Name: contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection
Uploaded: 2021-02-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

Vi vill tacka forskningspersonalen vid NUS Department of Otolaryngology och Institutionen för mikrobiologi och immunologi för deras hjälp med hNEC:s kultur- och viruskulturrelaterade arbete. Vi vill också tacka kirurgerna och det kirurgiska teamet vid National University Hospital, Department of Otolaryngology, för deras hjälp med att tillhandahålla de cell- och blodprover som krävs för studien. Denna studie finansierades av National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (till De Yun Wang) och MOH-OFYIRG19may-0007 (till Kai Sen Tan). Kai Sen Tan är mottagare av stipendiestöd från European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.

OBS: Se tabell 1 för recept av media som används i detta protokoll. OBS: hNECS som odlas på 12-brunns transwell har visat sig växa till mer optimal tjocklek för lösliga faktorer för att lätt nå basalkammaren när de smittas med influensavirus. Därför rekommenderas användning av 12-välstor transwell för samkultur.
1. Upprättande av matarskiktet 3T3
<ol><li>Etablering från frysta lager<ol>
<li>Tina en kryovial av NIH / 3T3 fibroblaster från frysta lager. Ti...

<ol>
	<li>Monto, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+and+antiviral+drugs+in+pandemic+preparedness.">Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).</li><li>Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+for+the+next+pandemic.">Preparing for the next pandemic.</a> The British Medical Journal. 346, 364 (2013).</li><li>Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+annual+production+cycle+for+influenza+vaccine.">The annual production cycle for influenza vaccine.</a> Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).</li><li>Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+burden+of+seasonal+influenza+in+the+United+States.">Economic burden of seasonal influenza in the United States.</a> Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).</li><li>Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+and+globalization.">COVID-19 and globalization.</a> One Health. 9, 100132 (2020).</li><li>Guo, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+transmission+and+clinical+therapies+on+coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+outbreak+-+an+update+on+the+status.">The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status.</a> Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).</li><li>Guan, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics+of+coronavirus+disease+2019+in+China.">Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China.</a> New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+are+activated+during+human+viral+infections.">MAIT cells are activated during human viral infections.</a> Nature Communications. 7, 11653 (2016).</li><li>Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammadelta+T+cells:+first+line+of+defense+and+beyond.">Gammadelta T cells: first line of defense and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).</li><li>van Wilgenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAIT+cells+contribute+to+protection+against+lethal+influenza+infection+in+vivo.">MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo.</a> Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).</li><li>Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+layers+of+heterogeneity+and+subset+diversity+in+human+MAIT+cell+responses+to+distinct+microorganisms+and+to+innate+cytokines.">Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+cells+derived+from+multiple+individuals+exhibit+differential+responses+to+H3N2+influenza+virus+infection+in+vitro.">Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).</li><li>Luukkainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+co-culture+model+of+PBMC+and+stem+cell+derived+human+nasal+epithelium+reveals+rapid+activation+of+NK+and+innate+T+cells+upon+Influenza+A+virus+infection+of+the+nasal+epithelium.">A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+H3N2+influenza+virus-infected+human+nasal+epithelial+cells+from+multiple+subjects+reveals+molecular+pathways+associated+with+tissue+injury+and+complications.">RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications.</a> Cells. 8 (9), 986 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+lipopolysaccharide+on+diesel+exhaust+particle-induced+junctional+dysfunction+in+primary+human+nasal+epithelial+cells.">Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells.</a> Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).</li><li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+fully+differentiated+human+nasal+epithelial+cells+infected+with+rhinovirus+reveals+epithelium-initiated+immune+responses.">In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses.</a> Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).</li><li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomic+and+metagenomic+analyses+of+influenza+virus-infected+nasal+epithelial+cells+from+multiple+individuals+reveal+specific+nasal-initiated+signatures.">Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).</li><li>Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay">https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay</a> (2020)</li><li>Gamage, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+nasal+epithelial+cells+with+SARS-CoV-2+and+a+382-nt+deletion+isolate+lacking+ORF8+reveals+similar+viral+kinetics+and+host+transcriptional+profiles.">Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).</li><li>Zhao, X. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+nasal+epithelial+stem/progenitor+cells+to+produce+functioning+ciliated+cells+in+vitro.">The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro.</a> American Journal of Rhinology &amp; Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).</li></ol>

Medfödda immunsvar mot virus är ett underunderstuderat studieområde inom antiviral hantering. Luftvägarnas epitelceller och medfödda immunceller arbetar i samförstånd för att undertrycka viral replikation under en infektion, förutom att fungera som en determinant för överaktivt adaptivt svar om virusbelastningen inte hålls i schack 12,13,17. Utvecklingen av en relevant mänsklig modell för studier av epitel-medfödd...

