Name: ubiquitous and tissue-specific rna targeting in drosophila melanogaster using crispr/casrx
Uploaded: 2021-02-05T15:00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av finansiering fra et DARPA Safe Genes Program Grant (HR0011-17-2-0047), og NIH-priser (R21RAI149161A, DP2AI152071) tildelt O.S.A.

<ol>
	<li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nat Communications. 9, 1911 (2018).</li><li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector.">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), 5573 (2016).</li><li>East-Seletsky, A., O'Connell, M., Burstein, D., Knott, G., Doudna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Targeting+by+Functionally+Orthogonal+Type+VI-A+CRISPR-Cas+Enzymes.">RNA Targeting by Functionally Orthogonal Type VI-A CRISPR-Cas Enzymes.</a> Molecular Cell. 66 (3), 373-383 (2017).</li><li>Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N., Oki, J., Shokhirev, M., Hsu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+Engineering+with+RNA-Targeting+Type+VI-D+CRISPR+Effectors.">Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.</a> Cell. 173 (3), 665-676 (2018).</li><li>Buchman, A., Brogan, D., Sun, R., Yang, T., Hsu, P., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+RNA+Targeting+Using+CasRx+in+Flies.">Programmable RNA Targeting Using CasRx in Flies.</a> The CRISPR Journal. 3 (3), 164-176 (2020).</li><li>Kushawah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas13d+Induces+Efficient+mRNA+Knockdown+in+Animal+Embryos.">CRISPR-Cas13d Induces Efficient mRNA Knockdown in Animal Embryos.</a> Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).</li><li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13.">RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> Nature. 550, 280-284 (2017).</li><li>Perrimon, N., Ni, J., Perkins, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+RNAi:+today+and+tomorrow.">In vivo RNAi: today and tomorrow.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 003640 (2010).</li><li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+resource+of+transgenic+RNAi+lines+for+neurogenetics.">A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics.</a> Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+shRNA+resource+for+transgenic+RNAi+in+Drosophila.">A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila.</a> Nature Methods. 8, 405-407 (2011).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+and+parameters+for+targeted+transgenic+RNA+interference+in+Drosophila+melanogaster.">Vector and parameters for targeted transgenic RNA interference in Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 5, 49-51 (2008).</li><li>Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)+Screening+in+Drosophila.">RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila.</a> Genetics. 208 (3), 853-874 (2018).</li><li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+off-target+effects+associated+with+long+dsRNAs+in+Drosophila+melanogaster+cell-based+assays.">Evidence of off-target effects associated with long dsRNAs in Drosophila melanogaster cell-based assays.</a> Nature Methods. 3, 833-838 (2006).</li><li>Ma, Y., Creanga, A., Lum, L., Beachy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+off-target+effects+in+Drosophila+RNA+interference+screens.">Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens.</a> Nature. 443, 359-363 (2006).</li><li>Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matter+arising:+off-targets+and+genome-scale+RNAi+screens+in+Drosophila.">Matter arising: off-targets and genome-scale RNAi screens in Drosophila.</a> Fly. 1 (1), 1-5 (2007).</li><li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes.">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nature Genetics. 40, 476-483 (2008).</li><li>Champer, J., Buchman, A., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cheating+evolution:+engineering+gene+drives+to+manipulate+the+fate+of+wild+populations.">Cheating evolution: engineering gene drives to manipulate the fate of wild populations.</a> Nature Review Genetics. 17 (3), 146-159 (2016).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+dengue+neutralization+in+mosquitoes+expressing+an+engineered+antibody.">Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody.</a> PLoS Pathogens. 16 (4), 1008103 (2020).</li><li>Mathur, G., Sanchez-Vargas, I., Alvarez, D., Olson, K., Marinotti, O., James, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene-mediated+suppression+of+dengue+viruses+in+the+salivary+glands+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">Transgene-mediated suppression of dengue viruses in the salivary glands of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Insect Molecular Biology. 19 (6), 753-763 (2011).</li><li>Franz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+RNA+interference-based+resistance+to+dengue+virus+type+2+in+genetically+modified+Aedes+aegypti.">Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4198-4203 (2006).</li><li>Yen, P., James, A., Li, J., Chen, C., Failloux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+miRNAs+induce+dual+arboviral-resistance+phenotypes+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Synthetic miRNAs induce dual arboviral-resistance phenotypes in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> Communications Biology. 1, 11 (2018).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Zika+virus+in+transgenic+Aedes+aegypti+expressing+a+polycistronic+cluster+of+synthetic+small+RNAs.">Engineered resistance to Zika virus in transgenic Aedes aegypti expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).</li><li>. Addgene Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/">https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/</a> (2020)</li><li>Gibson, D., Young, L., Chuang, R., Venter, J., Hutchison, C., Smith, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>. Addgene Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr/">https://www.addgene.org/protocols/pcr/</a> (2020)</li><li>. Indiana University Bloomington Available from: <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL</a> (2020)</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Jiang, W., Brueggeman, A., Horken, K., Plucinak, T., Weeks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+transient+expression+of+Cas9+and+single+guide+RNA+genes+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Eukaryotic Cell. 13 (11), 1465-1469 (2014).</li><li>Poe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+CRISPR/Cas9-Mediated+Tissue-Specific+mutagenesis+reveals+gene+redundancy+and+perdurance+in+Drosophila.">Robust CRISPR/Cas9-Mediated Tissue-Specific mutagenesis reveals gene redundancy and perdurance in Drosophila.</a> Genetics. 211 (2), 459-472 (2019).</li><li>Port, F., Chen, H., Lee, T., Bullock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+ger+mLine+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient ger mLine and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 2967-2976 (2014).</li><li>Yang, S., Li, S., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shortening+the+Half-Life+of+Cas9+maintains+its+gene+editing+ability+and+reduces+neuronal+toxicity.">Shortening the Half-Life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity.</a> Cell Reports. 25 (10), 2653-2659 (2018).</li><li>Port, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+resource+for+tissue-specific+CRISPR+mutagenesis+in+Drosophila.">A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila.</a> eLife. 9, 53865 (2020).</li><li>Zhang, X., Tee, L., Wang, X., Huang, Q., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+Effects+in+CRISPR/Cas9-mediated+Genome+Engineering.">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4 (17), 264 (2015).</li><li>Huynh, N., Depner, N., Larson, R., King-Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+toolkit+for+CRISPR-Cas13-based+RNA+manipulation+in+Drosophila.">A versatile toolkit for CRISPR-Cas13-based RNA manipulation in Drosophila.</a> Genome Biology. 21, 279 (2020).</li></ol>

