Name: whole-mount staining, visualization, and analysis of fungiform, circumvallate, and palate taste buds
Uploaded: 2021-02-11T14:00:00
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Agradecemos a Kavisca Kuruparanantha por sus contribuciones a la tinción de tejidos y la obtención de imágenes de papilas gustativas circunvaladas, Jennifer Xu por la tinción y la imagen de la inervación en la papila, Kaytee Horn por el cuidado de los animales y el genotipado, y Liqun Ma por su tinción de tejidos de las papilas gustativas del paladar blando. Este proyecto fue apoyado por R21 DC014857 y R01 DC007176 a R.F.K y F31 DC017660 a L.O.

NOTA: Todos los animales fueron atendidos de acuerdo con las pautas establecidas por la Política del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos sobre el Cuidado y Uso Humanitario de animales de laboratorio y la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los ratones Phox2b-Cre (cepa MMRRC 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) o ratones TrkBCreER (Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg)fueron criados con ratones reporteros tdTomato (Ai14). AdvillinCreER47</su...

El desarrollo de un enfoque para recolectar y teñir consistentemente papilas gustativas enteras de tres regiones gustativas de la cavidad oral (fungiformes, circunvaladas y el paladar) proporciona mejoras significativas para analizar las células transductoras del gusto, rastrear las células recién incorporadas, la inervación y las relaciones entre estas estructuras. Además, facilita la localización de un potencial marcador neuronal secundario tanto dentro como fuera de una población marcada50.</...

