Name: contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection
Uploaded: 2021-02-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer à equipe de pesquisa do Departamento de Otorquinologia e Departamento de Microbiologia e Imunologia da NUS por sua ajuda com o trabalho relacionado à cultura e à cultura viral do HNEC. Gostaríamos também de agradecer aos cirurgiões e equipe cirúrgica do Hospital Universitário Nacional, Departamento de Otormologia, por sua ajuda no fornecimento das amostras de células e sangue necessárias para o estudo. Este estudo foi financiado pelo National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (para De Yun Wang) e MOH-OFYIRG19may-0007 (para Kai Sen Tan). Kai Sen Tan é um beneficiário do apoio de bolsas da European Allergy and Clinical Imunology (EAACI) Research Fellowship 2019.

NOTA: Consulte a Tabela 1 para receitas de mídia utilizadas neste protocolo. NOTA: o hNECS cultivado em transwell de 12 poços foi encontrado para crescer em espessura mais ideal para fatores solúveis para chegar à câmara basal prontamente quando infectados com o vírus influenza. Por isso, recomenda-se o uso de transwell de 12 bem dimensionados para a cocultura.
1. Estabelecimento da camada alimentador 3T3
<ol><li>Estabelecimento de estoques congelados<ol>
<li>Descon...

<ol>
	<li>Monto, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+and+antiviral+drugs+in+pandemic+preparedness.">Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).</li><li>Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+for+the+next+pandemic.">Preparing for the next pandemic.</a> The British Medical Journal. 346, 364 (2013).</li><li>Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+annual+production+cycle+for+influenza+vaccine.">The annual production cycle for influenza vaccine.</a> Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).</li><li>Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+burden+of+seasonal+influenza+in+the+United+States.">Economic burden of seasonal influenza in the United States.</a> Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).</li><li>Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+and+globalization.">COVID-19 and globalization.</a> One Health. 9, 100132 (2020).</li><li>Guo, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+transmission+and+clinical+therapies+on+coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+outbreak+-+an+update+on+the+status.">The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status.</a> Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).</li><li>Guan, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics+of+coronavirus+disease+2019+in+China.">Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China.</a> New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+are+activated+during+human+viral+infections.">MAIT cells are activated during human viral infections.</a> Nature Communications. 7, 11653 (2016).</li><li>Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammadelta+T+cells:+first+line+of+defense+and+beyond.">Gammadelta T cells: first line of defense and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+contribute+to+protection+against+lethal+influenza+infection+in+vivo.">MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo.</a> Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).</li><li>Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+layers+of+heterogeneity+and+subset+diversity+in+human+MAIT+cell+responses+to+distinct+microorganisms+and+to+innate+cytokines.">Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+cells+derived+from+multiple+individuals+exhibit+differential+responses+to+H3N2+influenza+virus+infection+in+vitro.">Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).</li><li>Luukkainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+co-culture+model+of+PBMC+and+stem+cell+derived+human+nasal+epithelium+reveals+rapid+activation+of+NK+and+innate+T+cells+upon+Influenza+A+virus+infection+of+the+nasal+epithelium.">A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+H3N2+influenza+virus-infected+human+nasal+epithelial+cells+from+multiple+subjects+reveals+molecular+pathways+associated+with+tissue+injury+and+complications.">RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications.</a> Cells. 8 (9), 986 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+lipopolysaccharide+on+diesel+exhaust+particle-induced+junctional+dysfunction+in+primary+human+nasal+epithelial+cells.">Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells.</a> Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).</li><li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+fully+differentiated+human+nasal+epithelial+cells+infected+with+rhinovirus+reveals+epithelium-initiated+immune+responses.">In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses.</a> Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomic+and+metagenomic+analyses+of+influenza+virus-infected+nasal+epithelial+cells+from+multiple+individuals+reveal+specific+nasal-initiated+signatures.">Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).</li><li>Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay">https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay</a> (2020)</li><li>Gamage, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+nasal+epithelial+cells+with+SARS-CoV-2+and+a+382-nt+deletion+isolate+lacking+ORF8+reveals+similar+viral+kinetics+and+host+transcriptional+profiles.">Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).</li><li>Zhao, X. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+nasal+epithelial+stem/progenitor+cells+to+produce+functioning+ciliated+cells+in+vitro.">The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro.</a> American Journal of Rhinology &amp; Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).</li></ol>

As respostas imunológicas inatas contra vírus são um campo de estudo pouco investigado no manejo antiviral. As células epiteliais das vias aéreas e as células imunes inatas trabalham em conjunto para suprimir a replicação viral durante uma infecção, além de servir como determinante de resposta adaptativa hiperativa se a carga viral não for mantida em xeque 12,13,17. No entanto, o desenvolvimento de um modelo humano r...

