Name: whole-mount staining, visualization, and analysis of fungiform, circumvallate, and palate taste buds
Uploaded: 2021-02-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds at JoVE.com

हम ऊतक धुंधला करने के लिए अपने योगदान के लिए Kavisca Kuruparanantha धन्यवाद और circumvallate स्वाद कलियों की इमेजिंग, जेनिफर जू धुंधला और papilla के लिए संरक्षण की इमेजिंग के लिए, पशु देखभाल और जीनोटाइपिंग के लिए Kaytee हॉर्न, और नरम तालू स्वाद कलियों के अपने ऊतक धुंधला के लिए Liqun मा. इस परियोजना को R21 DC014857 और R01 DC007176 द्वारा R.F.K और F31 DC017660 से L.O. के लिए समर्थित किया गया था।

नोट: सभी जानवरों की देखभाल मानवीय देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग पर अमेरिकी सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआई...

तीन मौखिक गुहा स्वाद क्षेत्रों (कवक रूप, सर्कमवलेट, और तालु) से पूरे स्वाद कलियों को लगातार इकट्ठा करने और दागने के लिए एक दृष्टिकोण का विकास स्वाद-ट्रांसड्यूसिंग कोशिकाओं का विश्लेषण करने, नई शामिल को?...

स्वाद कलियां 50-100 विशेष उपकला कोशिकाओं के संग्रह हैं जो मौखिक गुहा में मौजूद रासायनिक-स्वाद उत्तेजनाओं के सबसेट को बांधती हैं। स्वाद-ट्रांसड्यूसिंग कोशिकाओं को आमतौर परप्रकार1,2,3,4,5, 6,7,8,9के रूप में मौजूद माना जाताहै,जो शुरू में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी मानदंडों पर आधारित था जो बाद में आणविक मार्करों के साथ सहसंबद्ध थे। टाइप II कोशिकाएं फॉस्फोलिपास सी-बीटा 2 (PLCπ2)2 और क्षणिक रिसेप्टर संभावित धनायन चैनल, उपपरिवार एम सदस्य 51 व्यक्त करती हैं और इसमें ऐसी कोशिकाएं शामिल होती हैं जो मीठे, कड़वे और उमामी1, 10को ट्रांसड्यूस करतीहैं। प्रकार III कोशिकाएं कार्बोनिक एनहाइड्रेज 4 (Car4)11 और synaptosomal-संबद्ध प्रोटीन 258 को व्यक्त करती हैं और उन कोशिकाओं को निरूपित करती हैं जो मुख्य रूप से खट्टे स्वाद11का जवाब देती हैं। लवणता को ट्रांसड्यूस करने वाली कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से12, 13,14के रूप में चित्रित नहीं किया गया है, लेकिन संभावित रूप से टाइप I, टाइप II और टाइप III कोशिकाओं15, 16,17,18, 19को शामिल किया जा सकता है। स्वाद-कली वातावरण जटिल और गतिशील है, यह देखते हुए कि स्वाद-ट्रांसड्यूसिंग कोशिकाएं लगातार वयस्कता के दौरान बदल जाती हैं और बेसल पूर्वजों द्वारा प्रतिस्थापित की जाती हैं3,20,21। ये स्वाद-ट्रांसड्यूसिंग कोशिकाएं जेनिकुलेट और पेट्रोसल गैन्ग्लिया से छद्म-एकध्रुवीय तंत्रिका तंतुओं से जुड़ती हैं, जो ब्रेनस्टेम को स्वाद की जानकारी देती हैं। इन न्यूरॉन्स को मुख्य रूप से स्वाद की जानकारी के आधार पर वर्गीकृत किया गया हैजोवे 22 ,23ले जाते हैं क्योंकि उनकी आकृति विज्ञान के बारे में जानकारी हाल ही में 24तक मायावी रही है। टाइप II कोशिकाएं कैल्शियम होमोस्टैसिस मॉड्यूलेटर प्रोटीन 1 आयन चैनल25के माध्यम से तंत्रिका तंतुओं के साथ संवाद करती हैं, जबकि टाइप III कोशिकाएं शास्त्रीय synapses8,26के माध्यम से संवाद करती हैं। स्वाद कली कोशिकाओं के आगे लक्षण वर्णन-जिसमें ट्रांसड्यूसिंग सेल प्रकार के वंश शामिल हैं, कारक जो उनके भेदभाव को प्रभावित करते हैं, और एर्बोर को जोड़ने की संरचनाएं सक्रिय जांच के सभी क्षेत्र हैं।
स्वाद-कली अध्ययन कई तकनीकी चुनौतियों से बाधित हुए हैं। जीभ को बनाने वाले विषम और घने ऊतक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री27 , 28,29के लिए एंटीबॉडी पारगम्यता को काफी कम कर देते हैं . इन बाधाओं ने सेक्शनिंग प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है जिसके परिणामस्वरूप वर्गों में स्वाद कलियों का विभाजन होता है ताकि माप या तो प्रतिनिधि वर्गों के आधार पर अनुमानित हो या वर्गों में अभिव्यक्त हो। पहले, प्रतिनिधि पतले वर्गों का उपयोग वॉल्यूम मानों और ट्रांसड्यूसिंग-सेलकाउंट्स 30दोनों को अनुमानित करने के लिए किया गया है। मोटा सीरियल सेक्शनिंग सभी स्वाद-कली वर्गों की इमेजिंग और प्रत्येक अनुभाग31से माप के सारांश के लिए अनुमति देता है। इस तरह के मोटे वर्गों को काटना और केवल पूरे स्वाद की कलियों का चयन करना छोटी स्वाद कलियों32 , 33,34की ओर नमूने लेने का पूर्वाग्रह करता है । अनुभागित स्वाद कलियों से तंत्रिका संरक्षण अनुमान पिक्सेल संख्या13 , 35के विश्लेषण पर आधारित हैं,यदि सभी36,37,38पर परिमाणित किया जाता है। ये माप पूरी तरह से संरचना और व्यक्तिगत तंत्रिका arbors की संख्या को अनदेखा करते हैं, क्योंकि arbors विभाजित होते हैं (और आमतौर पर खराब लेबल)। अंत में, हालांकि उपकला को छीलने से पूरे स्वाद की कलियों को39,40दाग होने की अनुमति मिलतीहै,यह स्वाद-कली तंत्रिका तंतुओं को भी हटा देता है और कोशिकाओं के बीच सामान्य संबंधों को बाधित कर सकता है। इसलिए, स्वाद कलियों के भीतर संरचनात्मक संबंधों की जांच सीमित हो गई है क्योंकि इस व्यवधान के कारण धुंधला दृष्टिकोण।
