Name: ubiquitous and tissue-specific rna targeting in drosophila melanogaster using crispr/casrx
Uploaded: 2021-02-05T15:00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана финансированием гранта DARPA Safe Genes Program Grant (HR0011-17-2-0047) и наград NIH (R21RAI149161A, DP2AI152071), присужденных O.S.A.

<ol>
	<li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nat Communications. 9, 1911 (2018).</li><li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector.">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), 5573 (2016).</li><li>East-Seletsky, A., O'Connell, M., Burstein, D., Knott, G., Doudna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Targeting+by+Functionally+Orthogonal+Type+VI-A+CRISPR-Cas+Enzymes.">RNA Targeting by Functionally Orthogonal Type VI-A CRISPR-Cas Enzymes.</a> Molecular Cell. 66 (3), 373-383 (2017).</li><li>Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N., Oki, J., Shokhirev, M., Hsu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+Engineering+with+RNA-Targeting+Type+VI-D+CRISPR+Effectors.">Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.</a> Cell. 173 (3), 665-676 (2018).</li><li>Buchman, A., Brogan, D., Sun, R., Yang, T., Hsu, P., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+RNA+Targeting+Using+CasRx+in+Flies.">Programmable RNA Targeting Using CasRx in Flies.</a> The CRISPR Journal. 3 (3), 164-176 (2020).</li><li>Kushawah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas13d+Induces+Efficient+mRNA+Knockdown+in+Animal+Embryos.">CRISPR-Cas13d Induces Efficient mRNA Knockdown in Animal Embryos.</a> Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).</li><li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13.">RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> Nature. 550, 280-284 (2017).</li><li>Perrimon, N., Ni, J., Perkins, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+RNAi:+today+and+tomorrow.">In vivo RNAi: today and tomorrow.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 003640 (2010).</li><li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+resource+of+transgenic+RNAi+lines+for+neurogenetics.">A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics.</a> Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+shRNA+resource+for+transgenic+RNAi+in+Drosophila.">A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila.</a> Nature Methods. 8, 405-407 (2011).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+and+parameters+for+targeted+transgenic+RNA+interference+in+Drosophila+melanogaster.">Vector and parameters for targeted transgenic RNA interference in Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 5, 49-51 (2008).</li><li>Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)+Screening+in+Drosophila.">RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila.</a> Genetics. 208 (3), 853-874 (2018).</li><li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+off-target+effects+associated+with+long+dsRNAs+in+Drosophila+melanogaster+cell-based+assays.">Evidence of off-target effects associated with long dsRNAs in Drosophila melanogaster cell-based assays.</a> Nature Methods. 3, 833-838 (2006).</li><li>Ma, Y., Creanga, A., Lum, L., Beachy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+off-target+effects+in+Drosophila+RNA+interference+screens.">Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens.</a> Nature. 443, 359-363 (2006).</li><li>Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matter+arising:+off-targets+and+genome-scale+RNAi+screens+in+Drosophila.">Matter arising: off-targets and genome-scale RNAi screens in Drosophila.</a> Fly. 1 (1), 1-5 (2007).</li><li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes.">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nature Genetics. 40, 476-483 (2008).</li><li>Champer, J., Buchman, A., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cheating+evolution:+engineering+gene+drives+to+manipulate+the+fate+of+wild+populations.">Cheating evolution: engineering gene drives to manipulate the fate of wild populations.</a> Nature Review Genetics. 17 (3), 146-159 (2016).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+dengue+neutralization+in+mosquitoes+expressing+an+engineered+antibody.">Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody.</a> PLoS Pathogens. 16 (4), 1008103 (2020).</li><li>Mathur, G., Sanchez-Vargas, I., Alvarez, D., Olson, K., Marinotti, O., James, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene-mediated+suppression+of+dengue+viruses+in+the+salivary+glands+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">Transgene-mediated suppression of dengue viruses in the salivary glands of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Insect Molecular Biology. 19 (6), 753-763 (2011).</li><li>Franz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+RNA+interference-based+resistance+to+dengue+virus+type+2+in+genetically+modified+Aedes+aegypti.">Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4198-4203 (2006).</li><li>Yen, P., James, A., Li, J., Chen, C., Failloux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+miRNAs+induce+dual+arboviral-resistance+phenotypes+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Synthetic miRNAs induce dual arboviral-resistance phenotypes in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> Communications Biology. 1, 11 (2018).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Zika+virus+in+transgenic+Aedes+aegypti+expressing+a+polycistronic+cluster+of+synthetic+small+RNAs.">Engineered resistance to Zika virus in transgenic Aedes aegypti expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).</li><li>. Addgene Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/">https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/</a> (2020)</li><li>Gibson, D., Young, L., Chuang, R., Venter, J., Hutchison, C., Smith, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>. Addgene Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr/">https://www.addgene.org/protocols/pcr/</a> (2020)</li><li>. Indiana University Bloomington Available from: <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL</a> (2020)</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Jiang, W., Brueggeman, A., Horken, K., Plucinak, T., Weeks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+transient+expression+of+Cas9+and+single+guide+RNA+genes+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Eukaryotic Cell. 13 (11), 1465-1469 (2014).</li><li>Poe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+CRISPR/Cas9-Mediated+Tissue-Specific+mutagenesis+reveals+gene+redundancy+and+perdurance+in+Drosophila.">Robust CRISPR/Cas9-Mediated Tissue-Specific mutagenesis reveals gene redundancy and perdurance in Drosophila.</a> Genetics. 211 (2), 459-472 (2019).</li><li>Port, F., Chen, H., Lee, T., Bullock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+ger+mLine+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient ger mLine and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 2967-2976 (2014).</li><li>Yang, S., Li, S., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shortening+the+Half-Life+of+Cas9+maintains+its+gene+editing+ability+and+reduces+neuronal+toxicity.">Shortening the Half-Life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity.</a> Cell Reports. 25 (10), 2653-2659 (2018).</li><li>Port, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+resource+for+tissue-specific+CRISPR+mutagenesis+in+Drosophila.">A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila.</a> eLife. 9, 53865 (2020).</li><li>Zhang, X., Tee, L., Wang, X., Huang, Q., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+Effects+in+CRISPR/Cas9-mediated+Genome+Engineering.">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4 (17), 264 (2015).</li><li>Huynh, N., Depner, N., Larson, R., King-Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+toolkit+for+CRISPR-Cas13-based+RNA+manipulation+in+Drosophila.">A versatile toolkit for CRISPR-Cas13-based RNA manipulation in Drosophila.</a> Genome Biology. 21, 279 (2020).</li></ol>

