Name: a rat model of ecohiv brain infection
Uploaded: 2021-01-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rat Model of EcoHIV Brain Infection at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקי HD043680, MH106392, DA013137, ו NS100624.

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים באוניברסיטת דרום קרוליינה (מספר הבטחה פדרלית: D16-00028). שישה זכר בוגר F344 / N חולדה שוכנה בסביבה מבוקרת תחת אור 12/12: מחזור כהה עם גישה libitum המודעה למזון ומים. כל בעלי החיים טופלו באמצעות הנחיות שנקבעו על ידי המכונים הל?...

<ol>
	<li>Illenberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Infection+and+Neurocognitive+Disorders+in+the+Context+of+Chronic+Drug+Abuse:+Evidence+for+Divergent+Findings+Dependent+upon+Prior+Drug+History.">HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).</li><li>Joseph, S. B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+HIV-1+entry+phenotypes+as+a+guide+to+changing+target+cells.">The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).</li><li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection,+antiviral+immune+responses,+and+neuroinvasiveness.">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li><li>Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+murine+ecotropic+retrovirus+receptor+gene+encodes+a+multiple+membrane-spanning+protein+and+confers+susceptibility+to+virus+infection.">A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection.</a> Cell. 57, 659-666 (1989).</li><li>Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+mice.">HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).</li><li>Gu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EcoHIV+infection+of+mice+establishes+latent+viral+reservoirs+in+T+cells+and+active+viral+reservoirs+in+macrophages+that+are+sufficient+for+induction+of+neurocognitive+impairment.">EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment.</a> PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061 (2018).</li><li>Ellenbroek, B., Youn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+in+neuroscience+research:+is+it+a+rat+race.">Rodent models in neuroscience research: is it a rat race.</a> Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).</li><li>Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+apparatus+and+method+for+drug+reinforcement.">Novel apparatus and method for drug reinforcement.</a> Journal of Visualized Experiments. (42), e1998 (2010).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry.">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7869 (2018).</li><li>McGaughy, J., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+vigilance+in+rats:+task+validation+and+effects+of+age,+amphetamine,+and+benzodiazepine+receptor+ligands.">Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands.</a> Psychopharmacology. 117 (3), 340-357 (1995).</li><li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+filamentous+actin+(F-actin)+puncta+in+rat+cortical+neurons.">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).</li><li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Timing:+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era.">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Scientific Reports. 9 (1), 827 (2019).</li><li>McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Power+of+Interstimulus+Interval+for+the+Assessment+of+Temporal+Processing+in+Rodents.">The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e58659 (2019).</li><li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+Labeling+of+Pyramidal+Neurons+in+Brain+Slices+and+in+Primary+Cell+Culture.">Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).</li><li>Ko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+but+not+Astrocytes+Harbor+HIV+DNA+in+the+Brains+of+HIV-1-Infected+Aviremic+Individuals+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy.">Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).</li><li>Sopper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+simian+immunodeficiency+virus+infection+in+vitro+and+in+vivo+on+the+cytokine+production+of+isolated+microglia+and+peripheral+macrophages+from+rhesus+monkey.">The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey.</a> Virology. 220 (2), 320-329 (1996).</li><li>Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+infection+of+microglial+cells+in+a+reconstituted+humanized+mouse+model+and+identification+of+compounds+that+selectively+reverse+HIV+latency.">HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency.</a> Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).</li></ol>

בפרוטוקול זה, הקמנו מודל זיהום איידס הנגרמת על ידי EcoHIV בחולדות. באופן ספציפי, תיארנו הזרקה סטראוטקסית דו-צדדית של EcoHIV לתוך קליפת המוח אשר בהצלחה גרמה לזיהום HIV פעיל במוח החולדה 7 ימים לאחר הזרקה. פית'מור, אנו מראים כי זיהום EcoHIV בחולדות יכול להיות מערכת ביולוגית טובה ללמוד היבטים מרכזיים של HAN...