संपूर्ण संरचना संग्रह प्रतिनिधि वर्गों की आवश्यकता को समाप्त करता है और वॉल्यूम, सेल गिनती और संरचना आकृति विज्ञान41के पूर्ण-मूल्य माप के निर्धारण की अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण सटीकता को भी बढ़ाता है, पूर्वाग्रह को सीमित करता है, और तकनीकी परिवर्तनशीलता को कम करता है। यह अंतिम तत्व महत्वपूर्ण है क्योंकि स्वाद कलियां 34, 42 के भीतरऔर43, 44 केक्षेत्रों में काफी जैविक परिवर्तनशीलता दिखातीहैं,और पूरे स्वाद-कली विश्लेषण नियंत्रण और प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच पूर्ण सेल संख्याओं की तुलना करने की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, बरकरार स्वाद कलियों को इकट्ठा करने की क्षमता विभिन्न ट्रांसड्यूसिंग कोशिकाओं और उनके संबंधित तंत्रिका तंतुओं के बीच शारीरिक संबंधों के विश्लेषण की अनुमति देती है। क्योंकि स्वाद-ट्रांसड्यूसिंग कोशिकाएं एक-दूसरे के साथ संवाद कर सकती हैंऔर तंत्रिका तंतुओं46के साथ संवाद कर सकती हैं, ये संबंध सामान्य कार्य के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रकार, हानि-की-फ़ंक्शन स्थितियां कोशिकाओं के नुकसान के कारण नहीं हो सकती हैं, बल्कि सेल संबंधों में परिवर्तन के बजाय हो सकती हैं। बशर्ते यहां स्वाद कलियों और उनके संरक्षण, स्वाद-सेल की गिनती और आकार, और ट्रांसड्यूसिंग-सेल संबंधों और तंत्रिका-आर्बर आकारिकी के विश्लेषण को सुविधाजनक बनाने के लिए परिष्कृत मात्रा विश्लेषण के लिए पूर्ण माप के लाभों को प्राप्त करने के लिए पूरे स्वाद कलियों को इकट्ठा करने के लिए एक विधि है। ऊतक की तैयारी के लिए इस उपन्यास पूरे-माउंट विधि के डाउनस्ट्रीम में दो वर्कफ़्लो भी प्रस्तुत किए गए हैं: 1) स्वाद कली की मात्रा और कुल संरक्षण का विश्लेषण करने के लिए और 2) स्वाद न्यूरॉन्स के विरल-सेल आनुवंशिक लेबलिंग के लिए (स्वाद-ट्रांसड्यूसिंग कोशिकाओं के सबसेट लेबल के साथ) और स्वाद-तंत्रिका आर्बर आकृति विज्ञान के बाद के विश्लेषण, स्वाद-सेल प्रकारों की संख्या और उनके आकार, और ट्रांसड्यूसिंग कोशिकाओं और ट्रांसड्यूसिंग के बीच भौतिक संबंधों का विश्लेषण करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग कोशिकाओं और उनके तंत्रिका arbors. साथ में, ये वर्कफ़्लो ऊतक की तैयारी के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रदान करते हैं और पूरे स्वाद कलियों के विश्लेषण और उनके इनरवेटिंग आर्बर्स की पूरी आकृति विज्ञान के लिए।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td >ACROS Organics</td>
			<td >AC421430100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Methylbutane</td>
			<td>ACROS</td>
			<td>126470025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-007-003</td>
			<td>15.5&#956;L/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor&#174; 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>712-605-150</td>
			<td>(1:500)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AutoQuant X3 software</td>
			<td>&#160;Media Cybernetics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blunt End Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>FST 91100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Click-iT&#8482; Plus EdU Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C10637</td>
			<td>Follow kit instructions&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coverglass</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytokeratin-8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826)&#160;</td>
			<td>Troma1 supernatant</td>
			<td>(1:50, store at 4&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissection Scissors (coarse)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissection Scissors (fine)</td>
			<td>Moria</td>
			<td>MC19B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>(1:500)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor&#174; 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A31572</td>
			<td>(1:500)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DyLight&#8482; 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>805-477-008</td>
			<td>(1:500)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides)</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Car4</td>
			<td>R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>AF2414</td>
			<td>(1:500)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane&#160;</td>
			<td>pixel-based image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurolucida 360 + Explorer</td>
			<td>MBF Biosciences</td>
			<td>3D vector based image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Rabbit Serum&#160;</td>
			<td>Equitech-Bio, Inc</td>
			<td>SR30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Olympus FV1000</td>
			<td></td>
			<td >(multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td>EMD</td>
			<td>PX0055-3</td>
			<td>4% in 0.1M PB</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rabbit anti-dsRed</td>
			<td>Living Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)</td>
			<td>632496</td>
			<td>(1:500)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rabbit anti-PLC&#946;2&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Cat# sc-206</td>
			<td>(1:500)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >tert-Amyl alcohol</td>
			<td>Aldrich Chemical Company</td>
			<td>8.06193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue Molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue-Tek&#174;&#160;O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zenon&#8482; Alexa Fluor&#8482; 555 Rabbit IgG Labeling Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Z25305</td>
			<td>Follow kit instructions&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount staining, visualization, and analysis of fungiform, circumvallate, and palate taste buds