Os vírus respiratórios estão talvez entre os patógenos mais difundidos que causam cuidados de saúde graves e carga econômica. Desde os surtos globais periódicos de cepas epidêmicas emergentes (por exemplo, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) até as cepas sazonais da gripe todos os anos, os vírus são uma ameaça constante à saúde pública. Embora as vacinas formem a maior parte da resposta a esses desafios globais de saúde pública, é preocupante notar que essas contramedidas sãomeramente responsivas 1,2. Além disso, um atraso entre o surgimento de uma nova cepa infecciosa e o desenvolvimento bem-sucedido de sua vacina é inevitável3, levando a um período em que as medidas disponíveis para conter a propagação do vírus são altamente limitadas.
Esses atrasos são ainda mais enfatizados pelos custos que são infligidos à sociedade economicamente e socialmente. Só a gripe sazonal é responsável por aproximadamente US$ 8 bilhões em custos indiretos, US$ 3,2 bilhões em custos médicos e 36,3 mil mortes nos Estados Unidos da América anualmente4. Isso é antes da consideração dos custos de pesquisa necessários para financiar o desenvolvimento de vacinas. Surtos epidêmicos têm efeitos ainda mais graves na sociedade, agravados pelo aumento da taxa de globalização a cada ano, como evidenciado pelas perturbações globais causadas pelo surgimento e rápida disseminação da síndrome respiratória aguda grave coronovírus 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
Estudos recentes têm mostrado que pacientes infectados com maior população de células T inatas ativadas tendem a ter um melhor desfecho da doença 8,9,10. Além disso, a população de células T inatas é categorizada em múltiplos subgrupos: as células invariantes associadas à mucosa T (MAIT), células Vδ1 γδ T, células Vδ2 γδ T e as células T (NKT) assassinas naturais. Esses subgrupos de células T inatas também apresentam heterogeneidade dentro de suas populações, aumentando a complexidade das interações entre as populações celulares envolvidas na resposta imune inata11. Assim, o mecanismo que ativa essas células T inatas e o conhecimento dos subgrupos específicos de células T inatas podem fornecer uma via diferente de pesquisa para reduzir os efeitos infecciosos desses vírus no hospedeiro humano, especialmente durante o período de desenvolvimento vacinal.
As células epiteliais infectadas pela gripe produzem fatores que ativam rapidamenteas células T inatas 12,13,14. Com base nessa descoberta, este modelo de co-cultura de Interface Ar-Líquido (ALI) sem contato tem como objetivo imitar as interações químicas iniciais (mediadas por fatores solúveis liberados pela camada epitelial infectada) entre a camada epitelial nasal infectada e os PBMCs durante a infecção precoce. A separação física entre a camada epitelial nasal (cultivada nas pastilhas de membrana) e os PBMCs (na câmara inferior) e a integridade epitelial previne a infecção direta dos PBMCs pelo vírus, permitindo um estudo detalhado dos efeitos dos fatores solúveis derivados da epitelial nos PBMCs. Os fatores identificados podem, portanto, ser investigados por seu potencial terapêutico em induzir a população de células T inatas apropriadas que possam proteger contra a infecção por gripe. Este artigo, portanto, detalhou os métodos de estabelecer uma cocultura para o estudo da ativação inata de células T a partir de fatores solúveis derivados do epitélio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120086</td>
			<td>1.5mL Centrifuge Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366643</td>
			<td>10mL Blood Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3460</td>
			<td>membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120094</td>
			<td>2 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-l-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>533998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes (flow tubes)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-4-62 Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810709008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel CL-611</td>
			<td>FMC Biopolymer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Liquid Overlay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc</td>
			<td>171STND01</td>
			<td>Multiplex Manager Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly Needle 21 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>367287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>554722</td>
			<td>Fixation and Permeabilization Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Neutral Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTP Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM voltohmmeter device</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>1x Lysing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>188271</td>
			<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 50 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>227261</td>
			<td>50 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Start Essential DNA Probes Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6402682001</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Premium</td>
			<td>Research Instruments</td>
			<td>17544203</td>
			<td>Density Gradient Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 (A/Aichi/2/1968)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hNESPCs</td>
			<td>Human Donors</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Epithelial Growth Factor</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>7925</td>
			<td>Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>qPCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex</td>
			<td>Merck Pte Ltd</td>
			<td>HCP2MAG-62K-PX23</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1705</td>
			<td>RT-PCR 5x Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1706</td>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>554723</td>
			<td>Permeabilization Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10x Supplement</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>Random Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RNase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Part of 52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STX2 electrodes</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td>Electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Shaped 96-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection

As interações precoces entre a camada epitelial nasal e as células imunes inatas durante infecções virais permanecem uma área pouco explorada. A significância da sinalização de imunidade inata em infecções virais aumentou substancialmente à medida que pacientes com infecções respiratórias que apresentam alta ativação de células T inatas mostram um melhor desfecho da doença. Assim, dissecar essas interações imunológicas inatas precoces permite a elucidação dos processos que os regem e pode facilitar o desenvolvimento de potenciais alvos terapêuticos e estratégias para amortecer ou mesmo prevenir a progressão precoce de infecções virais. Este protocolo detalha um modelo versátil que pode ser usado para estudar o crosstalk precoce, interações e ativação de células imunes inatas a partir de fatores secretados por células epiteliais viralmente infectadas pelas vias aéreas. Utilizando um vírus de influenza H3N2 (A/Aichi/2/1968) como modelo representativo do vírus, a ativação celular inata de células mononucleares periféricas co-cultivadas (PBMCs) foi analisada usando citometria de fluxo para investigar os subconjuntos das células que são ativadas pelos fatores solúveis liberados do epitélio em resposta à infecção viral. Os resultados demonstram a estratégia de diferenciação dos subconjuntos das células e revelam as diferenças claras entre as populações ativadas de PBMCs e seu crosstalk com o controle e epitélio infectado. Os subconjuntos ativados podem então ser analisados para determinar suas funções, bem como alterações moleculares específicas das células. Os achados de tal investigação de crosstalk podem descobrir fatores importantes para a ativação de populações celulares inatas vitais, que são benéficas no controle e na supressão da progressão da infecção viral. Além disso, esses fatores podem ser universalmente aplicados a diferentes doenças virais, especialmente em vírus recém-emergentes, para amortecer o impacto desses vírus quando circulam pela primeira vez em populações humanas ingênuas.

Embora as células T convencionais formem o principal repertório de resposta imune adaptativa contra infecção viral para facilitar o despejo viral, a população de células T inatas trabalha em um espectro mais amplo para suprimir a carga viral para liberação eficaz em um estágio posterior. Portanto, este protocolo cria especificamente uma condição robusta para estudar células T inatas, sua ativação e sua população funcional após a infecção por gripe, sem precisar de amos...

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Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection

Este protocolo detalha uma investigação das interações iniciais entre células epiteliais nasais infectadas viralmente e ativação celular inata. Subconjuntos individuais de células imunes podem ser distinguidos com base em sua ativação em resposta a infecções virais. Eles podem então ser investigados para determinar seus efeitos sobre as respostas antivirais precoces.

Modelo de cocultura sem contato para o estudo da ativação de células imunes inatas durante a infecção por vírus respiratório

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The ...

