsius i en 5% karbondioksidatmosfære i 24 til 72 timer. Frø det nødvendige antallet perifere mononukleære celler i blodet, eller PBMCer, i komplett RPMI-medium ved å legge PBMC-suspensjonen direkte inn i basalkammeret til hver brønn av infiserte HNECer fra dag null. Inkuber ved 37 grader Celsius i 24 til 48 timer.For å samle den apikale supernatanten, legg 1x DBPS til hvert apikale kammer og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Samle deretter DPBS i 1,5 milliliter rør. Aliquot supernatant for plakk analysen i en ny 1,5 milliliter rør og umiddelbart fryse både lager og aliquots på minus 80 grader Celsius.For å samle RNA-form HNECs, overfør membraninnsatsen til en ren brønn. Tilsett RNA lysis buffer til det apikale kammeret og inkuber ved romtemperatur i fem minutter. Samle supernatanten i et 1,5 milliliter sentrifugerrør og lagre det på minus 80 grader Celsius til RNA-ekstraksjon for molekylær analyse.Til slutt høster du PBMCer ved å skrape overflaten av brønnen forsiktig med den brede basen av en steril pipettespiss for å løsne de aktiverte PBMCene som kan festes til brønnoverflaten. Samle basalmediet som inneholder PBMCer i et sentrifugerør med to milliliter. Skyll brønnene to ganger med 300 mikroliter 1x DPBS og samle vasken i samme to milliliterrør.Sentrifuger to milliliterrøret og samle supernatanten i et friskt to milliliterrør uten å forstyrre cellepelleten. Oppbevar den aspirerte supernatanten ved minus 80 grader Celsius for cytokin- og kjemokinanalyse. Resuspend den gjenværende cellepellet i 200 mikroliter av 1x DPBS.Denne protokollen kan brukes til å studere medfødte T-celler etter influensainfeksjon uten behov for epitel- og immunceller fra samme donor. Et utvalg av forventet progresjon av HNESPCene etter hvert som de vokser på 3T3-materlaget, vises her. Disse ble brukt til differensiering i luft/væske-grensesnittkulturen for å oppnå flerlags HNECer med funksjonelle, ciliated og begerceller.Ved hjelp av HNECene kan medfødt T-celleaktivering undersøkes ved hjelp av strømningscytometri. Disse resultatene viser påvisning av mucosal-assosiert invariant T, eller MAIT celler, V delta en, gamma delta T celler, og den naturlige killer T, eller NKT celler. Disse cellene ble betydelig økt i samkultur som involverte HNECs infisert med influensavirus.Dette oppsettet kan deretter brukes på andre influensavirusstammer, eller medfødte immuncellepopulasjoner for å observere deres respektive aktivering under samkulturelle forhold med infiserte epitelceller. Nøyaktig beregning av antall humane neseepitelceller for å sikre at riktig multiplisitet av infeksjon brukes er viktig for optimale nivåer og tidspunkt for aktivering. Krysstale mellom epitelceller og medfødte immunceller får i økende grad oppmerksomhet, og dette kan brukes videre på andre metoder som involverer akutt eller kronisk respiratorisk immunologi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Etablering av en flytende dekket Culture of Polarized Menneskelig Airway Epiteliale Calu-3 Cells å studere Host Cell Response til luftveispatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantifisering av Respiratory Burst Response som en indikator på medfødte immun Health i sebrafisk

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Ved hjelp av RNA-interferens for å undersøke det medfødte immunrespons i Musemakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analyse av MyD88-mediert cellulær immunrespons til West Nile Virus Mutant Strain Infeksjon

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasiv Imaging av det medfødte immunrespons i en Sebrafisk Larve Modell av<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infeksjon

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

En musemodell å vurdere medfødte immunforsvaret til Staphylococcus aureus infeksjoner

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Galleria mellonella muntlig administrasjonsmodell til Study Commensal-Induced medfødte immunreaksjoner

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Isolering av tonsillar mononukleære celler for å studere ex vivo medfødte immunresponser i et humant slimhinnelymfoid vev

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...