מערכות ביולוגיות שיפרו את ההבנה שלנו של הפרעות נוירוקוגניטיביות הקשורות HIV-1 (HAND) ואת המנגנונים העצביים הבסיסיים שלהם2. קביעת איזו מערכת ביולוגית מתאימה ביותר לכל מחקר נתון תלויה לעתים קרובות בשאלת הריבית2. המגבלה של מגוון המודלים המארחים של בעלי חיים מאתגרת מחקרים על התפתחות מחלת HIV-1. כדי לחקור HIV-1 שכפול ויראלי פתוגנזה, אשלג ואח'3 יצר מודל העכבר של זיהום פעיל HIV-1, החלפת אזור הקידוד של גליקופרוטאין מעטפת משטח HIV, gp120, עם gp80 MLV ecotropic, אשר הוביל שכפול ויראלי מוצלח בעכברים4. לאחר זריקות וריד הזנב בעכברים HIV כימרי (EcoHIV), מאפיינים רבים נצפו דומים לאלה של אנשים seropositive HIV-1 (למשל, לימפוציטים נגועים מקרופאגים, ממוקד לתגובות חיסוניות אנטי ויראליות, ודלקת3,5,6).
למרות עכברים וחולדות הם שניהם חברים של Muridae, הבדלים מינים בסיסיים עשויים להשפיע על התאמתם לשאלות ניסיוניות ספציפיות7. לכן, ההרחבה של מודל זיהום EcoHIV לחולדות (נפוץ במחקרים של שימוש בסמים והפרעות נוירוקוגניטיביות) יהיה יתרון במחקר של neuroHIV. לדוגמה, גודלם הגדול יותר הופך את השתלת הקטטר הצווארי להליכי ניהול עצמי של תרופות למעשית יותר8. טכניקות ניהול עצמי סמים בחולדות נוצלו כדי להעריך את המוטיבציה ב-HIV-1 9. יתר על כן, משימות נוירוקוגניטיביות / התנהגותיות רבות תוכננו בתחילה עבור חולדות10. כאן, אנו מדווחים על ניצול של זריקות סטראוטקסיות של EcoHIV בחולדות כדי להרחיב את מודל הזיהום EcoHIV ולאפשר הזדמנות מפתח כדי לענות על שאלות חדשות הקשורות neuroHIV ו HAND.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30004CI</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatGelatin 75cm&#178; Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>354488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10013CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>637-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>drill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>22600028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>VCP422H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit</td>
			<td>Cell Biolabs, inc.</td>
			<td>VPK-107-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X Concentrator</td>
			<td>Takara</td>
			<td>PT4421-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereotaxic apparatus</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rat model of ecohiv brain infection

נחקר היטב כי מודל העכבר הנגוע EcoHIV הוא בעל תועלת משמעותית בחקירת סיבוכים נוירולוגיים הקשורים ל- HIV. הקמת מודל עכברוש נגוע EcoHIV למחקרים של שימוש בסמים והפרעות נוירוקוגניטיביות, יהיה מועיל במחקר של neuroHIV ו- HIV-1 הקשורים הפרעות נוירוקוגניטיביות (HAND). במחקר הנוכחי, אנו מדגימים את היצירה המוצלחת של מודל חולדה של זיהום HIV פעיל באמצעות HIV כימרי (EcoHIV). ראשית, המבנה lentiviral של EcoHIV נארז בתאי FT 293 תרבותיים במשך 48 שעות. לאחר מכן, המדיום המותנה היה מרוכז וטריטר. לאחר מכן, ביצענו זריקות סטראוטקסיות דו-צדדיות של EcoHIV-EGFP לתוך רקמת מוח עכברוש F344/N. שבוע לאחר ההדבקה, אותות פלואורסצנטיים EGFP זוהו ברקמת המוח הנגועה, המציין כי EcoHIV בהצלחה גורם לזיהום HIV פעיל בחולדות. בנוסף, בוצעה חיסון עבור סמן התא המיקרוגליאלי, Iba1. התוצאות הצביעו על כך שמיקרוגליה היו סוג התא השולט ב-EcoHIV. יתר על כן, חולדות EcoHIV הציגו שינויים בעיבוד הטמפורלי, מנגנון נוירו-התנהגותי פוטנציאלי של HAND, כמו גם תפקוד סינפטי שמונה שבועות לאחר ההדבקה. באופן קולקטיבי, המחקר הנוכחי מרחיב את מודל EcoHIV של הידבקות ב- HIV-1 לחולדה המציעה מערכת ביולוגית בעלת ערך לחקר מאגרים נגיפיים HIV-1 במוח, כמו גם HAND ותחלואה נלווית כגון שימוש בסמים.