Luftvägsvirus är kanske bland de mest utbredda patogenerna som orsakar allvarlig hälso- och sjukvård och ekonomisk börda. Från de periodiska globala utbrotten av nya epidemiska stammar (t.ex. H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) till säsongsstammarna av influensa varje år är virus ett ständigt hot mot folkhälsan. Även om vacciner utgör huvuddelen av svaret på dessa globala folkhälsoutmaningar, är det nyktert att notera att dessa motåtgärder bara svarar 1,2. Dessutom är en fördröjning mellan uppkomsten av en ny smittsam stam och den framgångsrika utvecklingen av dess vaccin oundviklig3, vilket leder till en period då tillgängliga åtgärder för att begränsa spridningen av viruset är mycket begränsade.
Dessa förseningar understryks ytterligare av de kostnader som åsamkas samhället ekonomiskt och socialt. Säsongsinfluensan ensam är ansvarig för cirka 8 miljarder dollar i indirekta kostnader, 3,2 miljarder dollar i medicinska kostnader och 36,3 tusen dödsfall i USA årligen4. Detta är före övervägande av de forskningskostnader som är nödvändiga för att finansiera vaccinutveckling. Epidemiska utbrott har ännu allvarligare effekter på samhället, förvärras av den ökande globaliseringstakten varje år, vilket framgår av de globala störningar som orsakas av uppkomsten och den snabba spridningen av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronovirus 2 (SARS-CoV-2) 5,6,7.
Nya studier har visat att infekterade patienter med en större population av aktiverade medfödda T-celler tenderar att ha ett bättre sjukdomsutfall 8,9,10. Vidare kategoriseras den medfödda T-cellpopulationen i flera undergrupper: de slemhinneassocierade invarianta T-cellerna (MAIT), Vδ1 γδ T-celler, Vδ2 γδ T-celler och de naturliga mördar-T-cellerna (NKT). Dessa undergrupper av medfödda T-celler uppvisar också heterogenitet inom sina populationer, vilket ökar komplexiteten i interaktionerna mellan cellpopulationerna som är involverade i det medfödda immunsvaret11. Därför kan mekanismen som aktiverar dessa medfödda T-celler och kunskapen om de specifika undergrupperna av medfödda T-celler ge en annan forskningsväg för att begränsa de infektiösa effekterna av dessa virus på den mänskliga värden, särskilt under perioden med vaccinutveckling.
Epitelceller infekterade av influensa producerar faktorer som aktiverar medfödda T-celler snabbt 12,13,14. Med utgångspunkt i detta resultat syftar denna kontaktfria air-liquid interface (ALI) samodlingsmodell till att efterlikna de tidiga kemiska interaktionerna (medierade av lösliga faktorer som frigörs av det infekterade epitelskiktet) mellan det infekterade nasala epitelskiktet och PBMC under tidig infektion. Den fysiska separationen mellan det nasala epitelskiktet (odlat på membraninsatser) och PBMC (i kammaren under) och epitelintegriteten förhindrar direkt infektion av PBMC av viruset, vilket möjliggör en detaljerad studie av effekterna av epitel-härledda lösliga faktorer på PBMC: erna. De identifierade faktorerna kan därför undersökas ytterligare för deras terapeutiska potential att inducera lämplig medfödd T-cellspopulation som kan skydda mot influensainfektion. Detta dokument har därför detaljerat metoderna för att upprätta en samkultur för studier av medfödd T-cellaktivering från epitel-härledda lösliga faktorer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120086</td>
			<td>1.5mL Centrifuge Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366643</td>
			<td>10mL Blood Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3460</td>
			<td>membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL SafeLock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120094</td>
			<td>2 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Transwell Insert</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-l-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>533998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes (flow tubes)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-4-62 Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810709008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel CL-611</td>
			<td>FMC Biopolymer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Liquid Overlay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc</td>
			<td>171STND01</td>
			<td>Multiplex Manager Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly Needle 21 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>367287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>554722</td>
			<td>Fixation and Permeabilization Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Neutral Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTP Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM voltohmmeter device</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>1x Lysing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>188271</td>
			<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 50 mL</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>227261</td>
			<td>50 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Start Essential DNA Probes Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6402682001</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Premium</td>
			<td>Research Instruments</td>
			<td>17544203</td>
			<td>Density Gradient Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 (A/Aichi/2/1968)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 M1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Forward Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">5&#39;- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hNESPCs</td>
			<td>Human Donors</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Epithelial Growth Factor</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>7925</td>
			<td>Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>qPCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex</td>
			<td>Merck Pte Ltd</td>
			<td>HCP2MAG-62K-PX23</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1705</td>
			<td>RT-PCR 5x Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1706</td>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco-Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>554723</td>
			<td>Permeabilization Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10x Supplement</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)</td>
			<td>STEMCELL Techonologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>Random Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RNase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Part of 52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (w L-Glutamine)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STX2 electrodes</td>
			<td>WPI, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td>Electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td>Viral RNA Extraction Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Shaped 96-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact-free co-culture model for the study of innate immune cell activation during respiratory virus infection

