Alomtegenwoordige en weefselspecifieke RNA-targeting in Drosophila Melanogaster met CRISPR/CasRx

Zoals ons protocol laat zien, kunnen CRISPR CasRx-technologieën worden gebruikt om alomtegenwoordige en weefselspecifieke gentranscriptreducties in fruitvliegen te bereiken. Onze techniek biedt een startpakket voor iedereen die geïnteresseerd is in het gebruik van CRISPR-gebaseerde gentranscriptreductie in fruitvliegen, terwijl het compatibel is met verdere aanpassing en optimalisatie. Om een alomtegenwoordige in vivo RNA-targeting op te zetten met behulp van een tweecomponenten CasRx-systeem, verzamelt u 10 maagdelijke volwassen vrouwelijke vliegen uit de homozygote gRNA-lijn van belang en vijf volwassen mannelijke vliegen uit de uitgebalanceerde heterozygote Ubiq CasRx CurlyO.

Plaats de ouderlijke vliegen in een injectieflacon aangevuld met 100 microgram droog gistpoeder en laat de injectieflacons gedurende 48 uur achter bij 26 graden Celsius. Observeer de flesjes elke dag om te zien of er nieuwe volwassen nakomelingen uit het schaamgebied van de F1-generatie zijn gekomen en verdoof een van de volwassenen met koolstofdioxide gedurende 10 seconden. Zodra de vliegen onbeweeglijk worden, leegt u de flacon op een vliegenkussen dat is verbonden met de kooldioxidetank met continu koolstofdioxide en gebruikt u een kleurencamera die is aangesloten op een fluorescerende stereomicroscoop om de fenotypen van de vliegen te scoren en in beeld te brengen.

Tel vervolgens de aantallen nakomelingen met verschillende fenotypen, volgens de fluorescerende signaalexpressie. Op basis van mendeliaanse genetica wordt verwacht dat 50% van het nageslacht het beoogde RNA tot expressie brengt. Merk op dat toxiciteit van het Ubiq CasRx-systeem de verhouding van gericht RNA dat nakomelingen tot expressie brengt kan verminderen tot minder dan 50% Om een alomtegenwoordige in vivo exogene RNA-targeting op te zetten met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem, verzamel acht tot 10 Maagdelijke volwassen vrouwelijke vliegen uit een dubbele luciferase-expressielijn en vier tot vijf volwassen mannelijke vliegen uit de uitgebalanceerde heterozygote Ubiq CasRx Curly plus TM6, STB-lijn die tegelijkertijd witte ogen, krullende vleugels en ds-rode fluorescentie vertoont.

Plaats de ouderlijke stap één cross-by in een flacon aangevuld met 100 microgram droog gistpoeder en laat dit kruis gedurende 48 uur op 26 graden Celsius. Verwijder aan het einde van de incubatie alle ouderlijke vliegen uit elke injectieflacon en breng de injectieflacons gedurende ten minste 14 dagen terug naar de couveuse van 26 graden Celsius. In de loop van 14 dagen verzamelen, zoals eerder vermeld, acht tot 10 vrouwelijke maagden uit de homozygote vuurvlieg luciferase gericht op gRNA-lijn drie keer.

Observeer de stap één kruisflacons elke dag om te zien of er nieuwe volwassen nakomelingen uit de poppen zijn gekomen, verdovend met koolstofdioxide om de verzameling van vier tot vijf mannelijke vliegen mogelijk te maken die zowel de Ubiq CasRx als de dubbele Luciferase-verslaggever tot expressie brengen, indien beschikbaar. Plaats de vliegen in een nieuwe flacon met 10 Maagdelijke vrouwtjes van de fruitvlieg luciferase gericht op gRNA-lijn en plaats deze stap twee kruisen op 26 graden Celsius gedurende 48 uur. Verzamel nog eens vijf eendagsvliegjes die zowel de Ubiq CasRx als de dual luciferase reporter uit de stap één kruisflacons uitdrukken en incubeer de vliegen gedurende twee tot vier dagen alleen bij 26 graden Celsius voordat ze worden overgebracht naar een centrifuge van 1,5 milliliter voor opslag van min 80 graden Celsius.

Verwijder aan het einde van de incubatie alle injectieflacons van de ouderlijke injectieflacons uit elk van de stap twee kruisflacons. En breng de flacons gedurende ten minste 20 dagen terug naar de incubator van 26 graden Celsius. Observeer de stap twee kruisflacons elke dag om te zien of er nieuwe volwassen nakomelingen uit de schaamstreek zijn gekomen, verdoving de vliegen met koolstofdioxide zodra ze beschikbaar komen en scoor en beeld hun fenotypen zoals aangetoond.

Mendeliaanse genetica suggereert dat, als alle vliegen levensvatbaar zijn, 25% van het nageslacht het beoogde RNA tot expressie zou moeten brengen. Om een luciferase-assay uit te voeren, genereert u de drievoudige trans heterozygote vliegen en de controlevliegen zoals gedemonstreerd. Het verzamelen van de mannelijke vliegen bij de geboorte en ze laten rijpen tot drie dagen oud.

Breng de drie dagen oude vliegen over in centrifugebuizen van 1,5 milliliter en lyseer ze met behulp van een buffer in de luciferaselysisbuffer uit een in de handel verkrijgbare luciferase-testkit. Gebruik vervolgens vijf microliter gelyseerd weefsel van elk monster en elke luminometer om zowel de fruitvliegjes als de uitgevoerde Luciferase-activiteit te meten, volgens standaard luciferase-testprotocollen. F1, trans heterozygote CasRx, hebben significant lagere overlevingskansen in vergelijking met trans heterozygote dCasRx-vliegen.

Om de toxiciteit van het Ubiq CasRx-systeem van de drie doelgenen te bevestigen, zijn de U6 gRNA Y heterozygote vliegen niet levensvatbaar en groeien ze niet verder dan het tweede instar larvale stadium. De overlevende Ubq CasRx en U6 gRNA W heterozygote vliegen, vertonen een duidelijk volledig penetrant fenotype met grote ogen. Daarnaast wordt ook een significante vermindering van doelgentranscripten voor drie doelgenen waargenomen.

Bewijs van off-target activiteit geïnduceerd door CasRx wordt ook waargenomen wanneer differentiële uitgedrukte transcripties tussen monsters van CasRx die vliegen tot expressie brengen en monsters van dCasRx-tot expressie brengende vliegen worden vergeleken. In de kruising in twee stappen resulteert alleen de combinatie van alle drie de transgenen in een 100% letaliteit. Wanneer weefselspecifieke RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeemontwerp wordt gebruikt, wordt het toxiciteitsniveau verlaagd wanneer de totale CasRx-expressie wordt verlaagd met behulp van de UAST-promotor in vergelijking met die van de Ubiq-promotor.

Het is belangrijk om het genetische proces correct in te stellen met behulp van vliegen van het juiste geslacht en correcte fenotypen.