O.S.A является основателем Agragene, Inc., имеет долю в акционерном капитале и входит в состав Научно-консультативного совета компании. Условия этого соглашения были рассмотрены и одобрены Калифорнийским университетом в Сан-Диего в соответствии с его политикой конфликта интересов. Все остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

С тремя различными конструкциями применения системы CasRx эта работа продемонстрировала в вивопрограммируемое нацеливание РНК на мух. Различные стратегии удовлетворяют различные потребности проекта, такие как эндогенное и экзогенное нацеливание на гены и повсеместное и тканеспецифическое нацеливание на РНК. Эффекты нацеливания на РНК включали специфические фенотипические изменения целевого гена, снижение транскрипта целевой РНК и случайные фенотипы летальности, связанные с высокой экспрессией белка CasRx и коллатеральной активностью. В целом, эти результаты показали, что система CasRx способна целенаправленное снижение транскрипта РНК на уровне организма программируемым и эффективным образом.
Одним из ключевых факторов успешной настройки системы CasRx является проектирование гРНК. В частности, следует учитывать следующие рекомендации: целевая последовательность составляет около 30 нуклеотидов в длину, длина поли-U растяжек в целевой последовательности составляет 4 пары оснований или менее, содержание GC целевой последовательности находится в диапазоне 30% - 70%, целевая последовательность не прогнозируется для формирования сильных структур шпильки РНК, а целевая последовательность содержит минимальную прогнозируемую вторичную или третичную структуру РНК5.
В дополнение к конструкциям гРНК, шаг генетики мух в каждом протоколе также имеет решающее значение для успешной реализации. Наличие или отсутствие определенных фенотипов, передаваемых от родителей в потомствах, важно для идентификации и количественной оценки фенотипов, индуцированных системой CasRx у трансгетерозиготных потомков. Кроме того, настройка контрольных скрещиваний с использованием мух dCasRx параллельно также полезна для исключения неспецифических фенотипов у трансгетерозиговых потомков.
Стоит отметить, что эти результаты выявили проблему токсичности, вызванную повсеместной экспрессией белка CasRx и dCasRx в мухе, что является ограничением системы CasRx. Повсеместная экспрессия CasRx или dCasRx только под промотором Ubiq, без гРНК, сопровождалась нетривиальными затратами на приспособленность, поскольку ни мухи Ubiq-CasRx, ни Ubiq-dCasRx не могли быть установлены как гомозиготные линии. Напротив, мухи UASt-CasRx и UASt-dCasRx могут быть установлены как здоровые гомозиготные запасы, хотя из-за конструкции кросс-схемы они были сохранены как двойные сбалансированные запасы, что подтверждает существование токсичности, вызванной повсеместной экспрессией белка CasRx. Еще одно подтверждающее доказательство заключается в том, что в контрольных экспериментах с участием dCasRx, который каталитически неактивен, процент мух, несущих как dCasRx, так и гРНК-конструкции из общего числа мух в поколении F1, был последовательно ниже 50%, соотношение, ожидаемое на основе менделевской генетики, если не было токсичности, связанной с dCasRx. Это указывало на то, что повсеместно экспрессирующая dCasRx вместе с гРНК вызывает токсичность у мухи, что приводит к меньшему, чем ожидалось, соотношению наследования. Коэффициенты наследования трансгетерозиготных мух UASt-dCasRx, gRNA, GAL4 следовали менделевской генетике, что еще раз указывает на токсичность, вызванную именно повсеместной экспрессией белков CasRx и dCasRx. Токсичность в системе CRISPR/Cas не нова. Было показано, что большое количество белка Cas9 токсично в нескольких организмах, включая мух29,30,31,32. Недавнее исследование разработало индивидуальную систему GAL4 / UAS, которая может настраивать количество белка Cas9, экспрессируемого в мухах, добавляя открытый кадр считывания различной длины между последовательностью UAS и последовательностью Cas9 в конструкции UAS-Cas933. Поэтому стоит изучить способы снижения токсичности, вызванной CasRx, путем настройки уровня экспрессии белка CasRx.