स्वाद कलियां स्वाद-ट्रांसड्यूसिंग कोशिकाओं के संग्रह हैं जो मौखिक गुहा में रासायनिक उत्तेजनाओं के सबसेट का पता लगाने के लिए विशेष हैं। ये ट्रांसड्यूसिंग कोशिकाएं तंत्रिका तंतुओं के साथ संवाद करती हैं जो इस जानकारी को मस्तिष्क तक ले जाती हैं। क्योंकि स्वाद-ट्रांसड्यूसिंग कोशिकाएं लगातार मर जाती हैं और पूरे वयस्कता में बदल दी जाती हैं, स्वाद-कली वातावरण जटिल और गतिशील दोनों है, जिसके लिए इसके सेल प्रकारों, उनके स्थानों और उनके बीच किसी भी शारीरिक संबंधों के विस्तृत विश्लेषण की आवश्यकता होती है। विस्तृत विश्लेषण जीभ-ऊतक विषमता और घनत्व द्वारा सीमित किया गया है जिसने एंटीबॉडी पारगम्यता को काफी कम कर दिया है। इन बाधाओं को सेक्शनिंग प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है जिसके परिणामस्वरूप वर्गों में स्वाद कलियों को विभाजित किया जाता है ताकि माप केवल अनुमानित हो, और सेल संबंध खो जाते हैं। इन चुनौतियों को दूर करने के लिए, यहां वर्णित तरीकों में तीन स्वाद क्षेत्रों से पूरे स्वाद कलियों और व्यक्तिगत टर्मिनल आर्बर्स को इकट्ठा करना, इमेजिंग और विश्लेषण करना शामिल है: फफूंदी रूप पैपिले, सर्कमवलेट पैपिले, और तालु। पूरे स्वाद कलियों को इकट्ठा करना पूर्वाग्रह और तकनीकी परिवर्तनशीलता को कम करता है और स्वाद-कली की मात्रा, कुल स्वाद-कली इनरवेशन, ट्रांसड्यूसिंग-सेल गिनती, और व्यक्तिगत टर्मिनल आर्बर्स की आकृति विज्ञान सहित सुविधाओं के लिए पूर्ण संख्या की रिपोर्ट करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इस विधि के फायदों को प्रदर्शित करने के लिए, यह पेपर एक सामान्य स्वाद-कली मार्कर और सभी स्वाद फाइबर के लिए एक लेबल का उपयोग करके कवक रूप और सर्कमवैलेट स्वाद कलियों के बीच स्वाद कली और इननेर्वेशन वॉल्यूम की तुलना प्रदान करता है। स्वाद न्यूरॉन्स के विरल-सेल आनुवंशिक लेबलिंग के उपयोग के लिए एक वर्कफ़्लो (स्वाद-ट्रांसड्यूसिंग कोशिकाओं के लेबल किए गए सबसेट के साथ) भी प्रदान किया जाता है। यह वर्कफ़्लो व्यक्तिगत स्वाद-तंत्रिका arbors, सेल प्रकार संख्याओं, और छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कोशिकाओं के बीच भौतिक संबंधों की संरचनाओं का विश्लेषण करता है। साथ में, ये वर्कफ़्लो ऊतक की तैयारी और पूरे स्वाद कलियों के विश्लेषण और उनके इनरवेटिंग आर्बर्स की पूरी आकृति विज्ञान के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रदान करते हैं।

