Som vores protokol viser, kan CRISPR CasRx-teknologier bruges til at opnå allestedsnærværende og vævsspecifikke genudskriftsreduktioner i bananfluer. Vores teknik tilbyder en startpakke til alle, der er interesseret i at bruge CRISPR-baseret genudskriftsreduktion i bananfluer, samtidig med at de er kompatible med yderligere tilpasning og optimering. For at oprette en allestedsnærværende in vivo RNA målretning ved hjælp af en to komponent CasRx system, indsamle 10 jomfru voksne kvindelige fluer fra homozygot gRNA linje af interesse og fem voksne mandlige fluer fra afbalanceret heterozygot Ubiq CasRx CurlyO.
Placer forældrenes fluer i et hætteglas suppleret med 100 mikrogram tørt gærpulver og bag hætteglassene i 48 timer ved 26 grader Celsius. Overhold hætteglass hver dag for at se, om nogen nye voksne afkom er opstået fra pubic af F1 generation og bedøve nogen af voksne med kuldioxid i 10 sekunder. Når fluerne bliver immobile tømme hætteglasset på en flyve pad tilsluttet kuldioxid tanken med kontinuerlig kuldioxid og bruge et farvekamera tilsluttet en fluorescerende stereo mikroskop til at score og billede fænotyper af fluerne.
Tæl derefter antallet af afkom med forskellige fænotyper, ifølge det fluorescerende signaludtryk. Baseret på Mendelian genetik, 50% af afkommet forventes at udtrykke den målrettede RNA. Bemærk, at Toksiciteten af Ubiq CasRx-systemet kan reducere forholdet mellem målrettet RNA, der udtrykker afkom, til mindre end 50% For at oprette en allestedsnærværende in vivo eksogen RNA-målretning ved hjælp af et trekomponent CasRx-system, indsamle otte til 10 Jomfru voksne kvindelige fluer fra en dobbelt luciferase, der udtrykker linje og fire til fem voksne mandlige fluer fra den afbalancerede heterozygode Ubiq CasRx Curly plus TM6, STB linje, der udviser hvide øjne, krøllede vinger, og ds rød fluorescens samtidigt.
Placer forældrenes trin et kryds ved i et hætteglas suppleret med 100 mikrogram tørgærpulver og bag dette kryds i 48 timer ved 26 grader Celsius. I slutningen af inkubationen fjernes alle forældrefluerne fra hvert hætteglas og returnerer hætteglassene til 26 grader Celsius-inkubatoren i mindst 14 dage. I løbet af 14 dage, som tidligere nævnt indsamle otte til 10 kvindelige jomfruer fra homozygot firefly luciferase rettet mod gRNA linje tre gange.
Overhold trin et kryds hætteglas hver dag for at se, om nogen nye voksne afkom er opstået fra puppen, bedøvende med kuldioxid for at tillade indsamling af fire til fem mandlige fluer udtrykker både Ubiq CasRx og den dobbelte Luciferase reporter som tilgængelig. Placer fluerne i et nyt hætteglas med 10 Jomfruhunner fra frugtfluen luciferase rettet mod gRNA-linjen, og placer disse trin to kors ved 26 grader Celsius i 48 timer. Saml yderligere fem en dag gamle mænd, der udtrykker både Ubiq CasRx og dobbelt luciferase reporter fra trin et kryds hætteglas og inkubere fluerne i to til fire dage alene ved 26 grader Celsius, før du overfører dem til en 1,5 milliliter centrifuge for minus 80 grader Celsius opbevaring.
I slutningen af inkubationen skal du fjerne alle forældre hætteglas fra hvert af trin to kryds hætteglas. Og returnere hætteglassene til 26 grader Celsius inkubatoren i mindst 20 dage. Overhold trin to kryds hætteglas hver dag for at se, om nogen nye voksne afkom er opstået fra pubic, bedøvende fluer med kuldioxid, som de bliver tilgængelige, og scoring og billeddannelse deres fænotyper som demonstreret.
Mendelian genetik tyder på, at hvis alle fluer er levedygtige, 25% af afkom bør udtrykke den målrettede RNA. For at udføre en luciferase assay, generere den tredobbelte trans heterozygot fluer samt kontrol fluer som demonstreret. Indsamling af hanen flyver ved fødslen, og ældes dem indtil tre dage gammel.
Overfør de tre dage gamle fluer i 1,5 milliliter centrifugerør, og lys dem ved hjælp af en buffer i luciferase lysis buffer fra et kommercielt tilgængeligt luciferase assay kit. Derefter bruge fem mikroliter af lysed væv fra hver prøve og luminometer til at måle både frugt fluer og løb Luciferase aktivitet, i henhold til standard luciferase assay protokoller. F1, trans heterozygot CasRx, har betydeligt lavere overlevelsesrater i forhold til trans heterozygot dCasRx fluer.
Bekræfter toksiciteten af Ubiq CasRx-systemet af de tre mål gener, U6 gRNA Y heterozygode fluer er ikke-levedygtige og ikke vokser ud over den anden instar larve fase. De overlevende Ubq CasRx og U6 gRNA W heterozygoe fluer, demonstrerer en særskilt fuldt penetrant bred eyed fænotype. Derudover observeres der også en betydelig reduktion af målgenudskrifter for tre målgener.
Der observeres også tegn på off target-aktivitet forårsaget af CasRx, når differentierede udtryksudskrifter mellem prøver fra CasRx, der udtrykker fluer, og prøver fra dCasRx, der udtrykker fluer, sammenlignes. I de to trin krydse, kun kombinationen af alle tre trans gener resulterer i en 100% dødelighed. Når væv specifikke RNA målretning ved hjælp af en tre komponent CasRx system design er ansat, niveauet af toksicitet reduceres, når den samlede CasRx udtryk sænkes ved hjælp af UAST promotor i forhold til Ubiq promotor.
Det er vigtigt at oprette den genetiske proces korrekt ved hjælp af fluer af korrekt køn og korrekte fænotyper.