Помимо токсичности, вызванной повсеместной экспрессией белков CasRx и dCasRx, результаты также показали летальность, связанную с неспецифическими побочными эффектами системы CasRx вне цели, что характерно для многих систем CRISPR1,2,7,34. У некоторых CasRx и несущественных генов гРНК-экспрессирующих двойных или тройных трансгетерозиговых мух, например, при нацеливании на Notch, трансгетерозиготные мухи CasRx имеют значительно более низкие уровни выживаемости по сравнению с трансгетерозгическими мухами dCasRx. В анализе RNA-seq этих CasRx и гРНК-экспрессирующих трансгетерозиготных мух наблюдалось как снижение уровней транскриптов генов-мишеней, так и снижение транскриптов нецелевых генов. Эти побочные эффекты были CasRx-зависимыми и целевыми, поскольку они наблюдались только у трансгетерозиготных мух, экспрессирующих как белок CasRx, так и гРНК. Стоит отметить, что один из генов-мишеней, белый, показал лишь ограниченное, нестатистически значимое снижение транскриптов, когда белый ген был нацелен casRx, что контрастировало с четким фенотипом восстановления пигмента. Предполагается, что это может быть связано с тем, что 1) сроки сбора образцов РНК-seq не были хорошо согласованы со сроками, когда белый ген достигает своей пиковой экспрессии во время раннего развития, и 2) локализованная экспрессия белого гена в глазах затрудняет сбор соответствующих тканей на ранней стадии развития, когда возможен только сбор образцов всего тела. Чтобы снизить коллатеральную активность в системе CasRx, необходимы будущие исследования, чтобы полностью понять механизмы, лежащие в основе системы нецелевых явлений на уровне организма.
Интересно, что недавнее исследование35 , описывающее инструменты Cas13, нацеленные на РНК у мух, по-видимому, улучшает общую токсичность, связанную с экспрессией CasRx, по нескольким возможным причинам. Во-первых, авторы перекодировали трансгены Cas13 для оптимизации экспрессии у дрозофилы и использовали более слабо экспрессирующий промотор (актин 5C) по сравнению с промотором убиквитина, используемым в настоящем исследовании, что, вероятно, привело к снижению уровня экспрессии Cas13 и, следовательно, меньшей токсичности. Действительно, это подтверждается наблюдениями о том, что экспрессия CasRx и dCasRx, управляемая UASt, сама по себе не была токсичной, поскольку это исследование (и авторы в 35) не наблюдали какой-либо очевидной летальности у мух UASt-CasRx. Кроме того, эти авторы кодировали свои гРНК по-разному по сравнению с этим исследованием, что, возможно, повлияло на их экспрессию и снизило токсичность системы у трансгетерозиготных мух Cas13 / gRNA. Например, в их исследовании две гРНК были экспрессированы с использованием промотора U6: 3 и окружены тРНК, чтобы обеспечить обработку гРНК при созревании тРНК без необходимости CasRx35. И наоборот, в этом исследовании гРНК были закодированы как массивы, нацеленные на до 4 мест на ген и имитирующие эндогенную структуру массива Cas13, обнаруженную у бактерий, которая требует фермента Cas13 для обработки каждой гРНК. Эти различные подходы, возможно, привели к различиям в уровнях экспрессии гРНК и других факторах, которые могут оказывать неотъемлемое влияние на токсичность всей системы. Наконец, Huynh et al. нацелились на гены, отличные от тех, которые были нацелены в настоящем исследовании, что приводит к различиям во взаимодействии мишени Cas / gRNA и коллатеральной активности и может оказывать влияние на наблюдаемые уровни летальности. Эти различия в наблюдаемой токсичности требуют дальнейшего изучения для выявления способов улучшения общих систем.
В целом, это исследование является первой демонстрацией функциональной генетически закодированной программируемой системы Cas, нацеленной на РНК, в D. melanogaster, хотя дальнейшая оптимизация системы CasRx (в соответствии с тем, что сообщается35) потребуется для дальнейшего снижения летальности вне цели и повышения эффективности расщепления CasRx на цели. РНК-таргетинг с ферментами Cas является быстро развивающейся областью со многими потенциальными приложениями, начиная от борьбы с насекомыми-переносчиками до терапевтического использования1,2,3,4,5,6,7, и этот протокол предлагает стартовый пакет для всех, кто заинтересован в разработке своей первой системы CasRx на мухах, будучи совместимым с настройкой и дальнейшей оптимизацией системы. Примеры, представленные здесь, демонстрируют ряд результатов, с которыми можно столкнуться при внедрении этой системы in vivo, и могут служить ориентирами для других пользователей при оценке производительности системы CasRx в их приложениях.

