Name: contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection
Uploaded: 2021-02-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

Nos gustaría agradecer al personal de investigación en el Departamento de Otorrinolaringología de NUS y el Departamento de Microbiología e Inmunología por su ayuda con el trabajo relacionado con el cultivo y el cultivo viral de hNEC. También nos gustaría agradecer a los cirujanos y al equipo quirúrgico del Hospital universitario nacional, Departamento de Otorrinolaringología, por su ayuda en el suministro de las muestras de células y sangre necesarias para el estudio. Este estudio fue financiado por el Consejo Nacional de Investigación Médica, Singapur No. NMRC/CIRG/1458/2016 (a De Yun Wang) y MOH-OFYIRG19may-0007 (a Kai Sen Tan). Kai Sen Tan ha recibido el apoyo de la beca de investigación European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) 2019.

NOTA: Consulte la Tabla 1 para obtener recetas de los medios utilizados en este protocolo. NOTA: Se ha encontrado que los hNECS cultivados en transwell de 12 pocillos crecen en un grosor más óptimo para que los factores solubles lleguen fácilmente a la cámara basal cuando se infectan con el virus de la influenza. Por lo tanto, se recomienda el uso de transwell de tamaño 12 pocillos para el cocultivo.
1. Establecimiento de la capa alimentadora 3T3
<ol><li>Establecimie...

<ol>
	<li>Monto, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+and+antiviral+drugs+in+pandemic+preparedness.">Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).</li><li>Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+for+the+next+pandemic.">Preparing for the next pandemic.</a> The British Medical Journal. 346, 364 (2013).</li><li>Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+annual+production+cycle+for+influenza+vaccine.">The annual production cycle for influenza vaccine.</a> Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).</li><li>Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+burden+of+seasonal+influenza+in+the+United+States.">Economic burden of seasonal influenza in the United States.</a> Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).</li><li>Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+and+globalization.">COVID-19 and globalization.</a> One Health. 9, 100132 (2020).</li><li>Guo, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+transmission+and+clinical+therapies+on+coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+outbreak+-+an+update+on+the+status.">The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status.</a> Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).</li><li>Guan, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics+of+coronavirus+disease+2019+in+China.">Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China.</a> New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+are+activated+during+human+viral+infections.">MAIT cells are activated during human viral infections.</a> Nature Communications. 7, 11653 (2016).</li><li>Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammadelta+T+cells:+first+line+of+defense+and+beyond.">Gammadelta T cells: first line of defense and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+contribute+to+protection+against+lethal+influenza+infection+in+vivo.">MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo.</a> Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).</li><li>Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+layers+of+heterogeneity+and+subset+diversity+in+human+MAIT+cell+responses+to+distinct+microorganisms+and+to+innate+cytokines.">Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+cells+derived+from+multiple+individuals+exhibit+differential+responses+to+H3N2+influenza+virus+infection+in+vitro.">Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).</li><li>Luukkainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+co-culture+model+of+PBMC+and+stem+cell+derived+human+nasal+epithelium+reveals+rapid+activation+of+NK+and+innate+T+cells+upon+Influenza+A+virus+infection+of+the+nasal+epithelium.">A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+H3N2+influenza+virus-infected+human+nasal+epithelial+cells+from+multiple+subjects+reveals+molecular+pathways+associated+with+tissue+injury+and+complications.">RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications.</a> Cells. 8 (9), 986 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+lipopolysaccharide+on+diesel+exhaust+particle-induced+junctional+dysfunction+in+primary+human+nasal+epithelial+cells.">Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells.</a> Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).</li><li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+fully+differentiated+human+nasal+epithelial+cells+infected+with+rhinovirus+reveals+epithelium-initiated+immune+responses.">In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses.</a> Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomic+and+metagenomic+analyses+of+influenza+virus-infected+nasal+epithelial+cells+from+multiple+individuals+reveal+specific+nasal-initiated+signatures.">Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).</li><li>Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay">https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay</a> (2020)</li><li>Gamage, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+nasal+epithelial+cells+with+SARS-CoV-2+and+a+382-nt+deletion+isolate+lacking+ORF8+reveals+similar+viral+kinetics+and+host+transcriptional+profiles.">Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).</li><li>Zhao, X. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+nasal+epithelial+stem/progenitor+cells+to+produce+functioning+ciliated+cells+in+vitro.">The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro.</a> American Journal of Rhinology &amp; Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).</li></ol>

Las respuestas inmunes innatas contra los virus son un campo de estudio poco investigado en el manejo de antivirales. Las células epiteliales de las vías respiratorias y las células inmunes innatas trabajan en conjunto para suprimir la replicación viral durante una infección, además de servir como determinante de la respuesta adaptativa hiperactiva si la carga viral no se mantiene bajo control 12,13,17. Sin embargo, el des...

