Name: accumulation and distribution of fluorescent microplastics in the early life stages of zebrafish
Uploaded: 2021-07-04T13:00:00
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Questo lavoro è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (21777145, 22076170) e dal Programma per studiosi e team di ricerca innovativi di Changjiang in University (IRT_17R97).

I pesci zebra adulti provengono dal China Zebrafish Resource Center (Wuhan, Cina). Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la guida nazionale "Laboratory Animal Guideline for Ethical Review of Animal Welfare (GB/T35892-2018).
1. Raccolta embrionale
<ol><li>Mantenere il pesce in vasche di vetro da 20 L con sistema di acqua del rubinetto filtrata a carbone (pH 7,0 ± 0,2) a temperatura costante (28 ± 0,5 °C) su un fotoperiodo di 14:10 h di luce: scuro.</li>
	<li>Nutrire il pes...

<ol>
	<li>SAPEA (Science Advice for Policy by European Academies). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Scientific Perspective on Microplastics in Nature and Society. , (2019).</li><li>Plastics Europe. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastics-the facts 2019. , (2019).</li><li>Andrady, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplastics+in+the+marine+environment.">Microplastics in the marine environment.</a> Marine Pollution Bulletin. 62, 1596-1605 (2011).</li><li>Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proceedings+of+the+International+Research+Workshop+on+the+Occurrence,+Effects+and+Fate+of+Microplastic+Marine+Debris.">Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects and Fate of Microplastic Marine Debris.</a> National Oceanic and Atmospheric Administration Technical Memorandum. , (2009).</li><li>Ivleva, N. P., Wiesheu, A. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+microplastics+impairs+digestive+performance,+stimulates+immune+response+and+induces+microbiota+dysbiosis+in+the+gut+of+juvenile+guppy+(Poecilia+reticulata).">Exposure to microplastics impairs digestive performance, stimulates immune response and induces microbiota dysbiosis in the gut of juvenile guppy (Poecilia reticulata).</a> Science of the Total Environment. 733, 138929 (2020).</li><li>Pr&#252;st, M., Meijer, J., Westerink, R. H. 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A. M., Osman, A. G. M., Sayed, A. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+and+molecular+damage+in+Nile+Tilapia+(Oreochromis+niloticus)+after+exposure+to+microplastics.">Antioxidants and molecular damage in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) after exposure to microplastics.</a> Environmental Science and Pollution Research. 27, 14581-14588 (2020).</li><li>Burns, E. E., Boxall, A. B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplastics+in+the+aquatic+environment:+Evidence+for+or+against+adverse+impacts+and+major+knowledge+gaps.">Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 2776-2796 (2018).</li><li>Ma, H., Pu, S., Liu, S., Bai, Y., Mandal, S., Xing, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplastics+in+aquatic+environments:+Toxicity+to+trigger+ecological+consequences.">Microplastics in aquatic environments: Toxicity to trigger ecological consequences.</a> Environmental Pollution. 261, 114089 (2020).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio reio). 4th ed. , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Pikuda, O., Xu, E. G., Berk, D., Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+assessments+of+micro-+and+nanoplastics+can+be+confounded+by+preservatives+in+commercial+formulations.">Toxicity assessments of micro- and nanoplastics can be confounded by preservatives in commercial formulations.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 6, 21-25 (2019).</li><li>Lidster, K., Readman, G. D., Prescott, M. J., Owen, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+survey+on+the+use+and+welfare+of+zebrafish+Danio+rerio+in+research.">International survey on the use and welfare of zebrafish Danio rerio in research.</a> Journal of Fish Biology. 90, 1891-1905 (2017).</li><li>Pitt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake,+tissue+distribution,+and+toxicity+of+polystyrene+nanoparticles+in+developing+zebrafish+(Danio+rerio).">Uptake, tissue distribution, and toxicity of polystyrene nanoparticles in developing zebrafish (Danio rerio).</a> Aquatic Toxicology. 194, 185-194 (2018).</li><li>Lin, S. J., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+An+in+vivo+model+for+nano+EHS+studies.">Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies.</a> Small. 9, 1608-1618 (2013).</li></ol>

Secondo le linee guida sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici, come la direttiva UE 2010/63/UE, l'autorizzazione all'etica animale non è obbligatoria per un esperimento con le prime fasi di vita del pesce zebra fino alla fase di capacità di alimentazione indipendente (5 giorni dopo la fecondazione)17. Tuttavia, le migliori pratiche di benessere sono importanti per ottimizzare l'uso del pesce zebra e, ad esempio, i metodi umani di anestesia ed eutanasia dovrebbero essere pre...

