Name: contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection
Uploaded: 2021-02-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить научных сотрудников кафедры отоларингологии NUS и кафедры микробиологии и иммунологии за их помощь в работе, связанной с культурой hNEC и вирусной культурой. Мы также хотели бы поблагодарить хирургов и хирургическую бригаду в Национальной университетской больнице, отделение отоларингологии, за их помощь в предоставлении образцов клеток и крови, необходимых для исследования. Это исследование финансировалось Национальным советом по медицинским исследованиям, Сингапур No. NMRC/CIRG/1458/2016 (Де Юн Вану) и MOH-OFYIRG19may-0007 (Кай Сен Тану). Кай Сен Тан является получателем стипендиальной поддержки от Европейской исследовательской стипендии по аллергии и клинической иммунологии (EAACI) 2019 года.

ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепты носителей, используемых в этом протоколе, приведены в Таблице 1 . ПРИМЕЧАНИЕ: было обнаружено, что hNECS, выращенные на 12-луночной трансвелле, вырастают в более оптимальную толщину для того, чтобы растворимые факторы легко достигали базальной камеры при зараж...

<ol>
	<li>Monto, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+and+antiviral+drugs+in+pandemic+preparedness.">Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).</li><li>Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+for+the+next+pandemic.">Preparing for the next pandemic.</a> The British Medical Journal. 346, 364 (2013).</li><li>Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+annual+production+cycle+for+influenza+vaccine.">The annual production cycle for influenza vaccine.</a> Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).</li><li>Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+burden+of+seasonal+influenza+in+the+United+States.">Economic burden of seasonal influenza in the United States.</a> Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).</li><li>Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+and+globalization.">COVID-19 and globalization.</a> One Health. 9, 100132 (2020).</li><li>Guo, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+transmission+and+clinical+therapies+on+coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+outbreak+-+an+update+on+the+status.">The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status.</a> Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).</li><li>Guan, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics+of+coronavirus+disease+2019+in+China.">Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China.</a> New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+are+activated+during+human+viral+infections.">MAIT cells are activated during human viral infections.</a> Nature Communications. 7, 11653 (2016).</li><li>Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammadelta+T+cells:+first+line+of+defense+and+beyond.">Gammadelta T cells: first line of defense and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+contribute+to+protection+against+lethal+influenza+infection+in+vivo.">MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo.</a> Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).</li><li>Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+layers+of+heterogeneity+and+subset+diversity+in+human+MAIT+cell+responses+to+distinct+microorganisms+and+to+innate+cytokines.">Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+cells+derived+from+multiple+individuals+exhibit+differential+responses+to+H3N2+influenza+virus+infection+in+vitro.">Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).</li><li>Luukkainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+co-culture+model+of+PBMC+and+stem+cell+derived+human+nasal+epithelium+reveals+rapid+activation+of+NK+and+innate+T+cells+upon+Influenza+A+virus+infection+of+the+nasal+epithelium.">A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+H3N2+influenza+virus-infected+human+nasal+epithelial+cells+from+multiple+subjects+reveals+molecular+pathways+associated+with+tissue+injury+and+complications.">RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications.</a> Cells. 8 (9), 986 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+lipopolysaccharide+on+diesel+exhaust+particle-induced+junctional+dysfunction+in+primary+human+nasal+epithelial+cells.">Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells.</a> Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).</li><li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+fully+differentiated+human+nasal+epithelial+cells+infected+with+rhinovirus+reveals+epithelium-initiated+immune+responses.">In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses.</a> Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomic+and+metagenomic+analyses+of+influenza+virus-infected+nasal+epithelial+cells+from+multiple+individuals+reveal+specific+nasal-initiated+signatures.">Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).</li><li>Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay">https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay</a> (2020)</li><li>Gamage, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+nasal+epithelial+cells+with+SARS-CoV-2+and+a+382-nt+deletion+isolate+lacking+ORF8+reveals+similar+viral+kinetics+and+host+transcriptional+profiles.">Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).</li><li>Zhao, X. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+nasal+epithelial+stem/progenitor+cells+to+produce+functioning+ciliated+cells+in+vitro.">The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro.</a> American Journal of Rhinology &amp; Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).</li></ol>

Врожденные иммунные реакции против вирусов являются недостаточно изученной областью исследований в области противовирусного лечения. Эпителиальные клетки дыхательных путей и врожденные иммунные клетки работают согласованно, чтобы подавить репликацию вируса во время инфекции, поми...