dsRed और केराटिन -8 (एक सामान्य स्वाद-कली मार्कर) के एंटीबॉडी के साथ भाषाई उपकला का धुंधला होना, दोनों पूरे स्वाद कलियों और सभी स्वाद-कली इन्नेर्वेशन को फोक्स 2 बी-क्रे: tdTomato चूहों50, 51 <strong class=...

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Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

यह पेपर ऊतक की तैयारी, धुंधला, और पूरे कवक, सर्कमवैलेट और तालु स्वाद कलियों के विश्लेषण के तरीकों का वर्णन करता है जो लगातार पूरे और बरकरार स्वाद कलियों (तंत्रिका फाइबर सहित जो उन्हें इनरवेट करते हैं) और स्वाद कलियों और आसपास के पैपिला के भीतर संरचनाओं के बीच संबंधों को बनाए रखते हैं।

पूरे माउंट धुंधला, विज़ुअलाइज़ेशन, और Fungiform, Circumvallate, और तालु स्वाद कलियों का विश्लेषण

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...

यह पूरे माउंट विच्छेदन और विश्लेषण वर्कफ़्लो व्यक्तिगत स्वाद तंत्रिका arbors, transducing सेल प्रकार संख्याओं, और कोशिकाओं के बीच शारीरिक संबंधों के पूर्ण आकारिकी का विश्लेषण करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रदान करता है। पूरे भाषाई उपकला को इकट्ठा करने से हमें कोशिकाओं की पूर्ण संख्या और पूरे स्वाद कली के भीतर इनरवेशन की मात्रा को मापने की अनुमति मिलती है। यह दृष्टिकोण वर्गों से नमूने के आधार पर सेल संरचना के अनुमानों की तुलना में अधिक सटीक है, जो तकनीकी परिवर्तनशीलता को कम करता है।यह पहली विधि भी है जो स्वाद कली कोशिकाओं को उनके संरक्षण के संबंध में विस्तृत विश्लेषण प्रदान करती है। यह विधि स्वाद कली के भीतर संभावित सर्किटरी में जांच को बढ़ा सकती है, साथ ही साथ रोग प्रक्रियाओं और कीमोथेरेपी जो सामान्य स्वाद समारोह को बाधित करती है। इनमें से अधिकांश मामलों में, यह स्पष्ट नहीं है कि कौन सी संरचना या संबंध बाधित है, इसलिए उन सभी कारकों को बरकरार रखने से एक ही तैयारी के भीतर सभी विश्लेषणों की अनुमति मिलती है।सबसे आम गलती उपकला के नीचे पर्याप्त विच्छेदन नहीं करके उपकला को नुकसान पहुंचाने से बचने की कोशिश कर रही है। ऊतक मोल्ड में ऊतक को ठंडा करने से पहले जितना संभव हो उतना अंतर्निहित ऊतक को हटाना आवश्यक है। यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है कि उपकला ऊतक मोल्ड के तल में फ्लैट बिछा रही है।0.1 दाढ़ फॉस्फेट बफर में जीभ को पिघलाने और धोने से शुरू करें। फिर एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एक ग्लास स्लाइड पर कवकरूप पैपिले युक्त पूर्वकाल जीभ का 1/2 रखें। मांसपेशियों को हटाने के लिए कुंद-समाप्त संदंश और विच्छेदन कैंची का उपयोग करें और ऊतक को खुला रखें क्योंकि भाषाई उपकला घुमावदार है, जो उपकला के समानांतर मोटे विच्छेदन कैंची के ब्लेड को रखकर ऊतक का एक सपाट अभिविन्यास सुनिश्चित करता है।जीभ के वेंट्रल गैर-केराटिनाइज्ड एपिथेलियम को छोड़ दें क्योंकि इसमें कोई स्वाद कलियां नहीं होती हैं। फिर केराटिनाइज्ड एपिथेलियम के नीचे के करीब विच्छेदन के लिए ठीक विच्छेदन कैंची का उपयोग करें। एक ऊतक मोल्ड में उपकला का एक टुकड़ा रखने के लिए कुंद-अंत संदंश का उपयोग करें और यह सुनिश्चित करें कि यह सपाट देता है।फिर ऊतक के लिए इष्टतम काटने के तापमान यौगिक, या OCT की एक बूंद जोड़ें। विच्छेदन दायरे के तहत पहले से ठंडा धातु के आधार पर ऊतक मोल्ड रखें, फिर ऊतक को संदंश के साथ हल्के से टैप करना जारी रखें जब तक कि ओसीटी जमे हुए न हो जाए, यह सुनिश्चित करते हुए कि ऊतक यथासंभव सपाट हो जाए। एक बार OCT जमे हुए है, जल्दी से अतिरिक्त OCT जोड़ें और जमे हुए जब तक ठंडा 2-methylbutane के एक बीकर में मोल्ड जगह है.