O.S.A er grunnlegger av Agragene, Inc., har en eierandel, og sitter i selskapets Scientific Advisory Board. Vilkårene i denne ordningen er gjennomgått og godkjent av University of California, San Diego i samsvar med retningslinjene for interessekonflikter. Alle andre forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.

Med tre forskjellige applikasjonsdesign av CasRx-systemet demonstrerte dette arbeidet in vivoprogrammable RNA-målretting i fluer. De ulike strategiene imøtekommer ulike prosjektbehov, for eksempel endogen versus eksogen genmålretting og allestedsnærværende versus vevsspesifikk RNA-målretting. Effektene av RNA-målretting inkluderte målgenspesifikke fenotypiske endringer, reduksjon av mål-RNA-transkripsjon og sporadiske dødelighetsfenotyper forbundet med høyt uttrykk for CasRx-protein og sikkerhetsaktivitet. Samlet sett viste disse resultatene at CasRx-systemet er i stand til å målrette RNA-transkripsjonsreduksjon på organismenivå på en programmerbar og effektiv måte.
En av nøkkelfaktorene for vellykket tilpasning av CasRx-systemet er utformingen av gRNAer. Spesielt skal følgende råd følges: målsekvensen er rundt 30 nukleotider i lengde, lengden på poly-U strekker seg i målsekvensen er 4 basepar eller mindre, målsekvensen GC-innhold er i området 30% - 70%, målsekvensen er ikke spådd å danne sterke RNA-hårnålstrukturer, og målsekvensen inneholder minimal predikert RNA sekundær eller tertiær struktur5.
I tillegg til gRNA-designene er flygenetikktrinnet i hver protokoll også kritisk i en vellykket implementering. Tilstedeværelsen eller mangelen på de definerte fenotypene som ble sendt ned fra foreldrene i avkomene, er viktig for å identifisere og kvantifisere fenotyper indusert av CasRx-systemet i de transheterozygote avkomene. Det er også nyttig å sette opp kontrollkryss ved hjelp av dCasRx-fluene parallelt i å utelukke ikke-spesifikke fenotyper i de transheterozygote avkomene.
Det er verdt å merke seg at disse resultatene avslørte toksisitetsproblem introdusert ved allestedsnærværende å uttrykke CasRx og dCasRx protein i fluen, en begrensning av CasRx-systemet. Allestedsnærværende uttrykk for CasRx eller dCasRx under Ubiq promotor alene, uten gRNAer, kom med ikke-trivelige treningskostnader, da verken Ubiq-CasRx eller Ubiq-dCasRx fluer kunne etableres som homozygote linjer. Tvert imot kan UASt-CasRx og UASt-dCasRx fluer etableres som sunne homozygote bestander, men på grunn av utformingen av kryssordningen ble de holdt som dobbeltbalanserte aksjer, et faktum som støtter eksistensen av toksisitet indusert av allestedsnærværende CasRx proteinuttrykk. Et annet stykke støttende bevis er at i kontrollforsøk som involverer dCasRx, som er katalytisk inaktive, var prosentandelene av fluer som bærer både dCasRx- og gRNA-konstruksjoner ut av det totale antall fluer i F1-generasjonen konsekvent lavere enn 50%, forholdet som forventes basert på mendelisk genetikk hvis ingen dCasRx-assosiert toksisitet var tilstede. Dette indikerte at allestedsnærværende uttrykker dCasRx, sammen med gRNAer, induserer toksisitet i fluen, noe som resulterer mindre enn forventet arveforhold. Arveforholdene til transheterozygot UASt-dCasRx, gRNA, GAL4 fluer fulgte mendelisk genetikk, noe som igjen antyder toksisiteten som er indusert spesielt av allestedsnærværende uttrykk for CasRx- og dCasRx-proteiner. Toksisitet i CRISPR/Cas-systemet er ikke nytt. Høye mengder Cas9-protein har vist seg å være giftig i flere organismer, inkludert fluer29,30,31,32. En nylig studie har utviklet et tilpasset GAL4 / UAS-system som kan justere mengden Cas9-protein uttrykt i fluer ved å legge til en åpen leseramme av varierende lengde mellom UAS-sekvensen og Cas9-sekvensen i UAS-Cas9-konstruksjonen33. Derfor er det verdt å utforske måter å redusere CasRx-indusert toksisitet ved å justere CasRx proteinuttrykksnivå.
Bortsett fra toksisiteten forårsaket av allestedsnærværende uttrykk for CasRx- og dCasRx-proteiner, viste resultatene også dødelighet knyttet til CasRx-systemets ikke-spesifikke sikkerhetsmessige off-target effekter, en funksjon av mange CRISPR-systemer1,2,7,34. I noen av CasRx og ikke-essensielle gen gRNA-uttrykkende doble eller trippel transheterozygote fluer, for eksempel når de er rettet mot Notch, har de transheterozygote CasRx-fluene betydelig lavere nivåer av overlevelsesrate sammenlignet med de transheterozgyous dCasRx-fluene. I RNA-seq-analysen av disse CasRx- og gRNA-uttrykkende transheterozygote fluene ble både reduksjon av målgentranskripsjonsnivåer og reduksjon av ikke-mål gentranskripsjoner observert. Disse sikkerhetseffektene var CasRx-avhengige og målavhengige, da de bare ble observert i transheterozygote fluer som uttrykte både CasRx-proteinet og gRNA. Det er verdt å påpeke at et av målgenene, hvit, bare viste en begrenset, ikke-statistisk signifikant reduksjon i transkripsjoner da det hvite genet ble målrettet av CasRx, som var i motsetning til den klare pigmentreduksjonsfenotypen. Det er hypoteset at dette kan skyldes det faktum at 1) tidspunktet for RNA-seq prøvetaking ikke var godt tilpasset timingen når det hvite genet når sitt topputtrykk under tidlig utvikling, og 2) det lokaliserte uttrykket for det hvite genet i øynene gjør det utfordrende å samle de relevante vevene i tidlig utviklingsfase når bare hele kroppens prøveinnsamling er mulig. For å redusere sikkerhetsaktiviteten i CasRx-systemet, oppfordres fremtidige studier til å forstå mekanismene som ligger til grunn for off-target fenomensystemet på organismenivå.
Interessant nok syntes en nylig studie35 som beskriver RNA-målrettede Cas13-verktøy i fluer å forbedre den generelle toksisiteten forbundet med CasRx-uttrykk, av flere mulige grunner. For det første omkodet forfatterne Cas13-transgenes for å optimalisere uttrykket i Drosophila og brukte en mer svakt uttrykkende promotor (aktin 5C) sammenlignet med allestedsnærværende promotor som ble brukt i den nåværende studien, sannsynligvis førte til lavere nivåer av Cas13-uttrykk og dermed mindre toksisitet. Faktisk støttes dette av observasjonene om at UASt-drevet CasRx- og dCasRx-uttrykk ikke i seg selv var giftig, da denne studien (og forfatterne i 35) ikke observerte noen åpenbar dødelighet i UASt-CasRx-fluer. Videre kodet disse forfatterne sine gRNAer annerledes sammenlignet med denne studien, noe som kan ha påvirket deres uttrykk og redusert systemets toksisitet i transheterozygote Cas13 / gRNA-fluer. For eksempel ble to gRNAer i studien uttrykt ved hjelp av U6:3-promotoren og flankert av tRNAer for å muliggjøre gRNA-behandling ved tRNA-modning uten å kreve CasRx35. Omvendt, i denne studien, ble gRNAene kodet som matriser rettet mot opptil 4 steder per gen og etterligner den endogene Cas13-matrisestrukturen som finnes i bakterier, noe som krever cas13-enzymet for å behandle hver gRNA. Disse ulike tilnærmingene kan ha ført til forskjeller i gRNA-uttrykksnivåer og andre faktorer som kan ha iboende effekter på toksisiteten til hele systemet. Til slutt målrettet Huynh et al. mot forskjellige gener enn de som er målrettet i den nåværende studien, noe som resulterer i forskjeller i mål-Cas / gRNA interaksjon og sikkerhetsaktivitet og kan ha effekter på de observerte nivåene av dødelighet. Disse forskjellene i observert toksisitet krever videre undersøkelse for å identifisere hvordan de samlede systemene kan forbedres.
Totalt sett er denne studien den første demonstrasjonen av et funksjonelt genetisk kodet programmerbart RNA-målrettet Cas-system i D. melanogaster, om enn ytterligere optimalisering av CasRx-systemet (i tråd med det som rapporteres35) vil bli pålagt å ytterligere redusere off-target-assosiert dødelighet og øke effekten av CasRx på mål spalting. RNA-målretting med Cas-enzymer er et raskt utviklende felt med mange potensielle applikasjoner som spenner fra insektvektorkontroll til terapeutisk bruk1,2,3,4,5,6,7, og denne protokollen tilbyr en startpakke for alle som er interessert i å designe sitt første CasRx-system i fluer, samtidig som den er kompatibel med tilpasning og videre optimalisering av systemet. Eksemplene som presenteres her viser en rekke resultater man kan støte på under implementering av dette systemet in vivo og kan fungere som benchmarks for andre brukere i evaluering av ytelsen til CasRx-systemet i sine applikasjoner.

