Som vår protokoll viser, kan CRISPR CasRx-teknologier brukes til å oppnå allestedsnærværende og vevsspesifikke gentranskripsjonsreduksjoner i fruktfluer. Vår teknikk tilbyr en startpakke for alle som er interessert i å bruke CRISPR-basert gentranskripsjonsreduksjon i fruktfluer mens de er kompatible med videre tilpasning og optimalisering. For å sette opp en allestedsnærværende in vivo RNA-målretting ved hjelp av et to-komponent CasRx-system, samle 10 jomfru voksne kvinnelige fluer fra den homozygote gRNA-interesselinjen og fem voksne mannlige fluer fra balansert heterozygot Ubiq CasRx CurlyO.
Plasser foreldrefluene i et hetteglass supplert med 100 mikrogram tørt gjærpulver og bak hetteglassene i 48 timer ved 26 grader Celsius. Vær oppmerksom på hetteglassene hver dag for å se om det har oppstått et nytt voksent avkom fra kjønnsmedisinen i F1-generasjonen og bedøv noen av voksne med karbondioksid i 10 sekunder. Når fluene blir immobile tømmer hetteglasset på en flypute koblet til karbondioksidtanken med kontinuerlig karbondioksid og bruker et fargekamera koblet til et fluorescerende stereomikroskop for å score og avbilde fluenes fenotyper.
Tell deretter antall avkom med forskjellige fenotyper, i henhold til fluorescerende signaluttrykk. Basert på mendelsk genetikk forventes 50% av avkommet å uttrykke den målrettede RNA. Vær oppmerksom på at toksisiteten til Ubiq CasRx-systemet kan redusere forholdet mellom målrettet RNA som uttrykker avkom til mindre enn 50%For å sette opp en allestedsnærværende in vivo eksogen RNA-målretting ved hjelp av et tre-komponent CasRx-system, samle åtte til 10 Virgin voksen kvinnefluer fra en dobbel luciferase som uttrykker linje og fire til fem voksne mannlige fluer fra balansert heterogous Ubiq CasRx Curly STB linje som viser hvite øyne, krøllete vinger, og ds rød fluorescens samtidig.
Plasser foreldretrinnet en cross-by i et hetteglass supplert med 100 mikrogram tørt gjærpulver og bak dette korset i 48 timer ved 26 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, fjern alle foreldrefluene fra hvert hetteglass og returner hetteglassene til 26 grader Celsius inkubator i minst 14 dager. I løpet av 14 dager, som nevnt tidligere samle åtte til 10 kvinnelige jomfruer fra homozygot firefly luciferase rettet mot GRNA linje tre ganger.
Følg trinnet ett kryss hetteglass hver dag for å se om noen nye voksne avkom har dukket opp fra puppene, bedøvet med karbondioksid for å tillate innsamling av fire til fem mannlige fluer som uttrykker både Ubiq CasRx og den doble Luciferase-reporteren som tilgjengelig. Plasser fluene i et nytt hetteglass med 10 Virgin kvinner fra fruktfluen luciferase rettet mot gRNA-linjen, og plasser disse trinn to kryssene ved 26 grader Celsius i 48 timer. Samle ytterligere fem en dag gamle menn som uttrykker både Ubiq CasRx og dual luciferase reporter fra trinnet en krysser hetteglass og inkuberer fluene i to til fire dager alene på 26 grader Celsius før de overføres til en 1,5 milliliter sentrifuge for minus 80 grader Celsius lagring.
På slutten av inkubasjonen, fjern alle foreldrehettene fra hvert av trinn to krysshettene. Og returner hetteglassene til 26 grader Celsius inkubator i minst 20 dager. Vær oppmerksom på trinnet to kryss hetteglass hver dag for å se om noen nye voksne avkom har dukket opp fra kjønnsmedisin, bedøve fluene med karbondioksid som de blir tilgjengelige, og score og bilde deres fenotyper som demonstrert.
Mendelisk genetikk antyder at hvis alle fluene er levedyktige, bør 25% av avkommet uttrykke den målrettede RNA. For å utføre en luciferase-analyse, generer trippeltrans heterozygote fluer så vel som kontrollen flyr som demonstrert. Samle hannen flyr ved fødselen, og aldring dem til tre dager gammel.
Overfør de tre dager gamle fluene til 1,5 milliliter sentrifugerør, og lyse dem ved hjelp av en buffer i luciferase lysis buffer fra et kommersielt tilgjengelig luciferase analysesett. Bruk deretter fem mikroliter lysvev fra hver prøve og luminometer for å måle både fruktfluene og kjørte Luciferase-aktivitet, i henhold til standard luciferaseanalyseprotokoller. F1, trans heterozygot CasRx, har betydelig lavere overlevelsesrate sammenlignet med trans heterozygote dCasRx fluer.
U6 gRNA Y heterozygote fluer bekrefter toksisiteten til Ubiq CasRx-systemet til de tre målgenene, og er ikke levedyktige og vokser ikke utover det andre instar larvalstadiet. De overlevende Ubq CasRx og U6 gRNA W heterozygote fluene, demonstrerer en distinkt fullt penetrant bredøyet fenotype. I tillegg observeres også en betydelig reduksjon av målgentranskripsjoner for tre målgener.
Bevis på off target aktivitet indusert av CasRx observeres også når differensial uttrykte transkripsjoner mellom prøver fra CasRx som uttrykker fluer og prøver fra dCasRx uttrykkende fluer sammenlignes. I totrinnskorset resulterer bare kombinasjonen av alle tre transgenene i en 100% dødelighet. Når vevsspesifikk RNA-målretting ved hjelp av en tre-komponent CasRx-systemdesign brukes, reduseres toksisitetsnivået når det totale CasRx-uttrykket senkes ved hjelp av UAST-promotoren sammenlignet med Ubiq-promotoren.
Det er viktig å sette opp den genetiske prosessen riktig ved hjelp av fluer av riktig kjønn og riktige fenotyper.
