CRISPR/CasRx का उपयोग करके ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में सर्वव्यापी और ऊतक-विशिष्ट आरएनए लक्ष्यीकरण

जैसा कि हमारे प्रोटोकॉल से पता चलता है, CRISPR CasRx प्रौद्योगिकियों का उपयोग फल मक्खियों में सर्वव्यापी और ऊतक विशिष्ट जीन प्रतिलेख कटौती प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। हमारी तकनीक किसी के लिए एक स्टार्टर पैकेज प्रदान करती है जो आगे अनुकूलन और अनुकूलन के साथ संगत होने के दौरान फल मक्खियों में CRISPR-आधारित जीन ट्रांसक्रिप्ट कमी का उपयोग करने में रुचि रखता है। एक दो घटक CasRx प्रणाली का उपयोग कर vivo आरएनए लक्ष्यीकरण में एक सर्वव्यापी स्थापित करने के लिए, ब्याज की homozygous gRNA लाइन से 10 कुंवारी वयस्क महिला मक्खियों और संतुलित विषमयुग्मजी Ubiq CasRx CurlyO से पांच वयस्क पुरुष मक्खियों इकट्ठा.

माता-पिता की मक्खियों को 100 माइक्रोग्राम सूखे खमीर पाउडर के साथ पूरक एक शीशी में रखें और 26 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए शीशियों को पीछे करें। यह देखने के लिए हर दिन शीशियों का निरीक्षण करें कि क्या कोई नई वयस्क संतान एफ 1 पीढ़ी के जघन से उभरी है और 10 सेकंड के लिए कार्बन डाइऑक्साइड के साथ किसी भी वयस्क को बेहोश करती है। एक बार जब मक्खियां स्थिर हो जाती हैं, तो लगातार कार्बन डाइऑक्साइड के साथ कार्बन डाइऑक्साइड टैंक से जुड़े फ्लाई पैड पर शीशी को खाली कर देती हैं और मक्खियों के फेनोटाइप को स्कोर करने और छवि बनाने के लिए एक फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप से जुड़े एक रंगीन कैमरे का उपयोग करती हैं।

फिर फ्लोरोसेंट सिग्नल अभिव्यक्ति के अनुसार, विभिन्न फेनोटाइप्स के साथ संतानों की संख्या की गणना करें। मेंडेलियन आनुवांशिकी के आधार पर, 50% संतानों को लक्षित आरएनए व्यक्त करने की उम्मीद है। ध्यान दें कि Ubiq CasRx प्रणाली की विषाक्तता लक्षित आरएनए के अनुपात को कम कर सकती है जो संतानों को 50% से कम तक व्यक्त करती है, तीन-घटक CasRx प्रणाली का उपयोग करके विवो बहिर्जात आरएनए लक्ष्यीकरण में एक सर्वव्यापी स्थापित करने के लिए, आठ से 10 वर्जिन वयस्क मादा मक्खियों को एक दोहरी लूसिफेरस एक्सप्रेसिंग लाइन से इकट्ठा करती है और संतुलित विषमयुग्मजी यूबिक कैसरक्स घुंघराले प्लस टीएम 6 से चार से पांच वयस्क पुरुष मक्खियों को इकट्ठा करती है, एसटीबी लाइन जो सफेद आंखें, घुंघराले पंख, और डीएस लाल प्रतिदीप्ति को एक साथ प्रदर्शित करती है।

माता-पिता के कदम को 100 माइक्रोग्राम सूखे खमीर पाउडर के साथ पूरक एक शीशी में एक क्रॉस-बाय रखें और 26 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए इस क्रॉस को पीछे करें। इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक शीशी से माता-पिता की सभी मक्खियों को हटा दें और कम से कम 14 दिनों के लिए 26 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में शीशियों को वापस कर दें। 14 दिनों के दौरान, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, तीन बार जीआरएनए लाइन को लक्षित करने वाले होमोजीगस फायरफ्लाई लूसिफेरस से आठ से 10 महिला कुंवारियों को इकट्ठा करें।