המדיום מותנה נאסף מ lentivirus של EcoHIV-EGFP נגוע 293FT תאים. לאחר מכן, הוא היה מרוכז ו titered, אז מוזרק באופן סטריאוטקסי לתוך המוח (אזור קליפת המוח) של חולדות F344/N. שבעה ימים לאחר ההזרקה, חולדות הוקרבו ותמונות נלקחו מפרוסות מוח קורונל החל bregma 5.64 מ"מ כדי bregma -4.68 מ"מ. באיור 1A, ישנם אותות EcoHIV-EGFP מ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Rat Model of EcoHIV Brain Infection at JoVE.com

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להקים מודל עכברוש חדש של זיהום HIV פעיל באמצעות HIV כימרי (EcoHIV), שהוא קריטי לשיפור ההבנה שלנו של מאגרים נגיפיים HIV-1 במוח ומציע מערכת לחקור הפרעות נוירוקוגניטיביות הקשורות ל- HIV ותחלואה נלווית (כלומר, שימוש בסמים).

מודל עכברוש של זיהום מוחי EcoHIV

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

באמצעות חולדות, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להקים מודל חדש של זיהום HIV פעיל באמצעות HIV כימרי. עם חולדות, הקמת מודל זיהום EcoHIV למחקרים של שימוש בסמים והפרעות נוירוקוגניטיביות יכול להיות מועיל לחקר נוירו HIV ו- HIV-1 הקשורים הפרעות נוירוקוגניטיביות. הליך ההדרה יהיה Hailong לי, עמית מחקר מהמעבדה שלי.עבור אריזה של הנגיף לתוך 293 תאי T, זרע חמש פעמים 10 כדי החמישי 293 תאי T למיליליטר של DMEM בתוספת 10%FBS לתוך כל אחד משני צלויי ג'לטין מצופה 75 ס"מ רבועים דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עד התרבויות להגיע 50% קונפלורציה. ביום של transfection, לדלל 22.5 microliters של reagent transfection ב 750 microliters של בינוני לכל בקבוק בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ומערבולת הפתרון במשך שלוש שניות. לדלל 20 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד EcoHIV כימרי ב 750 microliters של מדיום בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר השני לכל בקבוק עם ערבוב יסודי.ערבבו את הדנ"א המדולל עם ריאגנט transfection מדולל עם ערבוב עדין לדגר את הפתרון וכתוצאה מכך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, להוסיף כל השעיה וירוס 10 מיליליטר של בינוני DMEM לפני המלחמה ולהוסיף כל פתרון תוספת וירוס בקבוק אחד של 293 T-תאים. לאחר יומיים של תרבות תאים, בריכה supernatant מן הבקבוקים בצינור חרוט אחד 50 מיליליטר עבור צנטריפוגה ולהעביר את supernatant הבהיר לצינור חדש 50 מיליליטר.הוסיפו שמונה מיליליטרים של רכז לנטי-X לסופרנאטנט המובהר וערבבו עם היפוך עדין. לאחר דגירה של יומיים בארבע מעלות צלזיוס, צנטריפוגה את התערובת בזהירות להסיר את supernatant, ולאחר מכן בעדינות resuspend גלולה עם 100 microliters של 100 PBS מילימולארי ולהשתמש בערכת אליזה P24 כדי titer ריכוז הנגיף. להזרקת EcoHIV-EGFP, לאחר אישור חוסר תגובה לרפלקס הדוושות, גילחו את השיער מאזור המוח ועקרו את העור החשוף פעמיים עם 70% אתנול וקרצוף מבוסס כלורקסידין.לאבטח את החולדה בתנוחה נוטה במנגנון סטריאוטאקסי ולעשות חתך של חמישה עד שישה סנטימטרים דרך העור לאורך קו האמצע הקרקפת. סמן תנוחת קידוח אחת ב-0.8 מ"מ לרוחב ואחת של 1.2 מ"מ לרגמה וקדח חור בקוטר 0.4 מ"מ בכל מיקום גולגולת. לטעון 1.04 פעמים 10 ליחידות התמרה השישית לכל מיליליטר של פתרון EcoHIV Lentivirus מרופט לתוך מזרק הזרקת 10 מיקרוליטר ולאבטח את המזרק למנגנון סטריאוטאקסי.להזיז את המחט קרוב לפני השטח של חור קידוח אחד ולהכניס את המחט 2.5 מיליליטר לתוך החור. להחדיר מיקרוליטר אחד של פתרון וירוס בקצב של 0.2 microliters של וירוס לדקה. כאשר כל הנגיף הוזרק, להשאיר את המחט בתוך אזור ההזרקה במשך חמש דקות לפני לאט חוזר המחט עד שהוא מחוץ לגולגולת החולדה.סגור את החתך בעור עם תפר חוט משי 4-0 ועקר את הפתרון עם 70% אתנול, ולאחר מכן למקם את החולדה בתא התאוששות עם כרית חימום עם ניטור עד שיקום. שבוע עד שמונה שבועות לאחר עירוי ויראלי, לאחר אישור חוסר תגובה לרפלקס הדוושה, לתקן את החולדה בתנוחה סופית בתוך מכסה המנוע אדים ולהסית את העור לאורך קו האמצע של בית החזה. חותכים את הסרעפת כדי לפתוח את חלל בית החזה ולהכניס 20 מד על ידי מחט 25 מילימטר לתוך החדר השמאלי.