Siden fremveksten av Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-teknologier, har mye av fokuset på dette feltet vært på DNA-redigering, som tilbyr transformative applikasjoner innen medisin og bioteknologi1. Permanent endring av DNA-sekvenser er imidlertid ikke alltid ønskelig på grunn av etiske hensyn. I lys av dette begynte nyere studier å utvikle CRISPR-baserte verktøy for målretting av RNA og viste at CRISPR-teknologier faktisk kan brukes til RNA-målretting i en rekke biologiske systemer2,3,4,5,6,7. I mange av disse systemene som er testet, er den nåværende mye brukte tilnærmingen for målretting av RNA og transkripsjonsreduksjon RNA-interferens (RNAi), som er langt fra perfekt, ofte med variert effekt og høy off-target aktivitet når den brukes i vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Derfor, gitt statusen til disse teknologiene, er det verdt å utforske potensialene til CRISPR-baserte verktøy for RNA-målretting ytterligere.
En bemerkelsesverdig nylig studie rapporterte at ribonuklease CasRx, et medlem av Cas13d-klassen, effektivt kan redusere gentranskripsjonsnivåer i menneskelig cellekultur og har en attraktiv off-target profil4. Dette funnet førte til spørsmålet om denne nye ribonuklease kan opprettholde sin effekt og lave off-target rate for RNA-målretting på organismenivå. En nylig studie tok opp dette spørsmålet ved å vise at CasRx-systemet kan brukes til å oppnå allestedsnærværende og vevsspesifikk gentranskripsjonsreduksjon i Drosophila melanogaster5.
For å effektivisere brukervennligheten til denne nylig publiserte tilnærmingen, beskriver denne protokollen metodene fra dette nylige arbeidet, som består av tre hoveddeler: 1) allestedsnærværende in vivo RNA-målretting ved hjelp av et to-komponent CasRx-system; 2) allestedsnærværende in vivo eksogen RNA målretting ved hjelp av en tre-komponent CasRx system; og 3) vevsspesifikk vivo RNA-målretting ved hjelp av et tre-komponent CasRx-system.
Guide RNAs (gRNA) rettet mot forskjellige målgener under kontroll av en allestedsnærværende promotor ble designet og flylinjer som uttrykker disse gRNA-inneholdende konstruksjonene ble generert. CasRx konstruksjoner under kontroll av enten en allestedsnærværende promotør, eller en betinget oppstrøms aktivering sekvens (UASt) promotør activatable av GAL4 transkripsjon faktor, ble også designet og fly linjer som huser disse CasRx-inneholdende konstruksjoner generert. Katalytisk inaktive CasRx-konstruksjoner, dCasRx, ble designet og brukt som negative kontroller. Allestedsnærværende RNA-målretting i fluer oppnås ved å krysse gRNA-uttrykkende fluelinjer med allestedsnærværende CasRx-uttrykkende fluelinjer. Avkommet som uttrykker både gRNA-konstruksjonen rettet mot en bestemt gentranskripsjon og CasRx-proteinet har en allestedsnærværende reduksjon av målrettede gentranskripsjoner. Vevsspesifikk RNA-målretting i fluer oppnås ved først å krysse gRNA-uttrykkende fluer med UASt-CasRx som uttrykker fluer, og oppnår transheterozygote fluer som bærer både gRNA- og UASt-CasRx-konstruksjoner. Slike fluer krysses i sin tur med vevsspesifikke GAL4-uttrykkende fluer, noe som resulterer i generering av vevsspesifikk CasRx-uttrykk og RNA-målretting i fluer.
CasRx-systemets programmerbare natur gir mulighet for tilpasning og optimalisering for å oppnå høy effekt og lav off-target aktivitet for in vivo RNA-målretting. Potensielle anvendelser av CRISPR-basert RNA-målretting er mange, inkludert å erstatte RNAi i laboratoriet og bidra til insektvektorkontroll i naturen. Av sistnevnte er et av de globale udekkede behovene utvikling av effektive verktøy for å bekjempe infeksjoner av RNA-virus som overføres via mygg. Mange RNA-virus, som denguefeber, Zika og chikungunya-virus, overføres via mygg, påvirker menneskers helse og bidrar til dødelighet. Mange forslag til ingeniør myggpopulasjoner med virusresistens for sykdomsforebygging er laget; Imidlertid er ingen nåværende teknologi i stand til å gjøre mygg samtidig motstandsdyktig mot alle betydelige RNA-virus18,19,20,21,22,23. RNA-målrettede Cas-systemer kan gi et utgangspunkt for en slik teknologi ved å muliggjøre en programmerbar plattform for å målrette mot alle myggbårne RNA-virus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% Grape Juice</td>
			<td>Welch Foods Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Active Dry Yeast (908g)</td>
			<td>Red Star Yeast Company, LLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 color camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMC4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAL4-GMR flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>29967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAL4-y flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>44373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glomax 20/20 Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 Sequencer</td>
			<td>Illumina, Inc.</td>
			<td>HiSeq2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165FC fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>NDONEC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>E7770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 112686</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 112688</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132416</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132417</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132419</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132420</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132421</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132422</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132425</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132426</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 133304</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 164586</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>164586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid #132418</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pJFRC81</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases AscI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0558L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases NotI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases PacI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0547L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases PstI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0140L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases SwaI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0604L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases XbaI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0145L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo DNase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-Fluc flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-N flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-w flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-y flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UASt-CasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UASt-dCasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiq-CasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiq-dCasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kits</td>
			<td>Zymo Research Corporation</td>
			<td>D4007</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ubiquitous and tissue-specific rna targeting in drosophila melanogaster using crispr/casrx