यह देखने के लिए कि क्या कोई नई वयस्क संतानें प्यूपे से उभरी हैं, कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एनेस्थेटाइज़िंग के लिए हर दिन एक क्रॉस शीशियों का निरीक्षण करें, ताकि चार से पांच पुरुष मक्खियों के संग्रह की अनुमति मिल सके जो यूबिक कैसरक्स और दोहरी लूसिफेरस रिपोर्टर दोनों को उपलब्ध के रूप में व्यक्त करते हैं। जीआरएनए लाइन को लक्षित करने वाले फल मक्खी लूसिफेरस से 10 वर्जिन मादाओं के साथ मक्खियों को एक नई शीशी में रखें, और इन चरणों को 48 घंटों के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर रखें। एक और पांच एक दिन पुराने पुरुषों को इकट्ठा करें जो चरण एक क्रॉस शीशियों से यूबिक कैसरक्स और दोहरी लूसिफेरस रिपोर्टर दोनों को व्यक्त करते हैं और उन्हें माइनस 80 डिग्री सेल्सियस भंडारण के लिए 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज में स्थानांतरित करने से पहले 26 डिग्री सेल्सियस पर अकेले दो से चार दिनों के लिए मक्खियों को इनक्यूबेट करते हैं।

इनक्यूबेशन के अंत में, चरण दो क्रॉस शीशियों में से प्रत्येक से माता-पिता की सभी शीशियों को हटा दें। और शीशियों को कम से कम 20 दिनों के लिए 26 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस कर दें। यह देखने के लिए कि क्या कोई नई वयस्क संतान जघन से उभरी है, कार्बन डाइऑक्साइड के साथ मक्खियों को एनेस्थेटिक करने के लिए हर दिन चरण दो क्रॉस शीशियों का निरीक्षण करें, क्योंकि वे उपलब्ध हो जाते हैं, और प्रदर्शन के रूप में अपने फेनोटाइप को स्कोरिंग और इमेजिंग करते हैं।

मेंडेलियन आनुवांशिकी से पता चलता है कि, यदि सभी मक्खियां व्यवहार्य हैं, तो संतानों के 25% को लक्षित आरएनए व्यक्त करना चाहिए। एक लूसिफेरस परख प्रदर्शन करने के लिए, ट्रिपल ट्रांस विषमयुग्मजी मक्खियों के रूप में अच्छी तरह से नियंत्रण मक्खियों के रूप में प्रदर्शित के रूप में उत्पन्न करते हैं। जन्म के समय नर मक्खियों को इकट्ठा करना, और उन्हें तीन दिन की उम्र तक उम्र बढ़ने।

1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में तीन दिन पुरानी मक्खियों को स्थानांतरित करें, और उन्हें व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लूसिफेरस परख किट से लूसिफेरस लाइसिस बफर में एक बफर का उपयोग करके लाइस करें। फिर प्रत्येक नमूने और luminometer से lysed ऊतक के पांच microliters का उपयोग करने के लिए दोनों फल मक्खियों को मापने के लिए और Luciferase गतिविधि भाग गया, मानक luciferase परख प्रोटोकॉल के अनुसार. F1, ट्रांस विषमयुग्मजी CasRx, ट्रांस विषमयुग्मजी dCasRx मक्खियों की तुलना में काफी कम जीवित रहने की दर है।

तीन लक्ष्य जीनों के Ubiq CasRx प्रणाली की विषाक्तता की पुष्टि करते हुए, U6 gRNA Y विषमयुग्मजी मक्खियां अव्यवहार्य हैं और दूसरे इंस्टार लार्वा चरण से परे नहीं बढ़ती हैं। जीवित Ubq CasRx और U6 gRNA W विषमयुग्मजी मक्खियों, एक अलग पूरी तरह से penetrant व्यापक आंखों वाले फेनोटाइप का प्रदर्शन करते हैं। इसके अलावा, तीन लक्ष्य जीनों के लिए लक्ष्य जीन टेपों की एक महत्वपूर्ण कमी भी देखी जाती है।

CasRx द्वारा प्रेरित बंद लक्ष्य गतिविधि के सबूत भी मनाया जाता है जब विभेदक व्यक्त प्रतिलेखों CasRx मक्खियों और dCasRx से मक्खियों को व्यक्त करने से नमूनों के बीच व्यक्त टेपों की तुलना कर रहे हैं. दो चरण क्रॉस में, केवल सभी तीन ट्रांस जीनों के संयोजन के परिणामस्वरूप 100% घातकता होती है। जब ऊतक विशिष्ट आरएनए लक्ष्यीकरण एक तीन घटक CasRx सिस्टम डिजाइन का उपयोग कर नियोजित किया जाता है, विषाक्तता का स्तर कम हो जाता है जब समग्र CasRx अभिव्यक्ति Ubiq प्रमोटर की तुलना में UAST प्रमोटर का उपयोग कर कम हो जाता है।

सही लिंग और सही फेनोटाइप की मक्खियों का उपयोग करके आनुवंशिक प्रक्रिया को सही ढंग से स्थापित करना महत्वपूर्ण है।