Los virus respiratorios se encuentran quizás entre los patógenos más extendidos que causan una grave carga sanitaria y económica. Desde los brotes mundiales periódicos de cepas epidémicas emergentes (por ejemplo, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) hasta las cepas estacionales de influenza cada año, los virus son una amenaza constante para la salud pública. Aunque las vacunas constituyen la mayor parte de la respuesta a estos desafíos de salud pública mundial, es aleccionador observar que estas contramedidas son simplemente receptivas 1,2. Además, un retraso entre la aparición de una nueva cepa infecciosa y el desarrollo exitoso de su vacuna es inevitable3, lo que lleva a un período en el que las medidas disponibles para frenar la propagación del virus son muy limitadas.
Estos retrasos se enfatizan aún más por los costos que se infligen a la sociedad, económica y socialmente. Solo la gripe estacional es responsable de aproximadamente $ 8 mil millones en costos indirectos, $ 3.2 mil millones en costos médicos y 36.3 mil muertes en los Estados Unidos de América anualmente4. Esto es antes de considerar los costos de investigación que son necesarios para financiar el desarrollo de vacunas. Los brotes epidémicos tienen efectos aún más graves en la sociedad, agravados por la creciente tasa de globalización cada año, como lo demuestran las perturbaciones mundiales causadas por la aparición y rápida propagación del coronovirus del síndrome respiratorio agudo grave 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
Estudios recientes han demostrado que los pacientes infectados que tienen una mayor población de células T innatas activadas tienden a tener un mejor resultado de la enfermedad 8,9,10. Además, la población de células T innatas se clasifica en múltiples subgrupos: las células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT), las células T Vδ1 γδ, las células T Vδ2 γδ y las células T asesinas naturales (NKT). Estos subgrupos de células T innatas también exhiben heterogeneidad dentro de sus poblaciones, aumentando la complejidad de las interacciones entre las poblaciones celulares involucradas en la respuesta inmune innata11. Por lo tanto, el mecanismo que activa estas células T innatas y el conocimiento de los subgrupos específicos de células T innatas pueden proporcionar una vía diferente de investigación para reducir los efectos infecciosos de estos virus en el huésped humano, especialmente durante el período de desarrollo de la vacuna.
Las células epiteliales infectadas por la influenza producen factores que activan rápidamente las células T innatas 12,13,14. Sobre la base de ese hallazgo, este modelo de cocultivo de interfaz aire-líquido (ALI) sin contacto tiene como objetivo imitar las interacciones químicas tempranas (mediadas por factores solubles liberados por la capa epitelial infectada) entre la capa epitelial nasal infectada y los PBMC durante la infección temprana. La separación física entre la capa epitelial nasal (cultivada en insertos de membrana) y los PBMC (en la cámara inferior) y la integridad epitelial previenen la infección directa de los PBMC por el virus, lo que permite un estudio detallado de los efectos de los factores solubles derivados del epitelio en los PBMC. Por lo tanto, los factores identificados pueden investigarse más a fondo por su potencial terapéutico para inducir la población de células T innatas adecuada que puede proteger contra la infección por influenza. Por lo tanto, este artículo ha detallado los métodos para establecer un cocultivo para el estudio de la activación innata de células T a partir de factores solubles derivados del epitelio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120086</td>
			<td>1.5mL Centrifuge Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366643</td>
			<td>10mL Blood Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3460</td>
			<td>membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120094</td>
			<td>2 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-l-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>533998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes (flow tubes)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-4-62 Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810709008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel CL-611</td>
			<td>FMC Biopolymer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Liquid Overlay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc</td>
			<td>171STND01</td>
			<td>Multiplex Manager Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly Needle 21 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>367287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>554722</td>
			<td>Fixation and Permeabilization Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Neutral Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTP Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM voltohmmeter device</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>1x Lysing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>188271</td>
			<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 50 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>227261</td>
			<td>50 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Start Essential DNA Probes Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6402682001</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Premium</td>
			<td>Research Instruments</td>
			<td>17544203</td>
			<td>Density Gradient Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 (A/Aichi/2/1968)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hNESPCs</td>
			<td>Human Donors</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Epithelial Growth Factor</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>7925</td>
			<td>Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>qPCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex</td>
			<td>Merck Pte Ltd</td>
			<td>HCP2MAG-62K-PX23</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1705</td>
			<td>RT-PCR 5x Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1706</td>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>554723</td>
			<td>Permeabilization Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10x Supplement</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>Random Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RNase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Part of 52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STX2 electrodes</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td>Electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Shaped 96-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection

Las interacciones tempranas entre la capa epitelial nasal y las células inmunes innatas durante las infecciones virales siguen siendo un área poco explorada. La importancia de la señalización de la inmunidad innata en las infecciones virales ha aumentado sustancialmente a medida que los pacientes con infecciones respiratorias que exhiben una alta activación innata de las células T muestran un mejor resultado de la enfermedad. Por lo tanto, la disección de estas interacciones inmunes innatas tempranas permite la elucidación de los procesos que las gobiernan y puede facilitar el desarrollo de posibles dianas terapéuticas y estrategias para amortiguar o incluso prevenir la progresión temprana de las infecciones virales. Este protocolo detalla un modelo versátil que se puede utilizar para estudiar la diafonía temprana, las interacciones y la activación de las células inmunes innatas a partir de factores secretados por las células epiteliales de las vías respiratorias infectadas viralmente. Utilizando un virus de la influenza H3N2 (A/Aichi/2/1968) como modelo de virus representativo, la activación celular innata de células mononucleares de sangre periférica cocultivadas (PBMC) se ha analizado mediante citometría de flujo para investigar los subconjuntos de células que se activan por los factores solubles liberados del epitelio en respuesta a la infección viral. Los resultados demuestran la estrategia de gating para diferenciar los subconjuntos de células y revelan las claras diferencias entre las poblaciones activadas de PBMC y su diafonía con el epitelio control e infectado. Los subconjuntos activados se pueden analizar más a fondo para determinar sus funciones, así como los cambios moleculares específicos de las células. Los hallazgos de dicha investigación de diafonía pueden descubrir factores que son importantes para la activación de poblaciones vitales de células innatas, que son beneficiosos para controlar y suprimir la progresión de la infección viral. Además, estos factores se pueden aplicar universalmente a diferentes enfermedades virales, especialmente a los virus recién emergentes, para amortiguar el impacto de dichos virus cuando circulan por primera vez en poblaciones humanas ingenuas.

Aunque las células T convencionales forman el repertorio principal de respuesta inmune adaptativa contra la infección viral para facilitar el aclaramiento viral, la población de células T innatas trabaja en un espectro más amplio para suprimir la carga viral para una eliminación efectiva en una etapa posterior. Por lo tanto, este protocolo crea específicamente una condición robusta para estudiar las células T innatas, su activación y su población funcional después de la infecc...

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Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection

Este protocolo detalla una investigación de las interacciones tempranas entre las células epiteliales nasales infectadas viralmente y la activación de células innatas. Los subconjuntos individuales de células inmunes se pueden distinguir en función de su activación en respuesta a infecciones virales. Luego se pueden investigar más a fondo para determinar sus efectos sobre las respuestas antivirales tempranas.

Modelo de cocultivo sin contacto para el estudio de la activación de células inmunes innatas durante la infección por virus respiratorios

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The ...