CasRx, et medlem av den RNA-målrettede Cas13-familien, er et lovende nytt tillegg av CRISPR/Cas-teknologiene i effektiv gentranskripsjonsreduksjon med en attraktiv off-target profil på både cellulært og organismenivå. Det er nylig rapportert at CRISPR / CasRx-systemet kan brukes til å oppnå allestedsnærværende og vevsspesifikk gentranskripsjonsreduksjon i Drosophila melanogaster. Denne artikkelen beskriver metodene fra det nylige arbeidet, bestående av tre deler: 1) allestedsnærværende in vivo endogene RNA-målretting ved hjelp av et to-komponent CasRx-system; 2) allestedsnærværende in vivo eksogen RNA målretting ved hjelp av en tre-komponent CasRx system; og 3) vevsspesifikk in vivo RNA-målretting ved hjelp av et tre-komponent CasRx-system. Effektene av observert RNA-målretting inkluderer målrettede genspesifikke fenotypiske endringer, målrettet reduksjon av RNA-transkripsjon og sporadiske dødelighetsfenotyper forbundet med høyt uttrykk for CasRx-protein og sikkerhetsaktivitet. Samlet sett viste disse resultatene at CasRx-systemet er i stand til å målrette RNA-transkripsjonsreduksjon på organismenivå på en programmerbar og effektiv måte, noe som viser at in vivo transcriptome målretting, og engineering er gjennomførbart og legger grunnlaget for fremtidige in vivo CRISPR-baserte RNA-målrettingsteknologier.

Allestedsnærværende in vivo RNA-målretting ved hjelp av et tokomponent casrx-system F1 transheterozygote fluer som uttrykte både Ubiq-CasRx og gRNA (rettet mot både endogene og eksogene gener) viste markerte fenotyper sammenlignet med kontrollfluene som uttrykte Ubiq-dCasRx- og gRNA-konstruksjonene (figur 2 og figur 4). Spesielt har de transheterozygote CasRx-fluene betydelig lavere nivåer av overlevelsesrate sammenlignet med de transheterozgyøse dCasRx-fluene, noe som indikerer toksisitet av Ubiq-CasRx-systemet (figur 2A og figur 4A). Det er verdt å merke seg at både transheterozygote CasRx- og dCasRx-fluer har mindre enn 50% arverate, som er det forventede forholdet basert på mendelisk genetikk. Av de tre målgenene er Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAN/+ fluer og Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAY/+ fluer er ikke-levedyktige (0% arv) og vokste ikke utover det andre instar larverstadiet (figur 2A-2B). Den overlevende Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAW/+ fluer, hvis arv var 12,9%, viste en distinkt fullt penetrant hvitøyet fenotype (figur 2B). I tillegg til observerbare egenskaper forbundet med CasRx, kunne vi bekrefte betydelig reduksjon av målgentranskripsjoner for 3 målgener: Hakk, gul og GFP (figur 2E-2G). Reduksjon av hvite gentranskripsjoner ble observert i Ubiq-CasRx/+, U6-gRNAW/+ fluer, sammenlignet med kontrollen Ubiq-dCasRx/+, U6-gRNAW/+ fluer, selv om reduksjonen ikke var statistisk signifikant (figur 2E - 2F). Bevis på off-target aktivitet indusert av CasRx ble funnet ved sammenligning av differensialt uttrykte transkripsjoner mellom prøver fra CasRx-uttrykkende fluer og prøver fra dCasRx-uttrykkende fluer (Figur 2E, 2G). Antall ikke-målrettede transkripsjoner som er vesentlig differensialt uttrykt er som følger: hvit, 253 (1,4% av totale transkripsjoner); Hakk, 300 (1,7%); gul, 41 (0,23%); GFP, 5880 (33 %) (Figur2G). Av de totalt 17 779 ulike transkripsjonene ble 6 ikke-målrettede transkripsjoner signifikant uttrykt i alle de 4 utvalgsgruppene. En av de 6 transkripsjonene som ble identifisert var Gadd45, et gen involvert i apoptose og cellulær arrestasjon i fluer, noe som øker muligheten for at den enzymatiske virkningen av CasRx enten direkte kan utløse cellulær apoptose eller indirekte utløse feilutpressing av andre gener, noe som igjen fører til apoptose. Til slutt er det verdt å merke seg at Ubiq-CasRx og Ubiq-dCasRx fluer ikke ble etablert som homozygote bestander, antagelig på grunn av toksisitet gitt av høyt allestedsnærværende uttrykk. Som et resultat ble heterozygote Ubiq-CasRx / CyO og Ubiq-dCasRx / CyO fluer brukt til kryssing med homozygote gRNA-fluelinjer. I sum er to-komponent Ubiq-CasRx-systemet i stand til å oppnå allestedsnærværende RNA-målretting for både endogene og eksogene mål, noe som resulterer i observerbare fenotyper og transkripsjonsreduksjon. Disse resultatene viste også at CasRx-mediert RNA-målretting kan introdusere toksisitet in vivo.
Allestedsnærværende in vivo eksogen RNA-målretting ved hjelp av et trekomponent casrx-system Resultatene fra totrinnskorset viste at til tross for målgenets eksogene natur (dvs. Fluc), som uttrykte alle tre transgenes i F2 trippeltransheterozygoter (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) resulterte i 100 % dødelighet sammenlignet med kontrollkryss som involverte Ubiq-dCasRx, der det ikke ble observert dødelighet i F2 trippeltransheterozygoter (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) (figur 3B-C ). Mer spesifikt resulterte bare kombinasjonen av alle tre transgenes (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) i 100% dødelighet (figur 3B og D), mens (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/TM6) og (Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6) genotyper var levedyktige og manglet fenotyper med arvetallene som samsvarte med de forventede mendeliske overføringsratene, antyder at tilgjengeligheten av målsekvensen (dvs. firefly luciferase) i kombinasjon med Ubiq-CasRx/+ og gRNAFluc er det som resulterte i de observerte dødelighetsfenotypene, antagelig stammer fra sikkerhetsaktiviteten til Cas13 enzymer2,8 . I tillegg er det ingen skille mellom fenotyper eller dramatisk påvirkning på arv i F1 transheterozygoter (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/+ eller Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) ble observert sammenlignet med Ubiq-dCasRx-kontroller (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/+ eller Ubiq-dCasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) (Figur 3B), noe som indikerer at et katalytisk aktivt enzym er avgjørende for å oppnå de observerte dødelighetsfenotypene. Videre viste Fluc og Rluc uttrykksnivåer i fluer av alle levedyktige genotyper ikke signifikant reduksjon i Fluc-uttrykket i Ubiq-dCasRx trippeltransheterozygotes (Ubiq-dCasRx /+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) sammenlignet med doble luciferase reporterkontroller. Dette antyder at Fluc proteinuttrykksnivåer ikke ble redusert ved dCasRx-målretting (figur 3D). Samlet sett indikerer den vanlige dødelighetsfenotypen i de to forskjellige CasRx-medierte allestedsnærværende RNA-målrettingsforsøkene at når den brukes på vev allestedsnærværende, kan CasRx-mediert RNA-målretting være giftig for organismen.
