3.5K Views
•
10:19 min
•
August 12th, 2021
DOI :
August 12th, 2021
•0:04
Introduction
0:37
Cytosolic Protein Isolation
2:45
Cell Homogenization
3:55
Debris Removal and Crude Mitochondrial and Membrane Fraction Isolation
4:47
Isopycnic Density Gradient Purification
6:34
Nuclear Protein Isolation
7:57
Results: Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
9:34
Conclusion
Transcript
Denne protokollen er viktig, fordi den gir en metode for å skille fire cellulære rom fra hverandre, cytoplasma, kjernen, mitokondriene og membranen. Ikke bare det, men det er en skalerbar, reproduserbar prosedyre som har pålitelige resultater. Den største fordelen med denne teknikken er separasjonen av fire cellulære rom med minimal bruk av vaskemidler, noe som muliggjør en mye mer reproduserbar, pålitelig fraksjoneringsprosedyre.
For cytosolisk proteinisolasjon, vokse U937-celler i RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid til en endelig total på seks x 10 til de åttende cellene. Sentrifuger kulturen, og resuspenderer cellepelleten i romtemperatur PBS til en endelig konsentrasjon på fire x 10 til de sjette cellene per milliliter, pipettering forsiktig for å bryte opp klumper. Etter en andre sentrifugering, resuspend pelleten i iskald lysisbuffer A ved en endelig konsentrasjon på to til 10 til de syvende cellene per milliliter.
Tilsett 7,5 milliliter celler til et konisk rør på is for nedstrøms nukleær proteinekstraksjon, og pellet de resterende cellene ved sentrifugering. Resuspend pelleten i cytoplasmatisk isolasjonsbuffer ved en endelig konsentrasjon på to x 10 til de syvende cellene per milliliter, pipettering forsiktig for å bryte opp klumper, før du inkuberer cellene i 20 minutter ved fire grader Celsius med ende over ende rotasjon. På slutten av inkubasjonen sentrifugerer cellesuspensjonen og overfører supernatanten til et rent sentrifugerør.
Sentrifuge supernatanten for å sedimentere det cellulære rusk. Etter sentrifugering, overfør supernatanten til et nytt sentrifugerør, og gjenta sentrifugeringssekvensen til ingen pellet kan observeres. Når prøven er fri for rusk, oppbevar den cytosoliske fraksjonsholdige supernatanten i opptil en måned ved fire grader Celsius.
Resuspend deretter den lagrede cellepelleten i lysisbuffer A til en endelig konsentrasjon på fire x 10 til de sjette cellene per milliliter. For cellehomogenisering, sentrifuger cellesuspensjonen og kast supernatanten for å fjerne overflødig digitonin og systoliske forurensninger. Resuspend pelleten i iskald celle homogeniseringsbuffer ved en endelig konsentrasjon på fire x 10 til de sjette cellene per milliliter for en 30-minutters inkubasjon på is.
I mellomtiden, for perlebasert mekanisk lysis, tilsett 30 gram forvasket rustfritt stål 3,2 millimeter perler til 15 milliliter lysisbuffer B i et 50 milliliter skjørtrør på is for å kjøle seg ned. På slutten av inkubasjonen, erstatt bufferen i skjørtrøret med cellesuspensjon og bland cellene i fem minutter med hastighet åtte. Etter lysis, overfør homogenatet til et rent rør.
Sentrifuger homogenatet, og overfør deretter supernatanten til et nytt rør. For å fjerne gjenværende rusk fra prøven, sentrifuger homogenatet tre ganger som angitt, og overfør supernatanten til et nytt rør etter hver sentrifugering. Etter den siste sentrifugeringen, for å isolere den rå mitokondrielle fraksjonen, overfør supernatanten til et nytt rør for sentrifugering.
Etter sentrifugering, overfør supernatanten til et nytt rør og legg den rå mitokondrielle fraksjonsholdige pelleten på is. For å isolere membranfraksjonen, sentrifuger den oppsamlede supernatanten, og etter å ha kastet supernatanten, plasser den rå membranfraksjonsholdige pelleten på is. For isopycnic tetthet gradient rensing, resuspend rå mitokondrielle og membranfraksjon pellets i 200 mikroliter lysis buffer B, og 1,8 milliliter iodixanol.