מיד לפתוח את האטריום הנכון עם מספריים לחלחל 50 מיליליטר של PBS מצונן מראש 100 מילימולאר בקצב זרימה של חמישה מיליליטר לדקה. כאשר כל PBS נמסר, לחלחל עם 100 מיליליטר של קר 4% paraformaldehyde. כאשר כל התיקון נמסר, להסיר את המוח מהגולגולת ולתקן את הרקמה לילה טרי 4% paraformaldehyde.למחרת בבוקר, למקם את המדגם ב 40 מיליליטר של 30% סוכרוז ב PBS 100 מילימולאר בצינור 50 מיליליטר במשך כשלושה ימים עד המוח מתיישב לתחתית הצינור לפני הצמד הקפאת רקמת המוח במתיל butanol במשך שתי דקות במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר ההקפאה, יש להשתמש בהקפאה של מינוס 20 מעלות צלזיוס ובמברשת צבע עדינה כדי לרכוש 50 חלקי קורונל בעובי מיקרון. כאשר כל החלקים הושגו, לכסות את הדגימות עם 300 microliters של מדיום נגד עמעום ולהרכיב אותם עם 22 50 מיליליטר coverlips.כאשר המדיום התייבש, צלם את החלקים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שבעה ימים לאחר הזרקת Lentivirus, תמונות פרוסת מוח coronal חולדה לחשוף נוכחות משמעותית של אותות EcoHIV-EGFP בכל רקמת המוח, במיוחד בתוך קליפת המוח ואת gyrus שקע ההיפוקמפוס. שתי תיוג עם Iba1 ו EcoHIV-EGFP בדיקות לספק ראיות חזקות כי microglia הם סוג התא השולט מחסה ביטוי EcoHIV במוח.שמונה שבועות לאחר ההדבקה, EcoHIV הזריק בעלי חיים להפגין חוסר רגישות יחסית למניפולציה של מרווח interstimulus כפי שמעידים על ידי פונקציית מרווח מחמיא יחסית בהשוואה לבקרות מלוחים. בנוסף, חולדות מוזרקות EcoHIV מציגות שינויים עמוקים במורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי שלהן, כפי שמעידות תדירות יחסית מוגברת של קוצים דנדריטיים קצרים יותר עם קטרים מוגברים של הראש והצוואר ביחס לבעלי חיים שולטים. הריכוז והטיטרטינג של מדיום המצב לפני הזרקה סטראוטקסית הוא קריטי כדי להבטיח את התוצאות עקביות שכפול על פני ניסויים.הזרקה סטראוטקסית אזורית ספציפית זו של EcoHIV מספקת זיהום HIV יעיל בתוך המוח ומייצרת ליקויי עיבוד זמניים בחולדות. הניצול של זריקות HIV סטראוטקסי בחולדות כדי להרחיב את מודל זיהום EcoHIV מאפשר הזדמנות מפתח לטיפול בשאלות חדשניות הקשורות נוירו HIV בהישג יד.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

ג&#39;ין משלוח מוח החולדה אחרי לידה על ידי הזרקת Non-חדרית electroporation פלסמיד ו

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

ניתוח Stereotaxic על הנגע Excitotoxic של אזורי מוח ספציפיים עכברוש למבוגרים בלבד

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

מודל עכברוש של זילוח תוך רחמי קלה עם היצרות Microcoil

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

הערכה In Vivo של מחסום הדם - מוח שיבוש במודל של עכברים של שבץ איסכמי

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Rat Model of Central Fatigue Using a Modified Multiple Platform Method

In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed as a water tank with narrow platforms on the bottom. The model rats were put into the tank and stood on the platforms for 14 h (18:00 - 8:00) per day for a consecutive 21 days, with a blank control group set for contrast. At the end of modeling, rats in the model group showed an obvious fatigued appearance. To assess the model, we performed several behavioral tests, including the open field test (OFT), the elevated plus maze (EPM) test, and the exhaustive swimming (ES) test. The results showed that anxiety, spatial cognition impairment, poor muscle performance, and declined voluntary activity presented in model rats confirm the diagnosis of&#160;central fatigue. Changes of the central neurotransmitters also verified the result. In conclusion, the model successfully simulated central fatigue, and future study with the model may help reveal the pathological mechanism of the disease.