Vevsspesifikk in vivo RNA-målretting ved hjelp av et trekomponent casrx-system Det høye toksisitetsnivået som ble observert i allestedsnærværende RNA-målrettingsforsøk, fikk oss til å utforske den vevsspesifikke RNA-målrettingen ved hjelp av en tre-komponent CasRx-systemdesign som er beskrevet i metodedelen. Faktisk ble nivået av toksisitet observert redusert da det totale CasRx-uttrykket ble senket ved hjelp av UASt-promotoren sammenlignet med Ubiq-promotoren, Dette eksemplifiseres i tre aspekter: 1) UASt-CasRx- og UASt-dCasRx-linjene ble opprettholdt som homozygote linjer, men basert på totrinns kryssordningen ble dobbeltbalanserte UASt-CasRx- og UASt-dCasRx-linjer brukt til å utføre kryssene, 2) alle F2 generasjon dCasRx trippel transheterozygot arverater samsvarte med forventet 25% Mendelian arverate, og 3) F2 generasjon CasRx trippel transheterozygot dødelighet fenotype ble moderat redusert. I det hvite målrettingseksperimentet, av de 25% mendeliske arvetallene som forventes i F2 trippeltransheterozygoter, ble bare 0,57% levedyktige voksne fluer (UASt-CasRx /+; gRNAW/GMR-Gal4) observert, som alle viste alvorlig øyespesifikk pigmentering og morfologifenotyper (figur 4A og 4B). For det hvite målrettingskorset var den CasRx-uttrykkende trippel transheterozygote F2-arveprosenten betydelig lavere enn for dCasRx-uttrykkende trippel transheterozygot kontrollgruppe (27,6 %) (figur 4A). I Notch-målrettingseksperimentet var CasRx-uttrykkende trippel tranheterozygot som fraktet alle tre transgenes 100% dødelige, mens dCasRx-kontrollarvraten var 29,3% (figur 4A). I det gule målrettingseksperimentet viste F2 trippel transheterozygot CasRx-uttrykkende, gRNAy og y-GAL4 marginal chitinpigmentreduksjon som små flekker av gul kutiklet på thoraxen og magen med en arverate på 2,67%, mye lavere enn dCasRx-kontrollgruppen (25,2%) (Figur4A ). Alle dCasRx kontroll trippel transheterozygot fluer presenterte ikke åpenbare fenotyper som CasRx-uttrykkende fluer, noe som indikerer at katalytisk aktivitet av CasRx bidro til de observerte fenotypene. Den lave arveprosenten i CasRx trippel transheterozygot gruppe antydet at to kilder til toksisitet eksisterer i CasRx RNA-målretting: den ene er forbundet med høyt uttrykk for CasRx, hvis toksisitet ble redusert av restriktivt CasRx-uttrykk, den andre er knyttet til sikkerhetsaktiviteten. Samlet viste disse resultatene at CasRx-systemet kan oppnå vevsspesifikk in vivo RNA-målretting ved å utnytte det klassiske Gal4/UASt-systemet og i mellomtiden redusere toksisiteten. Imidlertid ble toksisitet og sporadiske dødelighet fenotyper fortsatt observert på et lavere nivå av alvorlighetsgrad sammenlignet med de allestedsnærværende tilnærmingene, noe som indikerer at sikkerhetsmessig spaltingsaktivitet er forbundet med toksisitet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig01.jpg"> Figur 1: Generell oversikt over RNA-målretting ved hjelp av et Cas13D-system. (A) Skjema for det ett-trinns genetiske krysset i det allestedsnærværende in vivo RNA-målrettingen ved hjelp av et tokomponent CasRx-system. (B) Skjematikk av et to-trinns genetisk kryss i allestedsnærværende in vivo eksogen RNA målretting ved hjelp av tre-komponent CasRx-systemet. (C) Skjematikk av et to-trinns genetisk kryss i vevsspesifikk in vivo RNA-målretting ved hjelp av et tre-komponent CasRx-system. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig02.jpg"> Figur 2: Allestedsnærværende in vivo RNA-målretting ved hjelp av et to-komponent CasRx-system (gjengitt5). (A) Totale arveprosenter av transheterozygote fluer som arver Ubiq-CasRx (eller Ubiq-dCasRx) og gRNAer. Blå skyggelegging i boksen plott indikerer fenotype penetrance. (B) Fenotyper av transheterozygote fluer. Piler indikerer vevnekrose i øyet. Svart-hvitt-flue merket med ''X'' representerer dødelighet. (C) Totale arveprosenter av transheterozygote fluer av toveis kryss mellom Ubiq-CasRx (eller Ubiq-dCasRx) og gRNAGFP-OpIE2-GFP fluer. M, mors arv av CasRx; P, fars arv av CasRx. (D) F1 larver avkom i farskorset. (E) Transkripsjoner maksimalt en posteriori estimater for logaritmisk fold endring. DESeq2-rørledningen ble brukt. (F) Transkripsjoner per million (TPM) målrettet med CasRx eller dCasRx. (G) CasRx-depentent differensialt uttrykt transkripsjonsprosent av transkripsjoner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig03.jpg"> Figur 3: Allestedsnærværende in vivo eksogen RNA-målretting ved hjelp av et tre-komponent CasRx-system. (A) Skjematikk av det to-trinns genetiske korset. (B) Totale arveprosenter for alle genotyper som dukker opp i F2-generasjonen . Arving av alle tre transgenes (Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc og gRNAFLuc) i F2 avkom resulterte i 100% dødelighet og var betydelig lavere sammenlignet med Ubiq-dCasRx trippel transheterozygotes kontrollgruppe (p = 0,001, t-test). (C) Å bære Ubiq-CasRx/gRNAFluc alene eller Ubiq-CasRx og Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc alene førte ikke til alvorlig