Las papilas gustativas son colecciones de 50-100 células epiteliales especializadas que se unen a subconjuntos de estímulos químico-gustativos presentes en la cavidad oral. En general, se cree que las células transductoras del gusto existen como tipos1,2,3,4,5, 6,7,8,9,inicialmente basadas en criterios de microscopía electrónica que luego se correlacionaron con marcadores moleculares. Las células tipo II expresan fosfolipasa C-beta 2 (PLCβ2)2 y receptor transitorio potencial del canal catiónico, subfamilia M miembro 51 e incluyen células que transducen dulce, amargo y umami1,10. Las células tipo III expresan anhidrasa carbónica 4 (Car4)11 y proteína asociada a sinaptosomal 258 y denotan células que responden principalmente al sabor agrio11. Las células que transducen salinidad no han sido tan claramente delineadas12,13,14,pero potencialmente podrían incluir las células Tipo I, Tipo II y Tipo III15,16,17,18,19. El entorno de las papilas gustativas es complejo y dinámico, dado que las células transductoras del gusto giran continuamente a lo largo de la edad adulta y son reemplazadas por progenitores basales3,20,21. Estas células transductoras de sabor se conectan a las fibras nerviosas pseudounipolares de los ganglios geniculados y petrosales, que pasan la información del gusto al tronco encefálico. Estas neuronas se han categorizado principalmente en función del tipo de información gustativa que llevan22,23 porque la información sobre su morfología ha sido esquiva hasta hace poco24. Las células de tipo II se comunican con las fibras nerviosas a través de la proteína moduladora de la homeostasis del calcio 1 canales iónicos25,mientras que las células de tipo III se comunican a través de las sinapsis clásicas8,26. La caracterización adicional de las células de las papilas gustativas, incluidos los linajes de tipo celular transductores, los factores que influyen en su diferenciación y las estructuras de conexión de los cenadores son todas áreas de investigación activa.
Los estudios de papilas gustativas se han visto obstaculizados por varios desafíos técnicos. Los tejidos heterogéneos y densos que componen la lengua reducen significativamente la permeabilidad de anticuerpos para la inmunohistoquímica27,28,29. Estos obstáculos han requerido protocolos de seccionamiento que resultan en la división de las papilas gustativas entre secciones para que las mediciones se aproximen en función de secciones representativas o se sumen entre secciones. Anteriormente, se han utilizado secciones delgadas representativas para aproximar tanto los valores de volumen como los recuentos de células transductoras30. La sección en serie más gruesa permite obtener imágenes de todas las secciones de papilas gustativas y la suma de las mediciones de cada sección31. Cortar secciones tan gruesas y seleccionar solo papilas gustativas enteras sesga el muestreo hacia papilas gustativas más pequeñas32,33,34. Las estimaciones de la inervación nerviosa de las papilas gustativas seccionadas se han basado en análisis de los números de píxeles13, 35,si se cuantifican en absoluto36,37,38. Estas mediciones ignoran por completo la estructura y el número de cenadores nerviosos individuales, porque los cenadores están divididos (y generalmente mal etiquetados). Por último, aunque pelar el epitelio permite teñir papilas gustativas enteras39,40, también elimina las fibras nerviosas de las papilas gustativas y podría interrumpir las relaciones normales entre las células. Por lo tanto, las investigaciones de las relaciones estructurales dentro de las papilas gustativas han sido limitadas debido a esta interrupción causada por los enfoques de tinción.
La recolección de estructura completa elimina la necesidad de secciones representativas y permite la determinación de mediciones de valor absoluto de volúmenes, recuentos celulares y morfologías de estructura41. Este enfoque también aumenta la precisión, limita el sesgo y reduce la variabilidad técnica. Este último elemento es importante porque las papilas gustativas muestran una variabilidad biológica considerable tanto dentro de34,42 como entre las regiones43,44, y los análisis completos de papilas gustativas permiten comparar el número absoluto de células entre las condiciones de control y experimentales. Además, la capacidad de recoger papilas gustativas intactas permite el análisis de las relaciones físicas entre las diferentes células transductoras y sus fibras nerviosas asociadas. Debido a que las células transductoras del gusto pueden comunicarse entre sí45 y comunicarse con las fibras nerviosas46,estas relaciones son importantes para la función normal. Por lo tanto, las condiciones de pérdida de función pueden no deberse a una pérdida de células, sino a cambios en las relaciones celulares. Aquí se proporciona un método para recolectar papilas gustativas completas para lograr los beneficios de las mediciones absolutas para refinar los análisis de volumen tanto para las papilas gustativas como para sus inervaciones, recuentos y formas de células gustativas, y para facilitar los análisis de las relaciones de las células transductoras y las morfologías nervio-cenador. También se presentan dos flujos de trabajo aguas abajo de este nuevo método de montaje completo para la preparación de tejidos: 1) para analizar el volumen de las papilas gustativas y la inervación total y 2) para el etiquetado genético de células dispersas de las neuronas del gusto (con subconjuntos de células transductoras del gusto marcadas) y los análisis posteriores de la morfología del cenador del nervio gustativo, el número de tipos de células gustativas y sus formas, y el uso de software de análisis de imágenes para analizar las relaciones físicas entre las células transductoras y las que se producen entre la transducción. células y sus cenadores nerviosos. Juntos, estos flujos de trabajo proporcionan un enfoque novedoso para la preparación de tejidos y para el análisis de papilas gustativas completas y la morfología completa de sus cenadores de inervación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td >ACROS Organics</td>
			<td >AC421430100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Methylbutane</td>
			<td>ACROS</td>
			<td>126470025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-007-003</td>
			<td>15.5&#956;L/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor&#174; 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>712-605-150</td>
			<td>(1:500)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AutoQuant X3 software</td>
			<td>&#160;Media Cybernetics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blunt End Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>FST 91100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Click-iT&#8482; Plus EdU Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C10637</td>
			<td>Follow kit instructions&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coverglass</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytokeratin-8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826)&#160;</td>
			<td>Troma1 supernatant</td>
			<td>(1:50, store at 4&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissection Scissors (coarse)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissection Scissors (fine)</td>
			<td>Moria</td>
			<td>MC19B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>(1:500)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor&#174; 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A31572</td>
			<td>(1:500)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DyLight&#8482; 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>805-477-008</td>
			<td>(1:500)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides)</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Car4</td>
			<td>R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>AF2414</td>
			<td>(1:500)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane&#160;</td>
			<td>pixel-based image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurolucida 360 + Explorer</td>
			<td>MBF Biosciences</td>
			<td>3D vector based image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Rabbit Serum&#160;</td>
			<td>Equitech-Bio, Inc</td>
			<td>SR30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Olympus FV1000</td>
			<td></td>
			<td >(multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td>EMD</td>
			<td>PX0055-3</td>
			<td>4% in 0.1M PB</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rabbit anti-dsRed</td>
			<td>Living Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)</td>
			<td>632496</td>
			<td>(1:500)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rabbit anti-PLC&#946;2&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Cat# sc-206</td>
			<td>(1:500)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >tert-Amyl alcohol</td>
			<td>Aldrich Chemical Company</td>
			<td>8.06193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue Molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue-Tek&#174;&#160;O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zenon&#8482; Alexa Fluor&#8482; 555 Rabbit IgG Labeling Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Z25305</td>
			<td>Follow kit instructions&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount staining, visualization, and analysis of fungiform, circumvallate, and palate taste buds