De tidiga interaktionerna mellan det nasala epitelskiktet och de medfödda immuncellerna under virusinfektioner är fortfarande ett underutforskat område. Betydelsen av medfödd immunitetssignalering vid virusinfektioner har ökat avsevärt eftersom patienter med luftvägsinfektioner som uppvisar hög medfödd T-cellaktivering visar ett bättre sjukdomsutfall. Därför möjliggör dissekering av dessa tidiga medfödda immuninteraktioner att belysa de processer som styr dem och kan underlätta utvecklingen av potentiella terapeutiska mål och strategier för att dämpa eller till och med förhindra tidig progression av virusinfektioner. Detta protokoll beskriver en mångsidig modell som kan användas för att studera tidig överhörning, interaktioner och aktivering av medfödda immunceller från faktorer som utsöndras av viralt infekterade luftvägsepitelceller. Med hjälp av ett H3N2-influensavirus (A/Aichi/2/1968) som representativ virusmodell har medfödd cellaktivering av samkullade mononukleära blodceller (PBMC) analyserats med hjälp av flödescytometri för att undersöka delmängderna av celler som aktiveras av de lösliga faktorer som frigörs från epitelet som svar på virusinfektionen. Resultaten visar gatingstrategin för att differentiera delmängderna av celler och avslöjar de tydliga skillnaderna mellan de aktiverade populationerna av PBMC och deras överhörning med kontroll- och infekterat epitel. De aktiverade delmängderna kan sedan analyseras ytterligare för att bestämma deras funktioner såväl som molekylära förändringar som är specifika för cellerna. Resultat från en sådan överhörningsundersökning kan avslöja faktorer som är viktiga för aktiveringen av vitala medfödda cellpopulationer, som är fördelaktiga för att kontrollera och undertrycka utvecklingen av virusinfektion. Dessutom kan dessa faktorer universellt tillämpas på olika virussjukdomar, särskilt på nya virus, för att dämpa effekterna av sådana virus när de först cirkulerar i naiva mänskliga populationer.

Även om konventionella T-celler utgör huvudrepertoaren för adaptivt immunsvar mot virusinfektion för att underlätta viral clearance, arbetar den medfödda T-cellpopulationen över ett bredare spektrum för att undertrycka virusbelastningen för effektiv clearance i ett senare skede. Därför skapar detta protokoll specifikt ett robust tillstånd för att studera medfödda T-celler, deras aktivering och deras funktionella population efter influensainfektion, utan att behöva epitel- o...

Watch this Scientific Journal Video about Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection at JoVE.com

Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection

Detta protokoll beskriver en undersökning av de tidiga interaktionerna mellan viralt infekterade nasala epitelceller och medfödd cellaktivering. Individuella delmängder av immunceller kan särskiljas baserat på deras aktivering som svar på virusinfektioner. De kan sedan undersökas ytterligare för att bestämma deras effekter på tidiga antivirala svar.

Kontaktfri samodlingsmodell för studier av medfödd immuncellsaktivering under luftvägsvirusinfektion

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The ...