Респираторные вирусы, пожалуй, являются одними из наиболее распространенных патогенов, вызывающих серьезное медицинское и экономическое бремя. От периодических глобальных вспышек новых эпидемических штаммов (например, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) до сезонных штаммов гриппа каждый год, вирусы представляют постоянную угрозу для здоровья населения. Хотя вакцины составляют основную часть ответных мер на эти глобальные проблемы общественного здравоохранения, отрезвляюще отметить, что эти контрмеры являются просто ответными 1,2. Кроме того, задержка между появлением нового инфекционного штамма и успешной разработкой его вакцины неизбежна3, что приводит к периоду, когда меры, доступные для сдерживания распространения вируса, сильно ограничены.
Эти задержки еще более подчеркиваются издержками, которые наносятся обществу как в экономическом, так и в социальном плане. Только сезонный грипп несет ответственность за примерно 8 миллиардов долларов косвенных расходов, 3,2 миллиарда долларов медицинских расходов и 36,3 тысячи смертей в Соединенных Штатах Америки ежегодно4. Это до рассмотрения расходов на исследования, которые необходимы для финансирования разработки вакцины. Эпидемические вспышки имеют еще более серьезные последствия для общества, усугубляемые растущими темпами глобализации с каждым годом, о чем свидетельствуют глобальные сбои, вызванные возникновением и быстрым распространением тяжелого острого респираторного синдрома короновируса 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
Недавние исследования показали, что инфицированные пациенты, имеющие большую популяцию активированных врожденных Т-клеток, как правило, имеют лучший исход заболевания 8,9,10. Кроме того, врожденная популяция Т-клеток подразделяется на несколько подгрупп: слизисто-ассоциированные инвариантные Т-клетки (MAIT), Vδ1 γδ Т-клетки, Vδ2 γδ Т-клетки и естественные Т-киллеры (NKT). Эти подгруппы врожденных Т-клеток также демонстрируют гетерогенность в своих популяциях, увеличивая сложность взаимодействий между клеточными популяциями, участвующими во врожденном иммунном ответе11. Следовательно, механизм, который активирует эти врожденные Т-клетки и знание конкретных подгрупп врожденных Т-клеток, может обеспечить другое направление исследований для ограничения инфекционного воздействия этих вирусов на человека-хозяина, особенно в период разработки вакцины.
Эпителиальные клетки, инфицированные гриппом, продуцируют факторы, которые быстро активируют врожденные Т-клетки 12,13,14. Основываясь на этом открытии, эта бесконтактная модель кокультуры воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) направлена на имитацию ранних химических взаимодействий (опосредованных растворимыми факторами, высвобождаемыми инфицированным эпителиальным слоем) между инфицированным носовым эпителиальным слоем и НБМК во время ранней инфекции. Физическое разделение между носовым эпителиальным слоем (культивируемым на мембранных вставках) и PBMCs (в камере внизу) и целостность эпителия предотвращают прямую инфекцию PBMCs вирусом, что позволяет детально изучить влияние эпителиальных растворимых факторов на PBMCs. Поэтому выявленные факторы могут быть дополнительно исследованы на предмет их терапевтического потенциала в индуцировании соответствующей врожденной популяции Т-клеток, которая может защитить от инфекции гриппа. Поэтому в этой статье подробно описаны методы создания кокультуры для изучения врожденной активации Т-клеток из растворимых факторов, полученных из эпителия.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120086</td>
			<td>1.5mL Centrifuge Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366643</td>
			<td>10mL Blood Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3460</td>
			<td>membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120094</td>
			<td>2 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-l-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>533998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes (flow tubes)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-4-62 Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810709008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel CL-611</td>
			<td>FMC Biopolymer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Liquid Overlay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc</td>
			<td>171STND01</td>
			<td>Multiplex Manager Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly Needle 21 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>367287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>554722</td>
			<td>Fixation and Permeabilization Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Neutral Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTP Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM voltohmmeter device</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>1x Lysing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>188271</td>
			<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 50 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>227261</td>
			<td>50 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Start Essential DNA Probes Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6402682001</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Premium</td>
			<td>Research Instruments</td>
			<td>17544203</td>
			<td>Density Gradient Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 (A/Aichi/2/1968)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hNESPCs</td>
			<td>Human Donors</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Epithelial Growth Factor</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>7925</td>
			<td>Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>qPCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex</td>
			<td>Merck Pte Ltd</td>
			<td>HCP2MAG-62K-PX23</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1705</td>
			<td>RT-PCR 5x Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1706</td>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>554723</td>
			<td>Permeabilization Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10x Supplement</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>Random Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RNase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Part of 52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STX2 electrodes</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td>Electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Shaped 96-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection

Ранние взаимодействия между эпителиальным слоем носа и врожденными иммунными клетками во время вирусных инфекций остаются недостаточно изученной областью. Значение передачи сигналов врожденного иммунитета при вирусных инфекциях значительно возросло, поскольку пациенты с респираторными инфекциями, которые демонстрируют высокую врожденную активацию Т-клеток, показывают лучший исход заболевания. Следовательно, препарирование этих ранних врожденных иммунных взаимодействий позволяет прояснить процессы, которые ими управляют, и может способствовать разработке потенциальных терапевтических целей и стратегий для ослабления или даже предотвращения раннего прогрессирования вирусных инфекций. Этот протокол детализирует универсальную модель, которая может быть использована для изучения ранних перекрестных помех, взаимодействий и активации врожденных иммунных клеток из факторов, секретируемых вирусно инфицированными эпителиальными клетками дыхательных путей. Используя вирус гриппа H3N2 (A/Aichi/2/1968) в качестве репрезентативной модели вируса, врожденная клеточная активация совместно культивируемых мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) была проанализирована с использованием проточной цитометрии для исследования подмножеств клеток, которые активируются растворимыми факторами, высвобождаемыми из эпителия в ответ на вирусную инфекцию. Результаты демонстрируют стратегию дифференциации подмножеств клеток и выявляют четкие различия между активированными популяциями PBMCs и их перекрестными помехами с контрольным и инфицированным эпителием. Затем активированные подмножества могут быть дополнительно проанализированы для определения их функций, а также молекулярных изменений, специфичных для клеток. Результаты такого перекрестного исследования могут выявить факторы, которые важны для активации жизненно важных врожденных клеточных популяций, которые полезны для контроля и подавления прогрессирования вирусной инфекции. Кроме того, эти факторы могут быть повсеместно применены к различным вирусным заболеваниям, особенно к вновь возникающим вирусам, чтобы ослабить воздействие таких вирусов, когда они впервые циркулируют в наивных человеческих популяциях.

Хотя обычные Т-клетки образуют основной репертуар адаптивного иммунного ответа против вирусной инфекции для облегчения вирусного клиренса, врожденная популяция Т-клеток работает по всему более широкому спектру, чтобы подавить вирусную нагрузку для эффективного кли...

Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection

Этот протокол подробно описывает исследование ранних взаимодействий между вирусно инфицированными эпителиальными клетками носа и активацией врожденных клеток. Отдельные подмножества иммунных клеток можно выделить на основе их активации в ответ на вирусные инфекции. Затем они могут быть дополнительно исследованы, чтобы определить их влияние на ранние противовирусные реакции.

Бесконтактная модель кокультуры для изучения активации врожденных иммунных клеток во время респираторной вирусной инфекции

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The ...

Этот протокол предназначен для исследования перекрестных помех эпителиальных клеток и врожденных иммунных клеток первой линии, в частности врожденных Т-клеток, что является нашим интересом. Первичные клетки из человеческих источников используются в этой технике, что позволяет индивидуально исследовать физиологические перекрестные помехи, имеющие отношение к тому, что происходит у людей. Врожденные Т-клетки были вовлечены в улучшение выживаемости пациентов, инфицированных гриппом.Знание того, как они активируются, может помочь в разработке противогриппозной и противовирусной терапии. Этот метод предназначен для выявления факторов, которые могут активировать врожденные Т-клетки, что может помочь в разработке профилактических мер против респираторной вирусной инфекции. В нулевой день заражают эпителиальные клетки носа человека, или ГНЕК.Во-первых, подсчитывают клетки путем добавления 150 микролитров 1x трипсина ЭДТА в апикальную камеру мембранной вставки и 350 микролитров 1x трипсина ЭДТА в базальную камеру репрезентативного колодца. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут или до тех пор, пока клетки не отсоединятся от мембраны. Промывайте клетки на мембране путем пипетки вверх и вниз и соберите суспензию в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку.Добавьте 200 микролитров DMEM для подавления активности трипсина. Затем подсчитайте клетки с помощью окрашивания в синий цвет трипана. Рассчитайте требуемую кратность инфекции, или MOI, вируса на основе количества клеток на скважину.Разбавьте вирусный запас соответствующим образом с полным RPMI на льду. Для оставшихся колодцев для эксперимента с инфекцией добавьте один 1x DPBS в апикальные камеры мембранных вставок. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут и удалить 1x DPBS.Измените базальную среду в мембранных вставках на полную среду RPMI, перенеся вставки на новую пластину с полным RPMI, добавленным в колодцы. Добавьте приготовленный вирусный инокулятив в апикальную камеру мембранной вставки. Инкубируйте при 35 градусах Цельсия в атмосфере с содержанием углекислого газа 5% в течение одного часа и удалите вирусный инокулят из апикальной камеры.Измените базальную среду мембранной вставки на свежую среду RPMI и инкубируйте при 35 градусах Цельсия в атмосфере 5% углекислого газа в течение 24-72 часов. Засейте необходимое количество мононуклеарных клеток периферической крови, или PBMCs, в полную среду RPMI путем непосредственного добавления суспензии PBMC в базальную камеру каждого колодца инфицированных ГНЭК с нулевого дня. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24-48 часов.Чтобы собрать верхушечный супернатант, добавьте 1x DBPS в каждую апикальную камеру и высиживайте при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем соберите DPBS в 1,5-миллилитровые трубки. Аликвот супернатант для анализа бляшек в новой 1,5-миллилитровой трубке и сразу же замораживает как запас, так и аликвоты при минус 80 градусах Цельсия.Чтобы собрать РНК-образные ГНЕК, перенесите мембранную вставку в чистый колодец. Добавьте буфер лизиса РНК в апикальную камеру и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Соберите супернатант в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку и храните его при минус 80 градусах Цельсия до экстракции РНК для молекулярного анализа.Наконец, собирайте НБМК, аккуратно соскребая поверхность скважины широким основанием стерильного наконечника пипетки, чтобы вытеснить активированные НБМК, которые могут прилипать к поверхности скважины. Соберите базальную среду, содержащую НБМК, в двухмиллилитровую центрифужную трубку. Промывайте скважины дважды 300 микролитрами 1x DPBS и соберите промывку в ту же двухмиллилитровую трубку.Центрифугируйте двухмиллилитровую трубку и соберите супернатант в свежую двухмиллилитровую трубку, не нарушая гранулу ячейки. Храните аспирированный супернатант при температуре минус 80 градусов Цельсия для анализа цитокинов и хемокинов. Повторно суспендируйте оставшуюся ячейку гранулы в 200 микролитров 1x DPBS.Этот протокол может быть использован для изучения врожденных Т-клеток после инфекции гриппа без необходимости использования эпителиальных и иммунных клеток от одного и того же донора. Здесь показан пример ожидаемого прогрессирования ГЭСПК по мере их роста на фидерном слое 3T3. Они использовались для дифференцировки в культуре раздела воздух/жидкость для получения многослойных ГНЭК с функциональными, реснитчатыми и бокаловидными клетками.Используя ГНЕК, врожденную активацию Т-клеток можно исследовать с помощью проточной цитометрии. Эти результаты показывают обнаружение связанных со слизистой оболочкой инвариантных Т-клеток, или MAIT-клеток, V-дельта-один, гамма-дельта-Т-клеток и естественных Т-киллеров, или NKT-клеток. Эти клетки были значительно увеличены в совместной культуре с участием ГНЕК, инфицированных вирусом гриппа.Затем эта установка может быть применена к другим штаммам вируса гриппа или врожденным популяциям иммунных клеток для наблюдения за их соответствующей активацией в условиях кокультуры с инфицированными эпителиальными клетками. Точный расчет количества эпителиальных клеток носа человека для обеспечения использования правильной множественности инфекции важен для оптимальных уровней и сроков активации. Перекрестные помехи между эпителиальными клетками и врожденными иммунными клетками все чаще привлекают внимание, и это может быть применено в дальнейшем к любым другим методам, связанным с острой или хронической респираторной иммунологией.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Создание жидкого покрытые культуры поляризованный человека эпителия дыхательных путей Calu-3 ячейки по изучению клетки-хозяина в ответ на возбудителей инфекций дыхательных путей<em&gt; В пробирке</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Количественная оценка респираторный взрыв ответ как показатель врожденной иммунной здравоохранения в данио рерио

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Использование РНК-интерференции по расследованию врожденного иммунного ответа у мышей макрофагов

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro анализ MyD88-опосредованной клеточного иммунного ответа на вирус Западного Нила мутантный штамм инфекции

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Неинвазивная Визуализация врожденного иммунного ответа в данио рерио личинок модели<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Инфекция

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Мыши модель для оценки врожденный иммунный ответ инфекции стафилококк

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Модель администрирования Galleria mellonella устные Innate иммунных реакций Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Изоляция миндалевидных моноядерных клеток для изучения Ex Vivo Врожденные иммунные реакции в человеческой мукозальной лимфоидной ткани

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...