Here, we present a protocol to introduce a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM).

חולדה מודל מרכזי עייפות בעזרת ששונה שיטת פלטפורמה מרובים

In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

גישה חלופית ללמוד העיקרי אירועים הקשורים ניוון מוחיים לשעבר Vivo עכברוש המוח בפרוסות

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

גישה ספסל למיקום ספציפי מחסום הדם מוח פתיחת באמצעות אולטרסאונד ממוקד במודל עכברוש

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Induction and Assessment of Levodopa-induced Dyskinesias in a Rat Model of Parkinson's Disease

Levodopa (L-DOPA) remains the gold-standard therapy used to treat Parkinson&#39;s disease (PD) motor symptoms. However, unwanted involuntary movements known as L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) develop with prolonged use of this dopamine precursor.&#160;It is estimated that the incidence of LIDs escalates to approximately 90% of individuals with PD within 10&#8211;15 years of treatment. Understanding the mechanisms of this malady and developing both novel and effective anti-dyskinesia treatments requires consistent and accurate modeling for pre-clinical testing of therapeutic interventions. A detailed method for reliable induction and comprehensive rating of LIDs following 6-OHDA-induced nigral lesioning in a rat model of PD is presented here. Dependable LID assessment in rats provides a powerful tool that can be readily utilized across laboratories to test emerging therapies focused on reducing or eliminating this common treatment-induced burden for individuals with PD.

Induction and Assessment of Levodopa-induced Dyskinesias in a Rat Model of Parkinson&#039;s Disease

This article describes methods to induce and evaluate levodopa-induced dyskinesias in a rat model of Parkinson&#39;s disease. The protocol offers detailed information regarding the intensity and frequency of a range of dyskinetic behaviors, both dystonic and hyperkinetic, providing a reliable tool to test treatments targeting this unmet medical need.

אינדוקציה והערכה של דיסקינזיות הנגרמות על ידי לבודופה במודל חולדות של מחלת פרקינסון

Levodopa (L-DOPA) remains the gold-standard therapy used to treat Parkinson&#39;s disease (PD) motor symptoms. However, unwanted involuntary movements ...

אימות תגובה לפציעה והערכות התנהגותיות במודל של חולדות mTBI

Rat Model of Closed-Head Mild Traumatic Injury and its Validation

Animal models are crucial for advancing our understanding of mild traumatic brain injury (mTBI) and guiding clinical research. To achieve meaningful insights, developing a stable and reproducible animal model is essential. In this study, we report a detailed description of a closed-head mTBI model and a representative validation method using Sprague-Dawley rats to verify the modeling effect. The model involves dropping a 550 g mass weight from a height of 100 cm directly onto the head of a rat on a destructible surface, followed by a 180-degree turn. To assess the injury, rats underwent a series of neurobehavioral assessments 10 min post-injury, including time of loss of consciousness, first seeking-behavior time, escape ability, and beam balance ability test. During the acute and subacute stages following the injury, behavioral tests were conducted to assess motor coordination ability (Beam task), anxiety (Open Field test), and learning and memory abilities (Morris Water Maze test). The closed-head mTBI model produced a consistent injury response with minimal mortality and replicated real-life situations. The validation method effectively verified the model development and ensured the stability and consistency of the model.

מחבר Spotlight: Advanceancing Traumatic Brain Injury Research - מודל ראש סגור לשכפול מדויק והערכה מהירה 

Here, we present a closed-head mild traumatic brain injury (mTBI) rat model and its validation exhibiting remarkable similarity to human mTBI concerning behavioral manifestations during the acute and subacute stages.

מודל חולדה של פגיעה טראומטית קלה בראש סגור ותיקוף שלה

Animal models are crucial for advancing our understanding of mild traumatic brain injury (mTBI) and guiding clinical research. To achieve meaningful ...