क्रायोस्टेट पर OCT मोल्ड माउंट करें और इसे 20 माइक्रोन वर्गों में काट लें। प्रत्येक अनुभाग को इकट्ठा करें और इसे उपकला के आधार से इसकी निकटता का आकलन करने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे देखें। उपकला के नीचे से ऊतक को शेव करने के बाद, उपकला को पिघलाएं और इसे शेकर पर 0.1 दाढ़ पीबी में दो बार कुल्ला करें।नरम और कठोर तालु के जंक्शन के लिए कठोर तालु पूर्वकाल को काटें, फिर नरम तालू को अंतर्निहित ऊतक से अलग करें, यह सुनिश्चित करें कि किसी भी शेष हड्डी के टुकड़े को काट दिया जाए और अतिरिक्त मांसपेशियों और संयोजी ऊतक को हटा दिया जाए। कुंद-समाप्त संदंश के साथ तालु को पकड़ो और शेष ग्रंथियों को हटा दें और उन्हें रेजर ब्लेड के साथ धीरे से स्क्रैप करके संयोजी ऊतक खो दें। पूरे स्वाद कलियों और Phox2b-Cre TdTomato चूहों में सभी स्वाद कली संरक्षण DsRed और केराटिन आठ के लिए एंटीबॉडी के साथ भाषाई उपकला धुंधला द्वारा लेबल किया गया था।स्वाद कली की मात्रा को मापा गया था और कवक रूप या सर्कमवैलेट माप क्षेत्रों में स्वाद कली की मात्रा और संरक्षण मात्रा के बीच कोई सहसंबंध नहीं बताया गया था। TrkB Creer TdTomato चूहों में tamoxifen की कम खुराक के प्रशासन जीन पुनर्संयोजन और न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या के लेबलिंग का कारण बनता है। एक पूरे माउंट स्वाद कली स्वाद transducing सेल मार्करों कार्बोनिक anhydrase चार और फॉस्फोलिसिस सी बीटा दो के साथ सना हुआ यहाँ दिखाया गया है.इस स्वाद कली में दो लेबल टर्मिनल आर्बर्स होते हैं, जिन्हें फाइबर के पुनर्निर्माण के बाद हटाए गए स्वाद कली के साथ दिखाया जाता है। तंत्रिका तंतुओं और स्वाद ट्रांसड्यूसिंग कोशिकाओं के बीच निकटतम निकटता निर्धारित करने के लिए सेल पिक्सेल-आधारित इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करने से पता चला कि 19 स्वाद ट्रांसड्यूसिंग कोशिकाओं में से, नीले टर्मिनल आर्बर हल्के नीले कार्बोनिक एनहाइड्रेज़ फोर प्लस सेल के 200 नैनोमीटर के भीतर था। हरे रंग की ट्रेसिंग से जुड़े टर्मिनल आर्बर को मैजेंटा में दिखाया गया है और यह प्रकाश और गहरे नीले कार्बोनिक एनहाइड्रेज फोर प्लस कोशिकाओं दोनों के 200 नैनोमीटर के भीतर है।पूरे माउंट केराटिन आठ और 5-एथिल -2'डीऑक्सीयूरिडिन या कवक रूप स्वाद कलियों के ईडीयू धुंधला होने से पता चला कि ईडीयू-लेबल वाली कोशिकाएं स्वाद कलियों के भीतर और बाहर दोनों मौजूद थीं। मैजेंटा और बैंगनी नाभिक स्वाद कली के केराटिन आठ प्लस सीमा के बाहर देखे जाते हैं। पीले, टील और नीले रंग की कोशिकाएं स्वाद कली के भीतर थीं।इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, ऊतक विच्छेदन और ठंड के चरण निर्णायक होते हैं। इन ऊतक विच्छेदन विधियों को विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और संरचनाओं के लिए धुंधला करके पीछा किया जा सकता है ताकि स्वाद कली के भीतर और स्वाद कली के बाहर दोनों संबंधों का विश्लेषण किया जा सके, लेकिन पैपिला के भीतर। यह स्वाद कली के भीतर पूरे स्वाद arbors का पहला विश्लेषण है, साथ ही स्वाद transducing कोशिकाओं के साथ उनके संबंधों.एक ही तैयारी में इन तत्वों में से कई के लिए संरक्षण और धुंधला दोनों विश्लेषण के लिए संभावनाओं का विस्तार करता है और उन मापों को परिष्कृत करता है जो संभव हैं।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