Este protocolo está diseñado para investigar la diafonía de las células epiteliales y las células inmunes innatas de primera línea, específicamente las células T innatas, que es nuestro interés. Las células primarias de fuentes humanas se utilizan en esta técnica, lo que permite la investigación individual de la diafonía fisiológica relevante para lo que está sucediendo en los seres humanos. Las células T innatas se han implicado en la mejora de la supervivencia de los pacientes infectados por la gripe.Saber cómo se activan podría ayudar a desarrollar terapia antigripal y antiviral. Este método está diseñado para identificar los factores que pueden activar las células T innatas, lo que puede ayudar a desarrollar medidas preventivas contra la infección por virus respiratorios. En el día cero, infecte las células epiteliales nasales humanas, o HNEC.Primero, cuente las células agregando 150 microlitros de 1x tripsina EDTA a la cámara apical del inserto de membrana y 350 microlitros de 1x tripsina EDTA a la cámara basal del pozo representativo. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 10 minutos o hasta que las células se desprendan de la membrana. Enjuague las células de la membrana mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo y recoja la suspensión en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros.Agregue 200 microlitros de DMEM para apagar la actividad de tripsina. Luego, cuente las células a través de la tinción azul tripano. Calcule la multiplicidad requerida de infección, o MOI, del virus en función del recuento de células por pozo.Diluya el stock de virus en consecuencia con RPMI completo en hielo. Para los pocillos restantes para el experimento de infección, agregue un 1x DPBS en las cámaras apicales de los insertos de membrana. Incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos y retirar el 1x DPBS.Cambie el medio basal en los insertos de membrana a un medio RPMI completo transfiriendo los insertos a una nueva placa con RPMI completo agregado a los pozos. Agregue el inóculo de virus preparado en la cámara apical del inserto de membrana. Incubar a 35 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono al 5% durante una hora y eliminar el inóculo viral de la cámara apical.Cambie el medio basal del inserto de membrana a un medio RPMI fresco e incube a 35 grados Celsius en una atmósfera de dióxido de carbono al 5% durante 24 a 72 horas. Sembrar el número requerido de células mononucleares de sangre periférica, o PBMC, en medio RPMI completo agregando directamente la suspensión de PBMC en la cámara basal de cada pocillo de HNEC infectados desde el día cero. Incubar a 37 grados centígrados durante 24 a 48 horas.Para recolectar el sobrenadante apical, agregue 1x DBPS a cada cámara apical e incube a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Luego, recoja el DPBS en tubos de 1.5 mililitros. Alícuota el sobrenadante para el ensayo de placa en un nuevo tubo de 1,5 mililitros e inmediatamente congele tanto la cepa como las alícuotas a menos 80 grados centígrados.Para recolectar HNEC en forma de ARN, transfiera el inserto de membrana a un pozo limpio. Agregue el tampón de lisis de ARN a la cámara apical e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Recoja el sobrenadante en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta la extracción de ARN para su análisis molecular.Finalmente, recolecte PBMC raspando suavemente la superficie del pozo con la base ancha de una punta de pipeta estéril para desalojar los PBMC activados que pueden estar adheridos a la superficie del pozo. Recoja el medio basal que contiene PBMC en un tubo centrífugo de dos mililitros. Enjuague los pozos dos veces con 300 microlitros de 1x DPBS y recoja el lavado en el mismo tubo de dos mililitros.Centrifuga el tubo de dos mililitros y recoge el sobrenadante en un tubo fresco de dos mililitros sin perturbar la bolita celular. Guarde el sobrenadante aspirado a menos 80 grados Celsius para el análisis de citoquinas y quimiocinas. Resuspend el pellet celular restante en 200 microlitros de 1x DPBS.Este protocolo se puede utilizar para estudiar células T innatas después de la infección por influenza sin la necesidad de células epiteliales e inmunes del mismo donante. Aquí se muestra una muestra de la progresión esperada de los HNESPC a medida que crecen en la capa alimentadora 3T3. Estos se utilizaron para la diferenciación en el cultivo de interfaz aire/líquido para obtener HNEC de múltiples capas con células funcionales, ciliadas y caliciformes.Usando los HNEC, la activación innata de células T se puede investigar mediante citometría de flujo. Estos resultados muestran la detección de células T invariantes asociadas a la mucosa, o células MAIT, V delta uno, células T gamma delta y las células T asesinas naturales o NKT. Estas células aumentaron significativamente en el cocultivo con HNEC infectados con el virus de la influenza.Esta configuración se puede aplicar a otras cepas del virus de la influenza o poblaciones de células inmunes innatas para observar su respectiva activación en condiciones de cocultivo con células epiteliales infectadas. El cálculo preciso del número de células epiteliales nasales humanas para garantizar que se utiliza la multiplicidad correcta de infección es importante para los niveles óptimos y el momento de activación. La diafonía entre las células epiteliales y las células inmunes innatas está ganando cada vez más atención, y esto se puede aplicar aún más a cualquier otro método que involucre inmunología respiratoria aguda o crónica.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Investigación

Inmunología e Infección

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Generación de nódulos linfáticos de grasa Pad quimeras para el Estudio del Ganglio Linfático estroma origen de célula

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

El análisis in vitro de la respuesta inmune celular Myd88 mediada por el Virus del Nilo Occidental cepa mutante Infección

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infección

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Un modelo de ratón para evaluar respuesta inmune innata a la infección por Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Un modelo de administración Oral de Galleria mellonella para la respuesta inmune innata Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Aislamiento de células mononucleares tonitarias para estudiar las respuestas inmunitarias innatas ex vivo en un tejido linfático mucoso humano

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...