כפי שהפרוטוקול שלנו מראה, ניתן להשתמש בטכנולוגיות CRISPR CasRx כדי להשיג הפחתות תעתיק גנים בכל מקום ורקמות ספציפיות לזבובי פירות. הטכניקה שלנו מציעה חבילת מנות ראשונות לכל מי שמעוניין להשתמש בהפחתת תמליל גנים מבוססי CRISPR בזבובי פירות תוך התאמה להתאמה אישית ואופטימיזציה נוספות. כדי להגדיר מיקוד RNA בכל מקום ב- vivo באמצעות מערכת CasRx שני רכיבים, לאסוף 10 זבובים נקבה בוגרת בתולה מקו ה- gRNA הומוזיגוס וחמישה זבובים זכרים בוגרים מן הטרוזיגוס מאוזן Ubiq CasRx CurlyO.
מניחים את זבובי ההורים לתוך בקבוקון בתוספת 100 מיקרוגרם של אבקת שמרים יבשים ומניחים את הבקבוקונים במשך 48 שעות ב 26 מעלות צלזיוס. שימו לב לבקבוקונים כל יום כדי לראות אם צאצאים בוגרים חדשים יצאו מהערווה של דור ה-F1 והרדים מישהו מהמבוגרים עם פחמן דו חמצני במשך 10 שניות. ברגע שהזבובים הופכים לרוקנים את הנקניקון על משטח זבוב המחובר למיכל הפחמן הדו-חמצני עם דו תחמוצת הפחמן המתמדת ומשתמשים במצלמת צבע המחוברת למיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי כדי להבקיע ולדמות את הפנוטיפים של הזבובים.
ואז לספור את המספרים של צאצאים עם פנוטיפים שונים, על פי ביטוי האות פלואורסצנטי. בהתבסס על גנטיקה מנדליאנית, 50% מה הצאצאים צפויים לבטא את הרנ"א הממוקד. שים לב כי רעילות של מערכת Ubiq CasRx עשויה להפחית את היחס בין RNA ממוקד מבטא צאצאים לפחות מ -50%כדי להגדיר בכל מקום ב- vivo אקסוגני RNA מיקוד באמצעות מערכת CasRx שלושה רכיבים, לאסוף שמונה עד 10 זבובים נקבה בוגרת בתולה מקו ביטוי לוציפראז כפול וארבעה עד חמישה זבובים זכרים בוגרים מן הטרוזיגוס המאוזן Ubiq CasRx קרלי פלוס TM6, קו STB המציג עיניים לבנות, כנפיים מתולתלות, ו- ds פלואורסצנטיות אדומה בו זמנית.
מניחים את שלב ההורה אחד מוצלב במין בתוספת 100 מיקרוגרם של אבקת שמרים יבשים ומניחים את הצלב הזה במשך 48 שעות ב 26 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להסיר את כל זבובי ההורים מכל בקבוקון ולהחזיר את הבקבוקונים לחממה 26 מעלות צלזיוס לפחות 14 ימים. במהלך 14 ימים, כאמור לאסוף שמונה עד 10 בתולות נקבה מן הומוזיגוס גחלילית לוציפראז מיקוד קו gRNA שלוש פעמים.
שים לב לשלב אחד לחצות בקבוקונים כל יום כדי לראות אם כל צאצאים בוגרים חדשים יצאו מן הגולם, מרדים עם פחמן דו חמצני כדי לאפשר איסוף של ארבעה עד חמישה זבובים זכרים מבטאים הן את Ubiq CasRx ואת כתב לוציפראז כפול כפי זמין. מניחים את הזבובים לתוך ביון חדש עם 10 נקבות בתולה מן זבוב הפירות לוציפראז מיקוד קו gRNA, ומניחים אלה שלב שני צלבים ב 26 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. לאסוף עוד חמישה גברים בני יום אחד מבטאים הן את Ubiq CasRx וכתב לוציפראז כפול מן השלב הראשון לחצות בקבוקונים ודגורת הזבובים במשך יומיים עד ארבעה ימים לבד ב 26 מעלות צלזיוס לפני העברתם לתוך צנטריפוגה 1.5 מיליליטר עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון.
בסוף הדגירה, הסר את כל הבקבוקונים ההוריים מכל אחד מהשלב השני של בקבוקונים חוצים. ולהחזיר את הבקבוקונים לחממה של 26 מעלות צלזיוס למשך 20 יום לפחות. שימו לב לשלב השני של בקבוקונים חוצים מדי יום כדי לראות אם צאצאים בוגרים חדשים יצאו מהערווה, מרדים את הזבובים עם פחמן דו חמצני כשהם הופכים לזמינים, ומבקיעים ומדמימים את הפנוטיפים שלהם כפי שהודגם.
הגנטיקה של מנדליה מצביעה על כך שאם כל הזבובים הם ברי קיימא, 25% מהצוידים צריכים לבטא את הרנ"א הממוקד. כדי לבצע צ'ייז לוציפראז, ליצור את זבובי הטרנס הטרוזיגוס המשולשים, כמו גם את זבובי הבקרה כפי שהודגם. איסוף הזבובים הזכרים בלידה, והזדקנותם עד גיל שלושה ימים.
העבר את זבובים בן שלושה ימים לתוך צינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר, ולזר אותם באמצעות חוצץ במאגר תמוגה לוציפראז מערכת בדיקת לוציפראז זמין מסחרית. לאחר מכן להשתמש חמישה microliters של רקמה lysed מכל מדגם ו luminometer כדי למדוד הן זבובי פירות ופעילות לוציפראז, על פי פרוטוקולי בדיקת לוציפראז סטנדרטיים. F1, טרנס הטרוזיגוס CasRx, יש שיעורי הישרדות נמוכים באופן משמעותי בהשוואה זבובי הטרנס heterozygous dCasRx.
אישור הרעילות של מערכת Ubiq CasRx של שלושת הגנים היעד, זבובי U6 gRNA Y הטרוזיגוס אינם ניתנים להפעלה ואינם גדלים מעבר לשלב הזחל השני. זבובי ההטרוזיגוס של אואבק קסקס ו-U6 gRNA W, מדגימים פנוטיפ ברור של עיניים רחבות. בנוסף, נצפתה גם הפחתה משמעותית של תמלילי גנים ממוקדים לשלושה גנים ממוקדים.
ראיות לפעילות מחוץ למטרה הנגרמת על ידי CasRx נצפות גם כאשר מושוים תמלילים דיפרנציאליים בין דגימות מ- CasRx המבטאים זבובים ודגימות מ- dCasRx המבטאים זבובים. בשני השלבים, רק השילוב של כל שלושת הגנים הטרנסג'נדרים גורם ל-100% קטלניות. כאשר משתמשים בפילוח RNA ספציפי לרקמות באמצעות עיצוב מערכת CasRx שלושה רכיבים, רמת הרעילות מופחתת כאשר הביטוי הכללי CasRx יורד באמצעות מקדם UAST בהשוואה לזה של מקדם Ubiq.
חשוב להגדיר את התהליך הגנטי כראוי באמצעות זבובים של מגדר נכון פנוטיפים נכונים.