Las papilas gustativas son colecciones de células transductoras del gusto especializadas para detectar subconjuntos de estímulos químicos en la cavidad oral. Estas células transductoras se comunican con las fibras nerviosas que llevan esta información al cerebro. Debido a que las células transductoras del gusto mueren continuamente y son reemplazadas a lo largo de la edad adulta, el entorno de las papilas gustativas es complejo y dinámico, lo que requiere análisis detallados de sus tipos de células, sus ubicaciones y cualquier relación física entre ellas. Los análisis detallados se han visto limitados por la heterogeneidad y la densidad del tejido lengüístico que han reducido significativamente la permeabilidad de los anticuerpos. Estos obstáculos requieren protocolos de seccionamiento que resultan en la división de las papilas gustativas en todas las secciones para que las mediciones solo se aproximen y se pierdan las relaciones celulares. Para superar estos desafíos, los métodos descritos en este documento implican la recolección, obtención de imágenes y análisis de papilas gustativas completas y cenadores terminales individuales de tres regiones gustativas: papilas fungiformes, papilas circunvaladas y el paladar. La recolección de papilas gustativas completas reduce el sesgo y la variabilidad técnica y se puede usar para informar números absolutos de características que incluyen el volumen de las papilas gustativas, la inervación total de las papilas gustativas, los recuentos de células transductoras y la morfología de los cenadores terminales individuales. Para demostrar las ventajas de este método, este documento proporciona comparaciones de los volúmenes de papilas gustativas e inervación entre las papilas gustativas fungiformes y circunvaladas utilizando un marcador general de papilas gustativas y una etiqueta para todas las fibras gustativas. También se proporciona un flujo de trabajo para el uso del etiquetado genético de células dispersas de las neuronas del gusto (con subconjuntos etiquetados de células transductoras del gusto). Este flujo de trabajo analiza las estructuras de los cenadores individuales del nervio del gusto, los números de tipo de célula y las relaciones físicas entre las células utilizando un software de análisis de imágenes. Juntos, estos flujos de trabajo proporcionan un enfoque novedoso para la preparación y el análisis de tejidos tanto de papilas gustativas completas como de la morfología completa de sus cenadores inervantes.

Tinción del epitelio lingual con anticuerpos contra dsRed y queratina-8 (un marcador general de papilas gustativas) etiquetadas tanto como todas las papilas gustativas enteras y toda la inervación de las papilas gustativas en ratones Phox2b-Cre:tdTomato50,51 (Figura 3A). Las imágenes de estas papilas gustativas desde sus poros hasta sus bases dieron las imágenes planas x-y de mayor resolución(Figura 3A,</str...

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Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

Este documento describe métodos para la preparación de tejidos, tinción y análisis de papilas gustativas completas fungiformes, circunvaladas y del paladar que producen consistentemente papilas gustativas enteras e intactas (incluidas las fibras nerviosas que las inervan) y mantienen las relaciones entre las estructuras dentro de las papilas gustativas y la papila circundante.

Tinción, visualización y análisis de papilas gustativas fungiformes, circunvaladas y del paladar

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...