Sin dalla prima sintetizzata nel 1900, le materie plastiche sono ampiamente utilizzate in vari campi, con conseguente rapida crescita della produzione globale1. Nel 2018, circa 360 milioni di tonnellate di plastica sono state prodotte in tutto il mondo2. Le plastiche nell'ambiente naturale si degradano a particelle fini a causa di processi chimici, fisici o biologici3. Generalmente, le particelle di plastica fine < di dimensioni di 5 mm sono definite come microplastiche4. Le microplastiche sono anche progettate per applicazioni specifiche, come le microperline dei prodotti cosmetici5. Poiché i contaminanti quasi permanenti, le microplastiche si accumulano nell'ambiente e hanno attirato una crescente attenzione da parte di scienziati, responsabili politicie pubblico 1,6. Studi precedenti hanno documentato che le microplastiche potrebbero causare effetti avversi nei pesci, come dannigastrointestinali 7,neurotossicità8,alterazione endocrina9,stress ossidativo10 e danni al DNA11. Tuttavia, la tossicità delle microplastiche non è stata finora completamente rivelata12,13.
Gli embrioni zebrafish offrono molti vantaggi sperimentali, tra cui piccole dimensioni, fertilizzazione esterna, trasparenza ottica e grandi frizioni, ed è considerato un organismo modello ideale per studiare in vivo gli effetti degli inquinanti sui pesci nelle prime fasi della vita. Inoltre, sono necessarie solo quantità limitate di sostanze di prova per la valutazione delle risposte biologiche. Qui, gli embrioni di zebrafish sono esposti a diverse concentrazioni di microplastiche (0,1, 1, 10 mg/L) per 5 giorni e vengono valutati il bioaccumulo e la distribuzione di microplastiche negli embrioni/larve di zebrafish. Questo risultato farà progredire la nostra comprensione della tossicità delle microplastiche per i pesci, e il metodo qui descritto può potenzialmente essere generalizzato per determinare l'accumulo e la distribuzione di altri tipi di materiali fluorescenti nelle prime fasi di vita del pesce zebra.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>Eclipse Ti-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescently labeled polystyrene beads</td>
			<td>Phosphorex, USA</td>
			<td>2103A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accumulation and distribution of fluorescent microplastics in the early life stages of zebrafish

Come nuovo tipo di inquinante ambientale, la microplastica è stata ampiamente trovata nell'ambiente acquatico e rappresenta un'alta minaccia per gli organismi acquatici. Il bioaccumulo delle microplastiche svolge un ruolo chiave nei loro effetti tossici; tuttavia, come particolato, i loro bioaccumulamenti sono diversi da molti altri inquinanti. Descritto qui è un metodo fattibile per determinare visivamente l'accumulo e la distribuzione di microplastiche negli embrioni di zebrafish o larve utilizzando microplastiche fluorescenti. Gli embrioni sono esposti a diverse concentrazioni (0,1, 1 e 10 mg/L) di microplastiche fluorescenti con un diametro di 500 nm per 120 h. Nei risultati viene dimostrato che le microplastiche possono bioaccumulare in embrioni/larve di zebrafish in modo dipendente dalla concentrazione. Prima della schiusa, si trova una forte fluorescenza attorno al coro embrionale; mentre nelle larve di zebrafish, il sacco tuorlo, il pericardio e il tratto gastrointestinale sono i principali siti accumulati di microplastiche. I risultati dimostrano l'assorbimento e l'internalizzazione delle microplastiche nei pesci zebra nelle prime fasi della vita, che forniranno la base per una migliore comprensione dell'impatto delle microplastiche sugli animali acquatici.

La distribuzione e l'accumulo di microplastiche fluorescenti sono riportati nella figura 1 e nella tabella 1. Non si osserva fluorescenza visibile nel gruppo non esposto (controllo). Tuttavia, si trova un accumulo di fluorescenza che circonda il corore dopo l'esposizione a diverse concentrazioni di microplastiche (24 hpf). La fluorescenza verde viene rilevata anche nelle larve e i livelli di fluorescenza sembrano aumentare in modo dipendente dalla concentrazione e dal tempo....

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Accumulation and Distribution of Fluorescent Microplastics in the Early Life Stages of Zebrafish

Gli embrioni/larve zebrafish si sviluppano esternamente e sono otticamente trasparenti. Il bioaccumulo delle microplastiche nei pesci nelle prime fasi della vita viene facilmente valutato con microperline etichettate fluorescentmente.

Accumulo e distribuzione di microplastiche fluorescenti nelle prime fasi della vita di Zebrafish

As a new type of environmental pollutant, microplastic has been widely found in the aquatic environment and poses a high threat to aquatic organisms. The ...