Detta protokoll är utformat för att undersöka överhörning av epitelceller och första linjens medfödda immunceller, särskilt medfödda T-celler, vilket är vårt intresse. Primära celler från mänskliga källor används i denna teknik, vilket möjliggör individuell undersökning av fysiologisk överhörning som är relevant för vad som händer hos människor. Medfödda T-celler har varit inblandade i att förbättra överlevnaden hos influensainfekterade patienter.Att veta hur de aktiveras kan hjälpa till att utveckla anti-influensa och antiviral terapi. Denna metod är utformad för att identifiera faktorer som kan aktivera de medfödda T-cellerna, vilket kan bidra till att utveckla förebyggande åtgärder mot luftvägsinfektion. Vid dag noll, infektera humana nasala epitelceller, eller HNECs.Räkna först celler genom att tillsätta 150 mikroliter 1x trypsin EDTA till den apikala kammaren i membraninsatsen och 350 mikroliter 1x trypsin EDTA till basalkammaren i den representativa brunnen. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i 10 minuter eller tills cellerna lossnar från membranet. Spola cellerna på membranet genom pipettering upp och ner och samla suspensionen i ett 1,5 milliliter centrifugrör.Tillsätt 200 mikroliter DMEM för att släcka trypsinaktiviteten. Räkna sedan celler via trypanblå färgning. Beräkna den erforderliga mångfalden av infektion, eller MOI, av viruset baserat på cellräkningen per brunn.Späd virusstocken i enlighet därefter med fullständig RPMI på is. För de återstående brunnarna för infektionsexperimentet, tillsätt en 1x DPBS i de apikala kamrarna i membraninsatserna. Inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter och ta bort 1x DPBS.Byt basalmediet i membraninsatserna för att slutföra RPMI-mediet genom att överföra insatserna till en ny platta med komplett RPMI tillsatt till brunnarna. Tillsätt det beredda virusokulumet i den apikala kammaren i membraninsatsen. Inkubera vid 35 grader Celsius i en 5% koldioxidatmosfär i en timme och ta bort virusokulum från apikalkammaren.Byt membraninsatsens basala medium till färskt RPMI-medium och inkubera vid 35 grader Celsius i en 5% koldioxidatmosfär i 24 till 72 timmar. Frö det erforderliga antalet mononukleära celler i perifert blod, eller PBMC, i komplett RPMI-medium genom att direkt tillsätta PBMC-suspensionen i basalkammaren i varje brunn av infekterade NK från dag noll. Inkubera vid 37 grader Celsius i 24 till 48 timmar.För att samla den apikala supernatanten, tillsätt 1x DBPS till varje apikal kammare och inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter. Samla sedan DPBS i 1,5 ml rör. Aliquot supernatanten för plackanalysen i ett nytt 1,5-milliliters rör och frys omedelbart både beståndet och alikvoterna vid minus 80 grader Celsius.För att samla RNA-form HNC, överför membranet till en ren brunn. Tillsätt RNA-lysbuffert till apikalkammaren och inkubera vid rumstemperatur i fem minuter. Samla supernatanten i ett 1,5 ml centrifugrör och förvara det vid minus 80 grader Celsius tills RNA-extraktion för molekylär analys.Slutligen skörda PBMC genom att försiktigt skrapa brunnens yta med den breda basen av en steril pipettspets för att lossa de aktiverade PBMC: erna som kan vara vidhäftande mot brunnsytan. Samla basalmediet som innehåller PBMC i ett centrifugrör på två milliliter. Spola brunnarna två gånger med 300 mikroliter 1x DPBS och samla tvätten i samma två milliliter rör.Centrifugera två milliliter röret och samla supernatanten i ett nytt två milliliter rör utan att störa cellpelleten. Förvara den aspirerade supernatanten vid minus 80 grader Celsius för cytokin- och kemokinanalys. Resuspend den återstående cellpelleten i 200 mikroliter 1x DPBS.Detta protokoll kan användas för att studera medfödda T-celler efter influensainfektion utan behov av epitel- och immunceller från samma givare. Ett urval av den förväntade utvecklingen av HNESPC: erna när de växer på 3T3-matarskiktet visas här. Dessa användes för differentiering i luft/vätskegränssnittskulturen för att erhålla flerskiktade HNEC med funktionella, cilierade och bägareceller.Med hjälp av HNECs kan medfödd T-cellaktivering undersökas med hjälp av flödescytometri. Dessa resultat visar detektion av slemhinneassocierade invarianta T- eller MAIT-celler, V-delta ett, gamma delta T-celler och de naturliga mördar-T- eller NKT-cellerna. Dessa celler ökade signifikant i samodling som involverade HNECs infekterade med influensavirus.Denna inställning kan sedan tillämpas på andra influensavirusstammar eller medfödda immuncellspopulationer för att observera deras respektive aktivering under samodlingsförhållanden med infekterade epitelceller. Noggrann beräkning av antalet mänskliga nasala epitelceller för att säkerställa att rätt multiplicitet av infektion används är viktigt för optimala nivåer och tidpunkt för aktivering. Crosstalk mellan epitelceller och medfödda immunceller får alltmer uppmärksamhet, och detta kan tillämpas vidare på andra metoder som involverar akut eller kronisk respiratorisk immunologi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Att upprätta en flytande täckt kultur av polariserad Human luftvägsepitelceller Calu-3 celler för att studera svar värdcellen för luftvägspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantifiering av Respirator Burst Response som en indikator för Innate Immune Health i Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Att använda RNA-interferens för att undersöka det medfödda immunsvar i musmakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In vitro Analys av MyD88-medierad cellulärt immunsvar till West Nile-virus mutant stam Infektion

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Icke-invasiv avbildning av det medfödda immun Response i en Zebrafish Larv Modell av<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektion

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

En musmodell att bedöma medfödda immunsvaret mot Staphylococcus aureus -infektion

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

En Galleria mellonella Oral Administration modell till Study Commensal-Induced medfödda immunsvar

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Isolering av tonsiller mononukleära celler att studera Ex Vivo medfödda immunsvar i en mänsklig mukosal lymfoid vävnad

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...