С момента появления технологий Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) основное внимание в этой области было сосредоточено на редактировании ДНК, которое предлагает преобразующие приложения в медицине и биотехнологии1. Однако постоянное изменение последовательностей ДНК не всегда желательно из-за этических соображений. В свете этого недавние исследования начали разработку инструментов на основе CRISPR для нацеливания на РНК и продемонстрировали, что технологии CRISPR действительно могут быть использованы для нацеливания на РНК в различных биологических системах2,3,4,5,6,7. Во многих из этих протестированных систем в настоящее время широко используемым подходом к нацеливанию на РНК и восстановление транскрипта является РНК-интерференция (РНКи), которая далека от совершенства, часто демонстрируя различную эффективность и высокую нецелевую активность при использовании в vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Поэтому, учитывая статус этих технологий, стоит дополнительно изучить потенциал инструментов на основе CRISPR для таргетинга на РНК.
В одном известном недавнем исследовании сообщалось, что рибонуклеаза CasRx, член класса Cas13d, может эффективно снижать уровни транскриптов генов в культуре клеток человека и обладает привлекательным нецелевым профилем4. Это открытие привело к вопросу о том, может ли эта новая рибонуклеаза поддерживать свою эффективность и низкую нецелевую скорость для РНК- таргетирования на уровне организма. Недавнее исследование решило этот вопрос, показав, что система CasRx может быть использована для достижения повсеместного и тканеспецифического снижения транскрипта гена у Drosophila melanogaster5.
Чтобы упростить удобство использования этого недавно опубликованного подхода, этот протокол детализирует методы из этой недавней работы, которая состоит из трех основных частей: 1) повсеместное нацеливание на РНК in vivo с использованием двухкомпонентной системы CasRx; 2) повсеместное in vivo экзогенное нацеливание на РНК с использованием трехкомпонентной системы CasRx; и 3) тканеспецифическое нацеливание на РНК vivo с использованием трехкомпонентной системы CasRx.
Были разработаны направляющие РНК (гРНК), нацеленные на различные гены-мишени под контролем вездесущего промотора, и были сгенерированы линии мух, экспрессирующие эти гРНК-содержащие конструкции. Также были спроектированы конструкции CasRx под управлением либо вездесущего промотора, либо промотора условной последовательности активации (UASt), активируемого фактором транскрипции GAL4, и были сгенерированы летающие линии, содержащие эти CasRx-содержащие конструкции. Каталитически неактивные конструкции CasRx, dCasRx, были разработаны и использованы в качестве отрицательных элементов управления. Повсеместное нацеливание РНК на мух достигается путем пересечения гРНК-экспрессирующих линий мух с вездесущими CasRx-экспрессирующими линиями мух. Потомство, экспрессирующее как конструкцию гРНК, нацеленную на конкретный транскрипт гена, так и белок CasRx, имеет повсеместное сокращение целевых транскриптов генов. Тканеспецифическое нацеливание РНК у мух достигается путем первого скрещивания гРНК-экспрессирующих мух с UASt-CasRx экспрессирующими мухами, получая трансгетерозиготных мух, несущих как гРНК, так и конструкции UASt-CasRx. Такие мухи, в свою очередь, скрещиваются с тканеспецифическими GAL4-экспрессирующими мухами, что приводит к генерации тканеспецифической экспрессии CasRx и РНК-таргетинга у мух.
Программируемый характер системы CasRx предлагает возможность настройки и оптимизации для достижения высокой эффективности и низкой внецелевой активности для таргетирования РНК in vivo. Потенциальные применения РНК-таргетинга на основе CRISPR многочисленны, включая замену РНКi в лаборатории и содействие борьбе с насекомыми-переносчиками в дикой природе. Из последних одной из глобальных неудовлетворенных потребностей является разработка эффективных средств борьбы с инфекциями РНК-вирусов, передаваемых через комаров. Многие РНК-вирусы, такие как вирус денге, Зика и чикунгунья, передаются через комаров, влияя на здоровье человека и способствуя смертности. Было внесено много предложений по созданию популяций комаров с устойчивостью к вирусам для профилактики заболеваний; однако ни одна современная технология не способна сделать комаров одновременно устойчивыми ко всем значимым РНК-вирусам18,19,20,21,22,23. Системы Cas, нацеленные на РНК, могут обеспечить отправную точку для такой технологии, обеспечив программируемую платформу для нацеливания на все РНК-вирусы, переносимые комарами.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% Grape Juice</td>
			<td>Welch Foods Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Active Dry Yeast (908g)</td>
			<td>Red Star Yeast Company, LLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 color camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMC4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAL4-GMR flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>29967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAL4-y flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>44373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glomax 20/20 Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 Sequencer</td>
			<td>Illumina, Inc.</td>
			<td>HiSeq2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165FC fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>NDONEC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>E7770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 112686</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 112688</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132416</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132417</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132419</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132420</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132421</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132422</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132425</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132426</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 133304</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 164586</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>164586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid #132418</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pJFRC81</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases AscI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0558L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases NotI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases PacI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0547L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases PstI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0140L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases SwaI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0604L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases XbaI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0145L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo DNase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-Fluc flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-N flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-w flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-y flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UASt-CasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UASt-dCasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiq-CasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiq-dCasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kits</td>
			<td>Zymo Research Corporation</td>
			<td>D4007</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ubiquitous and tissue-specific rna targeting in drosophila melanogaster using crispr/casrx