For å lage en diskontinuerlig jodxanolgradient for hver prøve, legg først til en milliliter 15% iodixanol til bunnen av et åtte milliliter åpent, tynnvegget ultracentrifugerør per prøve. Deretter legger du sekvensielt en milliliter 20% iodixanol, en milliliter 25% iodixanol, en milliliter 30% iodixanol og en milliliter 35% iodixanol under 15% iodixanollaget i hvert rør. Tilsett to milliliter av den rå mitokondrielle pelletssuspensjonen under bunnlaget av en gradient, og to milliliter av den rå membranpelletssuspensjonen under bunnlaget av den andre gradienten.
Legg forsiktig en milliliter 10% iodixanol på toppen av hver gradient og balanser rørene innen 10 mikrogram av hverandre ved tilsetning av 10% jodixanol etter behov før du renser mitokondrielle og membranfraksjoner ved tetthetsgradient sentrifugering. På slutten av separasjonen, bruk en nål for å punktere siden av de tynnveggede rørene for å samle de synlige båndene fra hver prøve. For nukleær proteinisolasjon, sentrifuger 7,5 milliliter aliquot av celler suspendert i lysisbuffer A, og resuspenderer pelleten i 800 mikroliter iskald celleoppløselighetsbuffer med pipettering og vortexing.
Inkuber suspensjonen på is i 30 minutter for å forstyrre plasma- og organellemembranene, samtidig som de beskytter atomproteinene. På slutten av inkubasjonen sentrifugerer cellesuspensjonen og resuspenderer pelleten ved forsiktig pipettering i 800 mikroliter iskald nukleær lysebuffer supplert med en enhet per mikroliter Benzonase. Inkuber blandingen på en ende over ende-rotator ved fire grader Celsius for å forstyrre kjernemembranen.
Etter 30 minutter, sonikere blandingen tre ganger i fem sekunder ved 20% effekt med en fem sekunders pause mellom pulser for å skjære nukleinsyrene. Etter den siste sonikeringen, sentrifuger homogenatet og samler supernatanten som atomfraksjonen uten å forstyrre pelleten. Western blot av hver av fraksjonene etter tetthetsgradientrensing viser lokalisering av mitokondriell fraksjon til 25 og 30% jodxanollagene, og lokalisering av membranfraksjonen til 10 og 15% jodixanollagene.
Vestlig blodanalyse bekrefter også at hver isolert prøve er ren og fri for forurensning av proteiner fra andre deler av cellen. I tillegg bekrefter densitometrisk analyse av båndintensiteten til hver prøve reproduserbarheten og statistisk signifikans av dataene. Feil utførelse av fraksjoneringen kan føre til krysskontaminering av cellekomponentene.
En høy konsentrasjon av histon H3 i cytosolisk fraksjon, for eksempel, kan skyldes feil avklaring av cytosolisk fraksjon. Feil under isopycnic tetthetsrensing kan føre til forurensning av membranfraksjonen. Det kan være nyttig å utføre en proteinkvantifiseringsanalyse før den vestlige blodanalysen for å bekrefte at fraksjonene faktisk inneholder protein for å tillate gelbelastning basert på proteinmengden, og for å bekrefte at prosedyren er riktig utført.
Det er kritisk at cytoplasmatisk fraksjon ikke inneholder en pellet. Western blots, eller ELISAs kan utføres etter denne prosedyren for å tillate deg å analysere den subcellulære plasseringen av forskjellige proteiner under visse forhold. Denne teknikken tillot oss å analysere handelen med forskjellige celledødsfaktorer under forhold med hyperglykemi.
Og så, for oss, bidro dette til å kaste lys over mekanismen for det hyperglykemiske skiftet fra apoptose til nekrose.
Denne fraksjoneringsprotokollen vil tillate forskere å isolere cytoplasmatiske, kjernefysiske, mitokondrielle og membranproteiner fra pattedyrceller. De to sistnevnte subcellulære fraksjonene blir videre renset via isopycnic tetthetsgradient.
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved