Name: a rat model of ecohiv brain infection
Uploaded: 2021-01-21T14:30:00
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Ce travail a été financé par les subventions des NIH HD043680, MH106392, DA013137 et NS100624.

Tous les protocoles relatifs aux animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de la Caroline du Sud (numéro d’assurance fédéral : D16-00028). Six rats F344/N mâles adultes ont été logés dans un environnement contrôlé sous un cycle 12/12 clair: sombre avec accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Tous les animaux ont été pris en charge en utilisant les lignes directrices établies par les National Institutes of Health dans le...

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	<li>Illenberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Infection+and+Neurocognitive+Disorders+in+the+Context+of+Chronic+Drug+Abuse:+Evidence+for+Divergent+Findings+Dependent+upon+Prior+Drug+History.">HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).</li><li>Joseph, S. B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+HIV-1+entry+phenotypes+as+a+guide+to+changing+target+cells.">The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).</li><li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection,+antiviral+immune+responses,+and+neuroinvasiveness.">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li><li>Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+murine+ecotropic+retrovirus+receptor+gene+encodes+a+multiple+membrane-spanning+protein+and+confers+susceptibility+to+virus+infection.">A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection.</a> Cell. 57, 659-666 (1989).</li><li>Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+mice.">HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).</li><li>Gu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EcoHIV+infection+of+mice+establishes+latent+viral+reservoirs+in+T+cells+and+active+viral+reservoirs+in+macrophages+that+are+sufficient+for+induction+of+neurocognitive+impairment.">EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment.</a> PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061 (2018).</li><li>Ellenbroek, B., Youn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+in+neuroscience+research:+is+it+a+rat+race.">Rodent models in neuroscience research: is it a rat race.</a> Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).</li><li>Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+apparatus+and+method+for+drug+reinforcement.">Novel apparatus and method for drug reinforcement.</a> Journal of Visualized Experiments. (42), e1998 (2010).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry.">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7869 (2018).</li><li>McGaughy, J., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+vigilance+in+rats:+task+validation+and+effects+of+age,+amphetamine,+and+benzodiazepine+receptor+ligands.">Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands.</a> Psychopharmacology. 117 (3), 340-357 (1995).</li><li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+filamentous+actin+(F-actin)+puncta+in+rat+cortical+neurons.">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).</li><li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Timing:+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era.">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Scientific Reports. 9 (1), 827 (2019).</li><li>McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Power+of+Interstimulus+Interval+for+the+Assessment+of+Temporal+Processing+in+Rodents.">The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e58659 (2019).</li><li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+Labeling+of+Pyramidal+Neurons+in+Brain+Slices+and+in+Primary+Cell+Culture.">Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).</li><li>Ko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+but+not+Astrocytes+Harbor+HIV+DNA+in+the+Brains+of+HIV-1-Infected+Aviremic+Individuals+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy.">Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).</li><li>Sopper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+simian+immunodeficiency+virus+infection+in+vitro+and+in+vivo+on+the+cytokine+production+of+isolated+microglia+and+peripheral+macrophages+from+rhesus+monkey.">The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey.</a> Virology. 220 (2), 320-329 (1996).</li><li>Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+infection+of+microglial+cells+in+a+reconstituted+humanized+mouse+model+and+identification+of+compounds+that+selectively+reverse+HIV+latency.">HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency.</a> Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).</li></ol>

Dans ce protocole, nous avons établi un modèle d’infection par le VIH induite par EcoHIV chez les rats. Plus précisément, nous avons décrit une injection stéréotaxique bilatérale d’EcoHIV dans le cortex qui a réussi à instituer l’infection active par le VIH dans le cerveau de rat 7 jours après l’injection. De plus, nous démontrons que l’infection à EcoHIV chez le rat pourrait être un bon système biologique pour étudier les aspects clés de la MAIN. Huit semaines après l’infection par le Virus...