CasRx, член семейства CAS13, нацеленных на РНК, является многообещающим новым дополнением технологий CRISPR / Cas в эффективном восстановлении транскриптов генов с привлекательным нецелевым профилем как на клеточном, так и на организменном уровнях. Недавно сообщалось, что система CRISPR/ CasRx может быть использована для достижения повсеместного и тканеспецифического снижения транскрипта гена у Drosophila melanogaster. В этой статье подробно описываются методы из недавней работы, состоящие из трех частей: 1) повсеместное in vivo эндогенное нацеливание на РНК с использованием двухкомпонентной системы CasRx; 2) повсеместное in vivo экзогенное нацеливание на РНК с использованием трехкомпонентной системы CasRx; и 3) тканеспецифическое нацеливание на РНК in vivo с использованием трехкомпонентной системы CasRx. Наблюдаемые эффекты таргетирования РНК включают целевые ген-специфические фенотипические изменения, снижение транскрипта целевой РНК и случайные фенотипы летальности, связанные с высокой экспрессией белка CasRx и коллатеральной активностью. В целом, эти результаты показали, что система CasRx способна нацеливаться на восстановление транскрипта РНК на уровне организма программируемым и эффективным образом, демонстрируя, что нацеливание на транскриптом in vivo и инженерия осуществимы и закладывают основу для будущих технологий таргетирования РНК на основе IN VIVO CRISPR.