dødelighet, og arveforholdene mellom Ubiq-CasRx og Ubiq-dCasRx transheterozygoter var ikke signifikant forskjellige (p = 0,41 og p = 0,51, henholdsvis t-test). (D) Luciferase-forholdet normaliserer Fluc-avlesninger til Rluc-avlesninger. Trippel transheterozygote fluer som uttrykte Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc, gRNAFLuc var embryonale dødelige, som var representert av en flue med en "X", og som et resultat ble luciferaseuttrykk ikke målt. Fluc/Rluc-forholdet mellom Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6, Stb transheterozygotes var betydelig lavere enn for de andre Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc-uttrykkende gruppene (p = 1,2e-06 eller lavere, t-test). Resultatene fra gRNAFLuc-only-gruppen var signifikant lavere enn for alle andre grupper (p = 1,2e-06 eller lavere, t-test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig04.jpg"> Figur 4: Vevsspesifikk in vivo RNA-målretting ved hjelp av et trekomponent CasRx-system (reprinted5). (A) Total arveprosent av trippel transheterozygote fluer som bærer tre transgenes (UASt-CasRx eller UASt-dCasRx, gRNAer og Gal4-driver. (B) Fenotyper av trippel transheterozygote fluer. Den hvite pilen indikerer chitin pigmentreduksjon i thoraxen. Svart-hvitt-flue merket med ''X'' representerer dødelighet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Konstruere</td>
			<td>Beskrivelse</td>
			<td>Grunning</td>
			<td>Primersekvens (5 til 3')</td>
			<td>PCR-mal</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1050E</td>
			<td rowspan="2">CasRx</td>
			<td>1050E. C3</td>
			<td>TACTAATTTTCCAC ATCTCTATTTTGAC CCGCAGATTAATTA ATGAGCCCCAAGA AGAA</td>
			<td rowspan="2">pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGTTA TTTTAAAAACGATT CATTCTAGCTAGCT TAAGCGTAATCTGG AACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1050R</td>
			<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050E. C3</td>
			<td>TACTAATTTTCCAC ATCTCTATTTTGAC CCGCAGATTAATTA ATGAGCCCCAAGA AGAA</td>
			<td rowspan="2">pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGTTA TTTTAAAAACGATT CATTCTAGCTAGCT TAAGCGTAATCTG GAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">OA-1050L</td>
			<td rowspan="2">UASt-promotør</td>
			<td>1041.C9</td>
			<td>GCGGGTTCTCGA CGGTCACGGCGG GCATGTCGACGC GGCCGCAACCAA CAACACTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">pJFRC81</td>
		</tr>
<tr>
<td>1041.C11</td>
			<td>CTGGCCTCCACC TTTCTCTTCTTCT TGGGGCTCATGT TTAAACCCAATT CCCTATTCAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">CasRx</td>
			<td>1050L. C1</td>
			<td>AATACAAGAAGA GAACTCTGAATA GGGAATTGGGT TTAAACATGAGC CCCAAGAAGAA</td>
			<td rowspan="2">pCasRx</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGT TATTTTAAAAAC GATTCATTCTA GCTAGCTTAAG CGTAATCTGGA ACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">OA-1050S</td>
			<td rowspan="2">UASt-promotør</td>
			<td>1041.C9</td>
			<td>GCGGGTTCTC GACGGTCACG GCGGGCATGT CGACGCGGCC GCAACCAACAA CACTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">pJFRC81</td>
		</tr>
<tr>
<td>1041.C11</td>
			<td>CTGGCCTCCA CCTTTCTCTTC TTCTTGGGGCT CATGTTTAAAC CCAATTCCCTA TTCAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050L. C1</td>
			<td>AATACAAGAAG AGAACTCTGAAT AGGGAATTGGG TTTAAACATGAG CCCCAAGAAGAA</td>
			<td rowspan="2">pdCasRx</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGT TATTTTAAAAAC GATTCATTC-KODE CTAGCTTAAGCG TAATCTGGAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1043</td>
			<td rowspan="2">U6:3-promotør</td>
			<td>1043.C1</td>
			<td>GGGAATTGGGA ATTGGGCAATAT TTAAATGGCGGC GCGCCGAATTCT TTTTGCTCACCT</td>
			<td rowspan="2">Addgene plasmid #164586</td>
		</tr>
<tr>
<td>1043.C23</td>
			<td>ACACTAGTGGAT CTCTAGAGGTAC CGTTGCGGCCG CAAAAAAGTTGT AATAGCCCCTCA AAACTGGACCTT CCACAACTGCAG CCGACGTTAAAT TGAAA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">OA-1052B</td>
			<td rowspan="2">Ubiq promotør</td>
			<td>1052B. C1</td>
			<td>GGGAATTGGGCA ATATTTAAATGGC GGCTGCAGCGC GCAGATCGCCGAT</td>
			<td rowspan="2">Addgene plasmid #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>1052B. C2</td>
			<td>TTTCTTTATGTTT TTGGCGTCTTCC ATCCTAGGTCTG CGGGTCAAAATA GAGATG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">T2A-eGFP</td>
			<td>908A1</td>
			<td>ATAAAGGCCAAG AAGGGCGGAAA GATCGCCGTGG AGGGCAGAGGA AGTCTTCTAACAT GC</td>
			<td rowspan="2">Addgene plasmid #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>908A2</td>
			<td>TTGTTATTTTAAAA ACGATTCATTCTA GGCGATCGCTTA CTTGTACAGCTC GTCCATGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Omvendt Ubiq-promotør</td>
			<td>908A3</td>
			<td>ACCGTGACCTAC ATCGTCGACACTA GTGGATCTCTAGA CGCGCAGATCGC CGATG</td>
			<td rowspan="2">Addgene plasmid #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>908A4</td>
			<td>GGATCATAAACTT TCGAAGTCATGC GGCCGCTCTGCG GGTCAAAATAGAG ATGT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Liste over molekylær konstruksjon og primere som brukes i denne studien. Denne listen inneholder alle konstruksjoner (både IDen og beskrivelsen) og hver konstruksjons tilknyttede primere (både IDen og sekvensene (5 til 3)) og malene som brukes.