Les systèmes biologiques ont amélioré notre compréhension des troubles neurocognitifs associés au VIH-1 (HAND) et de leurs mécanismes neuronaux sous-jacents2. La détermination du système biologique le plus approprié pour une étude donnée dépend souvent de la question d’intérêt2. La limitation de la gamme de modèles animaux hôtes remet en question les études sur le développement de la maladie du VIH-1. Pour étudier la réplication virale et la pathogenèse du VIH-1, Potash et coll.3 ont créé un modèle murin d’infection active par le VIH-1, remplaçant la région codante de la glycoprotéine de l’enveloppe de surface du VIH, gp120, par la MLV gp80 écotrope, ce qui a conduit à une réplication virale réussie chez la souris4. Après des injections dans les veines de la queue chez des souris chimériques séropositives (EcoHIV), de nombreuses caractéristiques ressemblant à celles des personnes séropositives du VIH-1 (p. ex. lymphocytes et macrophages infectés, ciblés pour les réponses immunitaires antivirales, et inflammation3,5,6).
Bien que les souris et les rats soient tous deux membres des Muridés, les différences fondamentales entre les espèces peuvent influencer leur aptitude à répondre à des questions expérimentales spécifiques7. Par conséquent, l’extension du modèle d’infection EcoHIV aux rats (couramment utilisé dans les études sur l’abus de drogues et les troubles neurocognitifs) serait avantageuse dans l’étude du neuroHIV. Par exemple, leur plus grande taille rend l’implantation de cathéter jugulaire pour les procédures d’auto-administration de médicaments plus pratique8. Des techniques d’auto-administration de médicaments chez le rat ont été utilisées pour évaluer la motivation dans le VIH-19. En outre, de nombreuses tâches neurocognitives / comportementales ont été initialement conçues pour les rats10. Ici, nous rapportons l’utilisation des injections stereotaxic d’EcoHIV chez les rats pour prolonger le modèle d’infection d’EcoHIV et offrir une occasion clé d’adresser de nouvelles questions liées à neuroHIV et à HAND.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30004CI</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatGelatin 75cm&#178; Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>354488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10013CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>637-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>drill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>22600028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>VCP422H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit</td>
			<td>Cell Biolabs, inc.</td>
			<td>VPK-107-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X Concentrator</td>
			<td>Takara</td>
			<td>PT4421-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereotaxic apparatus</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rat model of ecohiv brain infection

Il a été bien étudié que le modèle murin infecté par EcoHIV est d’une grande utilité dans l’étude des complications neurologiques associées au VIH. L’établissement du modèle de rat infecté par le VIH ecoHIV pour les études sur l’abus de drogues et les troubles neurocognitifs serait bénéfique dans l’étude des troubles neurocognitifs associés au VIH-1 et au VIH-1 . Dans la présente étude, nous démontrons la création réussie d’un modèle de rat d’infection active par le VIH à l’aide du VIH chimérique (EcoHIV). Tout d’abord, la construction lentivirale d’EcoHIV a été emballée dans des cellules cultivées de 293 FT pendant 48 heures. Ensuite, le milieu conditionnel a été concentré et titré. Ensuite, nous avons effectué des injections stéréotaxiques bilatérales de l’EcoHIV-EGFP dans le tissu cérébral du rat F344/N. Une semaine après l’infection, des signaux de fluorescence EGFP ont été détectés dans le tissu cérébral infecté, indiquant que EcoHIV induit avec succès une infection active par le VIH chez les rats. En outre, immunostaining pour le marqueur microglial de cellules, Iba1, a été exécuté. Les résultats ont indiqué que la microglie était le type prédominant de cellules hébergeant EcoHIV. En outre, les rats d’EcoHIV ont montré des changements du traitement temporel, un mécanisme neurobehavioral fondamental potentiel de main aussi bien que le dysfonctionnement synaptique huit semaines après infection. Collectivement, la présente étude étend le modèle EcoHIV de l’infection par le VIH-1 au rat offrant un système biologique précieux pour étudier les réservoirs viraux du VIH-1 dans le cerveau ainsi que la MAIN et les comorbidités associées telles que l’abus de drogues.

Le milieu conditionné a été recueilli à partir du lentivirus des cellules 293FT infectées par EcoHIV-EGFP. Ensuite, il a été concentré et titré, puis injecté stéréotaxiquement dans le cerveau (région corticale) des rats F344/N. Sept jours après l’injection, des rats ont été sacrifiés et des images ont été prises des tranches coronales de cerveau s’étendant du bregma 5.64 millimètres au bregma -4.68 millimètres. Sur la figure 1A,il existe des signaux EcoHIV-EGFP sign...

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A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

Nous présentons ici un protocole visant à établir un nouveau modèle d’infection active par le VIH chez les rats à l’aide du VIH chimérique (EcoHIV), qui est essentiel pour améliorer notre compréhension des réservoirs viraux du VIH-1 dans le cerveau et offrir un système pour étudier les troubles neurocognitifs associés au VIH et les comorbidités associées (c.-à-d. l’abus de drogues).

Un modèle de rat d’infection cérébrale EcoHIV

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

En utilisant des rats, ce protocole peut être utilisé pour établir un nouveau modèle d’infection active par le VIH à l’aide du VIH chimérique. chez les rats, l’établissement du modèle d’infection EcoHIV pour les études sur l’abus de drogues et les troubles neurocognitifs pourrait être bénéfique pour l’étude des troubles neurocognitifs associés au VIH et au VIH-1. La démonstration de la procédure sera Hailong Li, un associé de recherche de mon laboratoire.Pour l’emballage du virus en 293 lymphocytes T, ensemencez cinq fois 10 à la cinquième 293 lymphocytes T par millilitre de DMEM complétés par 10% fbs dans chacun des deux flacons de 75 centimètres carrés enduits de gélatine et incuber les cellules à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cultures atteignent 50% de confluence. Le jour de la transfection, diluer 22,5 microlitres de réactif de transfection dans 750 microlitres de milieu par fiole dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et vortex la solution pendant trois secondes. Diluer 20 microgrammes de l’ADN plasmidique chimérique EcoHIV dans 750 microlitres de milieu dans un deuxième tube microcentrifuge de 1,5 millilitre par flacon avec un mélange complet.Mélanger l’ADN dilué avec le réactif de transfection dilué avec un mélange doux et incuber la solution résultante pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, ajouter chaque suspension virale à 10 millilitres de milieu DMEM d’avant-guerre et ajouter chaque solution complétée par le virus à une fiole de 293 lymphocytes T. Après deux jours de culture cellulaire, regrouper le surnageant des fioles dans un seul tube conique de 50 millilitres pour la centrifugation et transférer le surnageant clarifié dans un nouveau tube de 50 millilitres.Ajoutez huit millilitres de concentrateur Lenti-X au surnageant clarifié et mélangez avec une inversion douce. Après une incubation de deux jours à quatre degrés Celsius, centrifuger le mélange et retirer soigneusement le surnageant, puis ressusciter doucement le granulé avec 100 microlitres de PBS 100 millimolaires et utiliser un kit ELISA P24 pour titrer la concentration de virus. Pour l’injection EcoHIV-EGFP, après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, rasez les cheveux de la région du cerveau et stérilisez la peau exposée deux fois avec de l’éthanol à 70% et un gommage à base de chlorhexidine.Fixez le rat en position couchée dans un appareil stéréotaxique et faites une incision de cinq à six centimètres à travers la peau le long de la ligne médiane du cuir chevelu. Marquez une position de forage à 0,8 millimètre latéral et une position rostrale de 1,2 millimètre à bregma et percez un trou de 0,4 millimètre de diamètre à chaque position du crâne. Chargez 1,04 fois 10 jusqu’aux sixièmes unités de transduction par millilitre de solution de lentivirus EcoHIV titré dans une seringue d’injection de 10 microlitres et fixez la seringue à l’appareil stéréotaxique.Déplacez l’aiguille près de la surface d’un trou de forage et insérez l’aiguille de 2,5 millilitres dans le trou. Infuser un microlitre de solution virale à raison de 0,2 microlitres de virus par minute. Lorsque tout le virus a été injecté, laissez l’aiguille à l’intérieur de la zone d’injection pendant cinq minutes avant de rétracter lentement l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit à l’extérieur du crâne du rat.Fermez l’incision de la peau avec une suture de fil de soie 4-0 et stérilisez la solution avec de l’éthanol à 70%, puis placez le rat dans une chambre de récupération avec un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à la réamence. Une à huit semaines après la perfusion virale, après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, fixer le rat dans une position couchée sur le décubitus dorsal à l’intérieur d’une hotte et inciser la peau le long de la ligne médiane thoracique. Coupez le diaphragme pour ouvrir la cavité thoracique et insérez une aiguille de calibre 20 par 25 millimètres dans le ventricule gauche.Ouvrez immédiatement l’oreillette droite avec des ciseaux et parcourez 50 millilitres de PBS 100 millimolaires pré-refroidis à un débit de cinq millilitres par minute. Lorsque tout le PBS a été livré, perfuser avec 100 millilitres de paraformaldéhyde froid à 4%. Lorsque tout le fixateur a été délivré, retirez le cerveau du crâne et fixez le tissu pendant la nuit dans du paraformaldéhyde frais à 4%.Le lendemain matin, placez l’échantillon dans 40 millilitres de saccharose à 30% dans du PBS 100 millimolaires dans un tube de 50 millilitres pendant environ trois jours jusqu’à ce que le cerveau se dépose au fond du tube avant de casser le tissu cérébral dans du butanol méthylique pendant deux minutes à moins 80 degrés Celsius. Après la congélation, utilisez un cryostat à moins 20 degrés Celsius et un pinceau fin pour acquérir des sections coronales de 50 microns d’épaisseur. Lorsque toutes les sections ont été obtenues, couvrez les échantillons avec 300 microlitres de milieu anti-fondu et montez-les avec 22 lamures de 50 millilitres.Lorsque le milieu a séché, imagez les sections par microscopie confocale. Sept jours après l’injection de Lentivirus, les images coronales de tranche cérébrale de rat indiquent une présence significative des signaux EcoHIV-EGFP dans tout le tissu cérébral, en particulier dans le cortex et le gyrus dentelé hippocampal. Le double étiquetage avec et les sondes Iba1 et EcoHIV-EGFP fournit des preuves solides que la microglie est le type de cellule prédominant hébergeant l’expression d’EcoHIV dans le cerveau.Huit semaines après l’infection, les animaux injectés par EcoHIV présentent une relative insensibilité à la manipulation de l’intervalle interstimulus, comme en témoigne une fonction d’intervalle relativement plus plate par rapport aux témoins salins. En outre, les rats injectés ecoHIV montrent des changements profonds dans leur morphologie dendritique d’épine comme en témoigne une fréquence relative accrue des épines dendritiques plus courtes avec des diamètres accrus de tête et de cou par rapport aux animaux témoins. La concentration et le titrage du milieu de condition avant l’injection stéréotaxique sont essentiels pour assurer des résultats cohérents et reproductibles à travers les expériences.Cette injection stéréotaxique régionale spécifique d’EcoHIV fournit une infection efficace par le VIH dans le cerveau et produit des déficits de traitement temporel chez les rats. L’utilisation d’injections stéréotaxiques de VIH chez le rat pour étendre le modèle d’infection EcoHIV offre une occasion clé de répondre à de nouvelles questions liées au neuro-VIH à portée de main.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

Livraison de gènes au cerveau de rat postnatal par des non-ventriculaire injection Plasmide et électroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Recherche

Neurosciences

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

Chirurgie stéréotaxique pour lésion excitotoxique des zones spécifiques du cerveau chez le rat adulte

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Un modèle de Rat de doux Hypoperfusion intra-utérine avec sténose de le Microcoil

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Une évaluation In Vivo de la perturbation de la barrière hémato - encéphalique dans un modèle de Rat d’accident vasculaire cérébral ischémique

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Rat Model of Central Fatigue Using a Modified Multiple Platform Method

In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed as a water tank with narrow platforms on the bottom. The model rats were put into the tank and stood on the platforms for 14 h (18:00 - 8:00) per day for a consecutive 21 days, with a blank control group set for contrast. At the end of modeling, rats in the model group showed an obvious fatigued appearance. To assess the model, we performed several behavioral tests, including the open field test (OFT), the elevated plus maze (EPM) test, and the exhaustive swimming (ES) test. The results showed that anxiety, spatial cognition impairment, poor muscle performance, and declined voluntary activity presented in model rats confirm the diagnosis of&#160;central fatigue. Changes of the central neurotransmitters also verified the result. In conclusion, the model successfully simulated central fatigue, and future study with the model may help reveal the pathological mechanism of the disease.