Watch this Scientific Journal Video about Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx at JoVE.com

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

В этой статье описывается подробный протокол использования фермента Cas13D, нацеленного на РНК (RfxCas13D) у мух.

Повсеместный и тканеспецифический таргетинг РНК у Drosophila Melanogaster с использованием CRISPR / CasRx

CasRx, a member of the RNA-targeting Cas13 family, is a promising new addition of the CRISPR/Cas technologies in efficient gene transcript reduction with ...

Как показывает наш протокол, технологии CRISPR CasRx могут быть использованы для достижения повсеместного и тканеспецифического снижения транскрипта генов у плодовых мушек. Наша методика предлагает стартовый пакет для всех, кто заинтересован в использовании редукции транскрипта генов у плодовых мушек на основе CRISPR, будучи совместимым с дальнейшей настройкой и оптимизацией. Чтобы создать вездесущую РНК-таргетинг in vivo с использованием двухкомпонентной системы CasRx, соберите 10 девственных взрослых самок мух из гомозиготной линии гРНК и пять взрослых самцов мух из сбалансированного гетерозиготного Ubiq CasRx CurlyO.Поместите родительских мух в флакон, дополненный 100 микрограммами сухого дрожжевого порошка, и задней части флаконов в течение 48 часов при температуре 26 градусов цельсия. Наблюдайте за флаконами каждый день, чтобы увидеть, появилось ли какое-либо новое взрослое потомство из лобка поколения F1, и обезболивайте кого-либо из взрослых углекислым газом в течение 10 секунд. Как только мухи становятся неподвижными, опустошите флакон на подушке, соединенной с резервуаром с углекислым газом с непрерывным углекислым газом, и используйте цветную камеру, подключенную к флуоресцентному стереомикроскопу, чтобы оценить и визуализировать фенотипы мух.Затем подсчитайте количество потомства с различными фенотипами, в соответствии с экспрессией флуоресцентного сигнала. Основываясь на менделевской генетике, ожидается, что 50% потомства экспрессируют целевую РНК. Обратите внимание, что токсичность системы Ubiq CasRx может снизить отношение целевой РНК, экспрессирующей потомство, до менее чем 50% Чтобы создать вездесущую экзогенную РНК-нацеленность in vivo с использованием трехкомпонентной системы CasRx, соберите от восьми до 10 взрослых самок Virgin с двойной экспрессирующей линии люциферазы и от четырех до пяти взрослых самцов мух из сбалансированного гетерозиготного Ubiq CasRx Curly plus TM6, Линия STB, которая демонстрирует белые глаза, кудрявые крылья и красную флуоресценцию одновременно.Поместите родительский шаг один крест в флакон, дополненный 100 микрограммами сухого дрожжевого порошка, и задней части этого креста в течение 48 часов при 26 градусах Цельсия. В конце инкубации удалите всех родительских мух из каждого флакона и верните флаконы в инкубатор с температурой 26 градусов Цельсия в течение не менее 14 дней. В течение 14 дней, как упоминалось ранее, соберите от восьми до 10 женщин-девственниц из гомозиготной люциферазы светлячка, нацеленной на линию гРНК три раза.Наблюдайте за первым шагом перекрестных флаконов каждый день, чтобы увидеть, появились ли какие-либо новые взрослые потомки из куколок, обезболивая углекислым газом, чтобы позволить собрать от четырех до пяти самцов мух, экспрессирующих как Ubiq CasRx, так и двойной репортер Люциферазы, как доступно. Поместите мух в новый флакон с 10 девственными самками из люциферазы плодовой мухи, нацеленной на линию гРНК, и поместите эти промежуточные два креста при 26 градусах Цельсия в течение 48 часов. Соберите еще пять однодневных самцов, выражающих как Ubiq CasRx, так и двойной репортер люциферазы из флаконов первого шага и высиживайте мух в течение двух-четырех дней в одиночку при 26 градусах Цельсия, прежде чем перенести их в центрифугу с диагональю 1,5 миллилитра для хранения минус 80 градусов по Цельсию.