Este flujo de trabajo de disección y análisis de montaje completo proporciona un enfoque novedoso para analizar la morfología completa de los cenadores de nervios del gusto individuales, la transducción de números de tipo celular y las relaciones físicas entre las células. La recolección de todo el epitelio lingual nos permite medir el número absoluto de células y el volumen de inervación dentro de toda la papila gustativa. Este enfoque es más preciso que las estimaciones de la estructura celular basadas en el muestreo de secciones, lo que reduce la variabilidad técnica.Este es también el primer método que proporciona un análisis detallado de las células de las papilas gustativas en relación con su inervación. Este método puede mejorar las investigaciones sobre los circuitos potenciales dentro de la papila gustativa, así como los procesos de enfermedad y las quimioterapias que interrumpen la función normal del gusto. En la mayoría de estos casos, no está claro qué estructura o relación se interrumpe, por lo que mantener todos esos factores intactos permite todos los análisis dentro de una sola preparación.El error más común es tratar de evitar dañar el epitelio al no diseccionar lo suficientemente cerca de la parte inferior del epitelio. Es imperativo eliminar la mayor cantidad posible de tejido subyacente antes de congelar el tejido en el molde de tejido. También es importante asegurarse de que el epitelio se coloque plano en el fondo del molde de tejido.Comience descongelando y enjuagando la lengua en un tampón de fosfato molar 0.1. Luego coloque 1/2 de la lengua anterior que contiene las papilas fungiformes en un portaobjetos de vidrio bajo un microscopio de disección. Use pinzas romas y tijeras de disección para extirpar el músculo y mantener el tejido abierto a medida que el epitelio lingual se curva, asegurando una orientación plana del tejido al mantener las cuchillas de las tijeras de disección gruesas paralelas al epitelio.Deseche el epitelio ventral no queratinizado de la lengua, ya que no contiene papilas gustativas. Luego use tijeras de disección finas para una disección más cercana a la parte inferior del epitelio queratinizado. Use fórceps contundentes para colocar un pedazo de epitelio en un molde de tejido y asegúrese de que quede plano.Luego agregue una gota de compuesto de temperatura de corte óptima, o OCT, al tejido. Coloque el molde de tejido sobre una base de metal previamente enfriada debajo del endoscopio de disección, luego continúe golpeando el tejido ligeramente con las pinzas hasta que la OCT se haya congelado, asegurando que el tejido se congele lo más plano posible. Una vez que el OCT se haya congelado, agregue rápidamente OCT adicional y coloque el molde en un vaso de precipitados de 2-metilbutano enfriado hasta que se congele.Monte el molde OCT en el criostato y córtelo en secciones de 20 micras. Recoja cada sección y visualícela bajo el microscopio de luz para evaluar su proximidad a la base del epitelio. Después de afeitar el tejido de la parte inferior del epitelio, descongele el epitelio y enjuáguelo dos veces en PB molar 0.1 en una coctelera.Corte el paladar duro anterior a la unión del paladar blando y duro, luego separe el paladar blando del tejido subyacente, asegurándose de que se corten los fragmentos de hueso restantes y eliminando el músculo y el tejido conectivo adicionales. Sostenga el paladar con pinzas romas y retire las glándulas restantes y pierda el tejido conectivo raspándolas suavemente con una cuchilla de afeitar. Las papilas gustativas enteras y toda la inervación de las papilas gustativas en ratones Phox2b-Cre TdTomato se etiquetaron tiñendo el epitelio lingual con anticuerpos para DsRed y queratina ocho.Se midió el volumen de las papilas gustativas y no reveló correlaciones entre los volúmenes de las papilas gustativas y los volúmenes de inervación en las regiones de medición fungiformes o circunvaladas. La administración de una dosis baja de tamoxifeno en ratones TrkB CreER TdTomato causa la recombinación de genes y el etiquetado de un pequeño número de neuronas. Aquí se muestra una papila gustativa de montaje entero teñida con marcadores celulares transductores del gusto anhidrasa carbónica cuatro y fosfolipasa C beta dos.Esta papila gustativa tiene dos cenadores terminales etiquetados, que se muestran con la papila gustativa eliminada después de reconstruir las fibras. El uso de software de imágenes basado en píxeles celulares para determinar la proximidad más cercana entre las fibras nerviosas y las células transductoras de sabor reveló que de 19 células transductoras de sabor, el cenador terminal azul estaba dentro de los 200 nanómetros de la anhidrasa carbónica azul claro cuatro más células. El cenador terminal asociado con el trazado verde se muestra en magenta y está a menos de 200 nanómetros de las cuatro células más de anhidrasa carbónica azul claro y oscuro.La tinción de queratina ocho de montura entera y 5-etinil-2'desoxiuridina o EdU de papilas gustativas fungiformes reveló que las células marcadas con EdU estaban presentes tanto dentro como fuera de las papilas gustativas. Los núcleos magenta y púrpura se observan fuera del borde de queratina ocho más de la papila gustativa. Las células amarillas, verde azulado y azulado estaban dentro de la papila gustativa.Al intentar este protocolo, los pasos de disección y congelación de tejidos son fundamentales. Estos métodos de disección de tejidos pueden ser seguidos por la tinción de una variedad de células y estructuras para analizar las relaciones tanto dentro de la papila gustativa como fuera de la papila gustativa, pero dentro de la papila. Este es el primer análisis de cenadores de sabor completos dentro de la papila gustativa, así como sus relaciones con las células transductoras del gusto.Preservar y teñir varios de estos elementos en una sola preparación amplía las posibilidades de análisis y refina las mediciones que son posibles.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

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Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

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Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

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