Watch this Scientific Journal Video about Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx at JoVE.com

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

Denne artikkelen skisserer en detaljert protokoll for bruk av RNA-rettet Cas13D-enzymet (RfxCas13D) i fluer.

Allestedsnærværende og vevsspesifikk RNA-målretting i Drosophila Melanogaster med CRISPR/CasRx

CasRx, a member of the RNA-targeting Cas13 family, is a promising new addition of the CRISPR/Cas technologies in efficient gene transcript reduction with ...

Som vår protokoll viser, kan CRISPR CasRx-teknologier brukes til å oppnå allestedsnærværende og vevsspesifikke gentranskripsjonsreduksjoner i fruktfluer. Vår teknikk tilbyr en startpakke for alle som er interessert i å bruke CRISPR-basert gentranskripsjonsreduksjon i fruktfluer mens de er kompatible med videre tilpasning og optimalisering. For å sette opp en allestedsnærværende in vivo RNA-målretting ved hjelp av et to-komponent CasRx-system, samle 10 jomfru voksne kvinnelige fluer fra den homozygote gRNA-interesselinjen og fem voksne mannlige fluer fra balansert heterozygot Ubiq CasRx CurlyO.Plasser foreldrefluene i et hetteglass supplert med 100 mikrogram tørt gjærpulver og bak hetteglassene i 48 timer ved 26 grader Celsius. Vær oppmerksom på hetteglassene hver dag for å se om det har oppstått et nytt voksent avkom fra kjønnsmedisinen i F1-generasjonen og bedøv noen av voksne med karbondioksid i 10 sekunder. Når fluene blir immobile tømmer hetteglasset på en flypute koblet til karbondioksidtanken med kontinuerlig karbondioksid og bruker et fargekamera koblet til et fluorescerende stereomikroskop for å score og avbilde fluenes fenotyper.Tell deretter antall avkom med forskjellige fenotyper, i henhold til fluorescerende signaluttrykk. Basert på mendelsk genetikk forventes 50% av avkommet å uttrykke den målrettede RNA. Vær oppmerksom på at toksisiteten til Ubiq CasRx-systemet kan redusere forholdet mellom målrettet RNA som uttrykker avkom til mindre enn 50%For å sette opp en allestedsnærværende in vivo eksogen RNA-målretting ved hjelp av et tre-komponent CasRx-system, samle åtte til 10 Virgin voksen kvinnefluer fra en dobbel luciferase som uttrykker linje og fire til fem voksne mannlige fluer fra balansert heterogous Ubiq CasRx Curly STB linje som viser hvite øyne, krøllete vinger, og ds rød fluorescens samtidig.Plasser foreldretrinnet en cross-by i et hetteglass supplert med 100 mikrogram tørt gjærpulver og bak dette korset i 48 timer ved 26 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, fjern alle foreldrefluene fra hvert hetteglass og returner hetteglassene til 26 grader Celsius inkubator i minst 14 dager. I løpet av 14 dager, som nevnt tidligere samle åtte til 10 kvinnelige jomfruer fra homozygot firefly luciferase rettet mot GRNA linje tre ganger.Følg trinnet ett kryss hetteglass hver dag for å se om noen nye voksne avkom har dukket opp fra puppene, bedøvet med karbondioksid for å tillate innsamling av fire til fem mannlige fluer som uttrykker både Ubiq CasRx og den doble Luciferase-reporteren som tilgjengelig. Plasser fluene i et nytt hetteglass med 10 Virgin kvinner fra fruktfluen luciferase rettet mot gRNA-linjen, og plasser disse trinn to kryssene ved 26 grader Celsius i 48 timer. Samle ytterligere fem en dag gamle menn som uttrykker både Ubiq CasRx og dual luciferase reporter fra trinnet en krysser hetteglass og inkuberer fluene i to til fire dager alene på 26 grader Celsius før de overføres til en 1,5 milliliter sentrifuge for minus 80 grader Celsius lagring.På slutten av inkubasjonen, fjern alle foreldrehettene fra hvert av trinn to krysshettene. Og returner hetteglassene til 26 grader Celsius inkubator i minst 20 dager. Vær oppmerksom på trinnet to kryss hetteglass hver dag for å se om noen nye voksne avkom har dukket opp fra kjønnsmedisin, bedøve fluene med karbondioksid som de blir tilgjengelige, og score og bilde deres fenotyper som demonstrert.Mendelisk genetikk antyder at hvis alle fluene er levedyktige, bør 25% av avkommet uttrykke den målrettede RNA. For å utføre en luciferase-analyse, generer trippeltrans heterozygote fluer så vel som kontrollen flyr som demonstrert. Samle hannen flyr ved fødselen, og aldring dem til tre dager gammel.Overfør de tre dager gamle fluene til 1,5 milliliter sentrifugerør, og lyse dem ved hjelp av en buffer i luciferase lysis buffer fra et kommersielt tilgjengelig luciferase analysesett. Bruk deretter fem mikroliter lysvev fra hver prøve og luminometer for å måle både fruktfluene og kjørte Luciferase-aktivitet, i henhold til standard luciferaseanalyseprotokoller. F1, trans heterozygot CasRx, har betydelig lavere overlevelsesrate sammenlignet med trans heterozygote dCasRx fluer.U6 gRNA Y heterozygote fluer bekrefter toksisiteten til Ubiq CasRx-systemet til de tre målgenene, og er ikke levedyktige og vokser ikke utover det andre instar larvalstadiet. De overlevende Ubq CasRx og U6 gRNA W heterozygote fluene, demonstrerer en distinkt fullt penetrant bredøyet fenotype. I tillegg observeres også en betydelig reduksjon av målgentranskripsjoner for tre målgener.Bevis på off target aktivitet indusert av CasRx observeres også når differensial uttrykte transkripsjoner mellom prøver fra CasRx som uttrykker fluer og prøver fra dCasRx uttrykkende fluer sammenlignes. I totrinnskorset resulterer bare kombinasjonen av alle tre transgenene i en 100% dødelighet. Når vevsspesifikk RNA-målretting ved hjelp av en tre-komponent CasRx-systemdesign brukes, reduseres toksisitetsnivået når det totale CasRx-uttrykket senkes ved hjelp av UAST-promotoren sammenlignet med Ubiq-promotoren.Det er viktig å sette opp den genetiske prosessen riktig ved hjelp av fluer av riktig kjønn og riktige fenotyper.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Ved hjelp av RNA-interferens for å undersøke det medfødte immunrespons i Musemakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid annealing-mediert elektroforese (NAVN) analysen Lar Rapid Identifikasjon av HIV-1 nucleocapsid hemmere

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemisk bakteriell infeksjon og immunforsvar fenotyper i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ påvisning av bakterier innenfor parafininnleiret Vev Bruke en digoksin-merket DNA Probe målretting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Bruke Resazurin Basert Narkotika mottakelighet analyse

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Målretting cystein Thiols for in Vitro områdespesifikke glykosylering rekombinante proteiner

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Utvinning av Hemocytes fra Drosophila melanogaster larver for mikrobielle infeksjoner og analyse

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Etablering av Viral infeksjon og analyse av Host-Virus samhandling i Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...