В конце инкубации извлеките все родительские флаконы из каждого из двух поперечных флаконов. И вернуть флаконы в инкубатор при температуре 26 градусов Цельсия не менее чем на 20 дней. Наблюдайте за вторым шагом перекрестных флаконов каждый день, чтобы увидеть, появилось ли какое-либо новое взрослое потомство из лобка, обезболивая мух углекислым газом по мере их появления, а также оценивая и визуализируя их фенотипы, как показано.Менделевская генетика предполагает, что, если все мухи жизнеспособны, 25% потомства должны экспрессировать целевую РНК. Чтобы выполнить анализ люциферазы, сгенерируйте тройные транс-гетерозиготные мухи, а также контрольные мухи, как показано. Собирая самцов мух при рождении, и старейте их до трехдневного возраста.Переведите трехдневных мух в 1,5-миллилитровые центрифужные трубки и лизируйте их, используя буфер в буфере лизиса люциферазы из коммерчески доступного набора для анализа люциферазы. Затем используйте пять микролитров лизированной ткани из каждого образца и люминометра, чтобы измерить как плодовых мушек, так и активность люциферазы, в соответствии со стандартными протоколами анализа люциферазы. F1, транс-гетерозиготные CasRx, имеют значительно более низкие показатели выживаемости по сравнению с транс-гетерозиготными мухами dCasRx.Подтверждая токсичность системы Ubiq CasRx трех генов-мишеней, гетерозиготные мухи U6 gRNA Y нежизнеспособны и не растут за пределами второй личиночной стадии. Выжившие гетерозиготные мухи Ubq CasRx и U6 gRNA W демонстрируют отчетливый полностью проникающий широкоглазый фенотип. Кроме того, также наблюдается значительное снижение транскриптов генов-мишеней для трех генов-мишеней.Доказательства нецелевой активности, индуцированной CasRx, также наблюдаются при сравнении дифференциальных экспрессированных транскриптов между образцами из CasRx, экспрессирующими мухи, и образцами из dCasRx,экспрессирующих мух. В двухступенчатом кроссе только комбинация всех трех транс-генов приводит к 100% летальности. Когда используется тканеспецифическое нацеливание РНК с использованием трехкомпонентной конструкции системы CasRx, уровень токсичности снижается, когда общая экспрессия CasRx снижается с помощью промотора UAST по сравнению с промотором Ubiq.Важно правильно настроить генетический процесс, используя мух правильного пола и правильных фенотипов.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Скрининг на хост факторов, участвующих в Vaccinia Вирусной инфекции использованием Drosophila Ячейки

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

RNA Interference in Ticks

РНК-интерференция в клещи

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Использование РНК-интерференции по расследованию врожденного иммунного ответа у мышей макрофагов

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Нуклеокапсидные отжига опосредованная электрофореза (NAME) Анализ позволяет быстро выявлять ВИЧ-1 нуклеокапсидные ингибиторов

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Системная бактериальная инфекция и иммунная Фенотипы обороны в<em&gt; Дрозофилы</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

В Ситу обнаружения бактерий внутри парафин тканей с использованием дигоксина меченных ДНК зонд таргетинга 16S рРНК

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Ориентация биопленки Associated<em&gt; Стафилококк</em&gt; Использование ресазурин На основе лекарственной чувствительности анализа

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Целеуказание тиолы цистеина в Vitro участкам гликозилирования рекомбинантных белков

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Извлечение Hemocytes из личинки Drosophila melanogaster микробной инфекции и анализа

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Создание вирусной инфекции и анализа взаимодействия хост вирус в Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...