Accumulo e distribuzione di microplastiche fluorescenti nelle prime fasi della vita del pesce zebra. Introduzione. Il bioaccumulo delle microplastiche svolge un ruolo chiave nei loro effetti tossici. Tuttavia, come particolato, i loro bioaccumulamenti sono diversi da molti altri inquinanti.Descritto qui è un metodo fattibile per determinare visivamente l'accumulo e la distribuzione di microplastiche negli embrioni di zebrafish o larve utilizzando microplastiche fluorescenti. Gli esperimenti sono stati condotti nel rispetto della guida nazionale Guida di laboratorio linee guida per gli animali per la revisione etica del benessere degli animali. Uno, la raccolta degli embrioni.I pesci zebra adulti provengono dal China Zebrafish Resource Center. I pesci vengono mantenuti in serbatoi di vetro da 20 litri con sistema di acqua del rubinetto filtrata a carbone a temperatura costante, vale a dire, 28 Gradi Celsius, su un fotoperiodo di 14 e 10 ore, chiaro: scuro. I pesci vengono nutriti due volte al giorno con Artemia nauplii.Si raccomanda di dare al cibo un peso massimo del 3% per il pesce al giorno e di mangiarlo entro cinque minuti ogni volta. Il pesce zebra adulto ben sviluppato viene trasferito nel serbatoio di deposizione delle uova con un rapporto tra un maschio e due femmine la notte prima dell'allevamento. La mattina seguente, il pesce inizia a deporre le uova dopo l'inizio del ciclo leggero.Le uova vengono raccolte utilizzando una pipetta Pasteur, risciacquate più volte con la soluzione del 10%Hank e quindi controllate per la fecondazione al microscopio. Le uova fecondate subiscono il periodo di scissione dopo circa due ore dopo la fecondazione e possono essere chiaramente identificate. Gli embrioni fecondati vengono incubati in un bicchiere da 500 millilitri contenente 200 millilitri della soluzione del 10% di Hank con 1%blu di metilene per la disinfezione a 28 Gradi Celsius.La velocità di carico non supera un embrione in ogni soluzione da 2 millilitri. Due, preparazione di sospensioni in microplastica. La soluzione stock di perline di polistirolo verdi etichettate fluorescentmente con diametro nominale di 500 nanometri viene sonicata per 10 minuti.Diluire la soluzione stock con la soluzione del 10% Hank per produrre le soluzioni di esposizione desiderate, vale a dire 0,1, 1 e 10 milligrammi per litro. Le soluzioni di esposizione delle microplastiche vengono sempre preparate al momento prima dell'esposizione. Tre, esposizione alla microplastica.Sei embrioni appena fecondati vengono selezionati casualmente e quindi trasferiti in ogni pozzo di sei piastre contenenti cinque millilitri di soluzioni di microplastica con concentrazioni diverse. Sono inclusi i gruppi di controllo contenenti la soluzione del 10%Hank. I pozzi triplicati, con un totale di 18 embrioni, vengono utilizzati per ogni trattamento.Gli embrioni vengono incubati sotto lo stesso ciclo e temperatura luce-buio degli adulti e vengono osservati ogni 12 ore. I morti vengono rimossi immediatamente. Le soluzioni in microplastica vengono rinnovate al 90% ogni 24 ore.Durante il periodo di esposizione, il pesce non viene nutrito. Generalmente, la schiusa dell'embrione inizia a 48 ore dopo la fecondazione e si completa a circa 72 ore dopo la fecondazione. Quattro, valutazione della distribuzione della microplastica.A 24-48-72-96-e 120 ore dopo la fecondazione, gli embrioni e le larve, uno per ciascuno dei tre replicati, vengono selezionati casualmente e risciacquati con la soluzione del 10% Hank. Gli embrioni e le larve sono disposti e preparati per l'osservazione. In anticipo, le larve vengono trasferite in una piastra di Petri ed esposte allo 0,016% di tricaina per l'anestesia.I pesci sono osservati con microscopio a fluorescenza e immagini con software di imaging. L'intensità della fluorescenza nei pesci è ulteriormente quantificata con ImageJ NIH. Risultati rappresentativi.Nei risultati viene mostrato che le microplastiche possono bioaccumulare in embrioni di zebrafish e larve in modo dipendente dalla concentrazione. Prima della schiusa, si trova una forte fluorescenza intorno al coro embrionale;mentre nelle larve di pesce zebra, il sacco vitellino, il pericardio e il tratto gastrointestinale sono i principali siti accumulati di microplastiche. discussione. Questo risultato farà progredire la nostra comprensione della tossicità delle microplastiche per i pesci, e il metodo qui descritto può potenzialmente essere generalizzato per determinare l'accumulo e la distribuzione di altri tipi di materiali fluorescenti nelle prime fasi di vita del pesce zebra.Poiché il corore fungerà da barriera efficace contro le particelle di grandi dimensioni, il processo di dechorionation prima che possa essere necessaria l'esposizione. Tuttavia, l'embrione con corone intatto è più raccomandato per valutare l'ecotossicità degli inquinanti quando si considerano le condizioni di esposizione nel mondo reale. Anche il comportamento delle microplastiche nella soluzione è fondamentale per la biodisponibilità.Le caratteristiche fisicochimiche delle microplastiche devono essere tracciate per tutta la durata dell'esposizione.

Research

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