Here, we present a protocol to introduce a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM).

Un Rat Model of Fatigue centrale utilisant une mis à jour le méthode de plate-forme Multiple

In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Une autre approche pour étudier les événements primaires dans la neurodégénérescence utilisant des coupes de cerveau de Rat Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

Une approche benchtop à l’ouverture spécifique de barrière de cerveau de sang d’emplacement utilisant l’ultrason focal dans un modèle de rat

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

Une méthode de nettoyage des tissus hydrophobes pour le tissu cérébral de rat

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Induction and Assessment of Levodopa-induced Dyskinesias in a Rat Model of Parkinson's Disease

Levodopa (L-DOPA) remains the gold-standard therapy used to treat Parkinson&#39;s disease (PD) motor symptoms. However, unwanted involuntary movements known as L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) develop with prolonged use of this dopamine precursor.&#160;It is estimated that the incidence of LIDs escalates to approximately 90% of individuals with PD within 10&#8211;15 years of treatment. Understanding the mechanisms of this malady and developing both novel and effective anti-dyskinesia treatments requires consistent and accurate modeling for pre-clinical testing of therapeutic interventions. A detailed method for reliable induction and comprehensive rating of LIDs following 6-OHDA-induced nigral lesioning in a rat model of PD is presented here. Dependable LID assessment in rats provides a powerful tool that can be readily utilized across laboratories to test emerging therapies focused on reducing or eliminating this common treatment-induced burden for individuals with PD.

Induction and Assessment of Levodopa-induced Dyskinesias in a Rat Model of Parkinson&#039;s Disease

This article describes methods to induce and evaluate levodopa-induced dyskinesias in a rat model of Parkinson&#39;s disease. The protocol offers detailed information regarding the intensity and frequency of a range of dyskinetic behaviors, both dystonic and hyperkinetic, providing a reliable tool to test treatments targeting this unmet medical need.

Induction et évaluation des dyskinésies induites par la lévodopa dans un modèle rat de la maladie de Parkinson

Levodopa (L-DOPA) remains the gold-standard therapy used to treat Parkinson&#39;s disease (PD) motor symptoms. However, unwanted involuntary movements ...

Validation de la réponse aux blessures et des évaluations comportementales dans un modèle de rat TCL

Rat Model of Closed-Head Mild Traumatic Injury and its Validation

Animal models are crucial for advancing our understanding of mild traumatic brain injury (mTBI) and guiding clinical research. To achieve meaningful insights, developing a stable and reproducible animal model is essential. In this study, we report a detailed description of a closed-head mTBI model and a representative validation method using Sprague-Dawley rats to verify the modeling effect. The model involves dropping a 550 g mass weight from a height of 100 cm directly onto the head of a rat on a destructible surface, followed by a 180-degree turn. To assess the injury, rats underwent a series of neurobehavioral assessments 10 min post-injury, including time of loss of consciousness, first seeking-behavior time, escape ability, and beam balance ability test. During the acute and subacute stages following the injury, behavioral tests were conducted to assess motor coordination ability (Beam task), anxiety (Open Field test), and learning and memory abilities (Morris Water Maze test). The closed-head mTBI model produced a consistent injury response with minimal mortality and replicated real-life situations. The validation method effectively verified the model development and ensured the stability and consistency of the model.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser la recherche sur les lésions cérébrales traumatiques - Un modèle à tête fermée pour une réplication précise et une évaluation rapide 

Here, we present a closed-head mild traumatic brain injury (mTBI) rat model and its validation exhibiting remarkable similarity to human mTBI concerning behavioral manifestations during the acute and subacute stages.

Modèle de rat de blessure traumatique légère à tête fermée et sa validation

Animal models are crucial for advancing our understanding of mild traumatic brain injury (mTBI) and guiding clinical research. To achieve meaningful ...