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साबुत माउंट में भ्रूण तंत्रिका तंत्र के विज़ुअलाइज़ेशन ड्रोसोफिला भ्रूण

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

एक माउस आँखों के रेटिना वर्णक उपकला के एक पूरे पर्वत के लिए विच्छेदन

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माउस sciatic तंत्रिका और पूरे पर्वत स्नायु विश्लेषण द्वारा पुनर्जनन के बाद आकलन क्रश

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

अलगाव और मानव कवकरूप की स्वाद Papillae सेल की संस्कृति

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

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और माउस मस्तिष्क प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस का उपयोग में Dendrites और कांटा के आनुवंशिक हेरफेर विज़ुअलाइज़ेशन<em&gt; Utero में</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

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एंजियोजिनेसिस जांच नवजात माउस रेटिना का पूरा पर्वत immunofluorescent धुंधला<em&gt; विवो में</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

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पूरे माउंट न्यूरोमस्कुलर जंक्शन विश्लेषण के लिए ट्रांस बनाम एब्डोमिनिस मांसपेशी का विच्छेदन

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

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में घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स के पूरा पर्वत immunolabeling<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; एंटीना

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

माउस भ्रूण संवेदी अक्षतंतु अनुमानों के पूरे माउंट इमेजिंग

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

चूहे के मुख्य घ्राण प्रणाली में पक्ष्माभिका का पूरा पर्वत लेबल

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...