Este protocolo foi projetado para investigar o crosstalk de células epiteliais e células imunes inatas de primeira linha, especificamente células T inatas, que é o nosso interesse. Células primárias de fontes humanas são usadas nesta técnica, permitindo a investigação individual do crosstalk fisiológico relevante para o que está acontecendo em humanos. Células T inatas foram implicadas em melhorar a sobrevivência de pacientes infectados pela gripe.Saber como eles são ativados pode ajudar no desenvolvimento de anti-influenza e terapia antiviral. Este método foi projetado para identificar fatores que podem ativar as células T inatas, o que pode ajudar no desenvolvimento de medidas preventivas contra a infecção por vírus respiratório. No dia zero, infecte células epiteliais nasais humanas, ou HNECs.Primeiro, conte as células adicionando 150 microliters de 1x trypsin EDTA à câmara apical da inserção da membrana e 350 microliters de 1x trypsin EDTA à câmara basal do poço representativo. Incubar as células a 37 graus Celsius por 10 minutos ou até que as células se desprendem da membrana. Lave as células na membrana tubondo para cima e para baixo e colete a suspensão em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.Adicione 200 microliters de DMEM para saciar a atividade de trypsin. Em seguida, conte células através de coloração azul trypan. Calcule a multiplicidade necessária de infecção, ou MOI, do vírus com base na contagem celular por poço.Diluir o estoque do vírus de acordo com o RPMI completo no gelo. Para os demais poços para o experimento de infecção, adicione um 1x DPBS nas câmaras apical das pastilhas de membrana. Incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos e remover o 1x DPBS.Altere o meio basal nas pastilhas de membrana para completar o meio RPMI transferindo as pastilhas para uma nova placa com RPMI completo adicionado aos poços. Adicione o inóculo do vírus preparado na câmara apical da inserção da membrana. Incubar a 35 graus Celsius em uma atmosfera de dióxido de carbono de 5% por uma hora e remover o inóculo viral da câmara apical.Mude o meio basal da membrana para meio RPMI fresco e incubar a 35 graus Celsius em uma atmosfera de dióxido de carbono de 5% por 24 a 72 horas. Semente o número necessário de células mononucleares de sangue periféricos, ou PBMCs, em meio RPMI completo, adicionando diretamente a suspensão PBMC na câmara basal de cada poço de HNECs infectados a partir do dia zero. Incubar a 37 graus Celsius por 24 a 48 horas.Para coletar o supernatante apical, adicione 1x DBPS a cada câmara apical e incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, recolhe o DPBS em tubos de 1,5 mililitro. Aliquot o supernatante para o ensaio da placa em um novo tubo de 1,5 mililitro e congele imediatamente tanto o estoque quanto as alíquotas a menos 80 graus Celsius.Para coletar HNECs de forma de RNA, transfira a pastilha da membrana para um poço limpo. Adicione tampão de rna à câmara apical e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Colete o supernante em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e armazene-o a menos 80 graus Celsius até a extração de RNA para análise molecular.Finalmente, colher PBMCs raspando suavemente a superfície do poço com a base ampla de uma ponta de pipeta estéril para desalojar os PBMCs ativados que podem ser aderentes à superfície do poço. Colete o meio basal contendo PBMCs em um tubo de centrífuga de dois mililitros. Lave os poços duas vezes com 300 microliters de 1x DPBS e colete a lavagem no mesmo tubo de dois mililitros.Centrifugar o tubo de dois mililitros e coletar o supernatante em um tubo fresco de dois mililitros sem perturbar a pelota celular. Armazene o supernatante aspirado a menos 80 graus Celsius para análise de citocina e quimioterapia. Resuspende a pelota de célula restante em 200 microlitres de 1x DPBS.Este protocolo pode ser usado para estudar células T inatas após a infecção por influenza sem a necessidade de células epiteliais e imunes do mesmo doador. Uma amostra da progressão esperada dos HNESPCs à medida que crescem na camada alimentador 3T3 é mostrada aqui. Estes foram utilizados para diferenciação na cultura de interface ar/líquido para obter HNECs multicamadas com células funcionais, ciliadas e cálices.Usando os HNECs, a ativação de células T inatas pode ser investigada usando citometria de fluxo. Esses resultados mostram a detecção de células T invariantes associadas à mucosa, ou células MAIT, V delta um, células Gamma delta T, e as células T assassinas naturais, ou NKT. Essas células foram significativamente aumentadas na cocultura envolvendo HNECs infectados com vírus da gripe.Essa configuração pode então ser aplicada a outras cepas de vírus da gripe, ou populações de células imunes inatas para observar sua respectiva ativação sob condições de co-cultura com células epiteliais infectadas. O cálculo preciso do número das células epiteliais nasais humanas para garantir que a multiplicidade certa de infecção seja usada é importante para níveis ideais e tempo de ativação. O crosstalk entre células epiteliais e células imunes inatas está cada vez mais ganhando atenção, e isso pode ser aplicado ainda mais a quaisquer outros métodos que envolvam imunologia respiratória aguda ou crônica.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Imunologia e Infecção

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Quantificação da Resposta explosão respiratória como um indicador da imunitário inatas Saúde em Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Um modelo de administração Oral Galleria mellonella para respostas imunes Study Commensal-Induced inata

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Isolamento de células mononucleares tonsiláres para estudar respostas imunes inatas ex vivo em um tecido linfoide mucosal humano

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...