Som vårt protokoll visar kan CRISPR CasRx-teknik användas för att uppnå allestädes närvarande och vävnadsspecifika genutskriftsminskningar hos fruktflugor. Vår teknik erbjuder ett startpaket för alla som är intresserade av att använda CRISPR-baserad genavskriftsreduktion i fruktflugor samtidigt som den är kompatibel med ytterligare anpassning och optimering. För att sätta upp en allestädes närvarande in vivo RNA-inriktning med hjälp av ett tvåkomponent CasRx-system, samla 10 jungfruliga vuxna kvinnliga flugor från den homozygous gRNA-linjen av intresse och fem vuxna manliga flugor från den balanserade heterozygous Ubiq CasRx CurlyO.
Placera föräldraflugorna i en flaska kompletterad med 100 mikrogram torrt jästpulver och upp injektionsflaskan i 48 timmar vid 26 grader Celsius. Observera injektionsflaskan varje dag för att se om någon ny vuxen avkomma har uppstått från F1-generationens pubic och bedöva någon av vuxna med koldioxid i 10 sekunder. När flugorna blir orörliga tömmer injektionsflaskan på en flugdyna ansluten till koldioxidtanken med kontinuerlig koldioxid och använder en färgkamera ansluten till ett fluorescerande stereomikroskop för att få poäng och avbilda flugornas fenotyper.
Räkna sedan antalet avkommor med olika fenotyper, enligt det fluorescerande signaluttrycket. Baserat på mendeliangenetik förväntas 50% av avkomman uttrycka det riktade RNA. Observera att toxiciteten hos Ubiq CasRx-systemet kan minska förhållandet mellan riktat RNA som uttrycker avkomma till mindre än 50%För att ställa in en allestädes närvarande in vivo exogen RNA-inriktning med hjälp av ett trekomponent CasRx-system, samla åtta till tio jungfruliga vuxna kvinnliga flugor från en dubbel luciferas expresslinje och fyra till fem vuxna manliga flugor från den balanserade heterozygous Ubiq CasRx Curly plus TM6, STB-linje som uppvisar vita ögon, lockiga vingar och ds röd fluorescens samtidigt.
Placera föräldrasteget en cross-by i en flaska kompletterad med 100 mikrogram torrt jästpulver och baksida detta kors i 48 timmar vid 26 grader Celsius. I slutet av inkubationen, ta bort alla föräldraflugor från varje flaska och returnera injektionsflaskan till 26 grader Celsius-inkubatorn i minst 14 dagar. Under loppet av 14 dagar, som nämnts tidigare samla åtta till 10 kvinnliga oskulder från den homozygous firefly luciferase inriktning gRNA linje tre gånger.
Observera steg ett kors injektionsflaska varje dag för att se om några nya vuxna avkommor har uppstått från poppen, bedövas med koldioxid för att tillåta insamling av fyra till fem manliga flugor som uttrycker både Ubiq CasRx och den dubbla Luciferase reportern som tillgänglig. Placera flugorna i en ny flaska med 10 jungfruliga honor från fruktflugan luciferas som riktar sig mot gRNA-linjen och placera dessa steg två kors vid 26 grader Celsius i 48 timmar. Samla ytterligare fem en dag gamla män som uttrycker både Ubiq CasRx och dubbel luciferasreporter från steg ett kors injektionsflaska och inkubera flugorna i två till fyra dagar ensamma vid 26 grader Celsius innan de överförs till en 1,5 milliliter centrifug för minus 80 grader Celsius lagring.
I slutet av inkubationen tar du bort alla föräldraflaska från var och en av steg två kors injektionsflaskan. Och returnera injektionsflaskan till 26 grader Celsius inkubatorn i minst 20 dagar. Observera steg två kors injektionsflaska varje dag för att se om någon ny vuxen avkomma har dykt upp från pubic, bedöva flugorna med koldioxid när de blir tillgängliga, och poängsättning och bildframställning deras fenotyper som visats.
Mendelian genetik föreslår att, om alla flugor är livskraftiga, 25% av avkomman bör uttrycka det riktade RNA. För att utföra en luciferasanalys, generera de trippel trans heterozygous flugorna samt kontrollflugorna som visats. Samla hanen flyger vid födseln och åldring dem tills de är tre dagar gamla.
Överför de tre dagar gamla flugorna till 1,5 milliliter centrifugrör och lyse dem med hjälp av en buffert i luciferaslysbufferten från ett kommersiellt tillgängligt luciferasanalyskit. Använd sedan fem mikroliter av lysad vävnad från varje prov och luminometer för att mäta både fruktflugorna och körde Luciferasaktivitet, enligt standard luciferasanalysprotokoll. F1, trans heterozygous CasRx, har betydligt lägre överlevnad jämfört med trans heterozygous dCasRx flugor.
Bekräftar toxiciteten hos Ubiq CasRx-systemet för de tre målgenerna, U6 gRNA Y heterozygous flugor är icke-viabla och växer inte bortom det andra instar larvstadiet. De överlevande Ubq CasRx och U6 gRNA W heterozygous flugor, visa en distinkt helt penetrant bredögd fenotyp. Dessutom observeras en signifikant minskning av målgenutskrifter för tre målgener.
Tecken på off target-aktivitet som induceras av CasRx observeras också när differentiella uttryckta transkriptioner mellan prover från CasRx som uttrycker flugor och prover från dCasRx-uttrycksflugor jämförs. I tvåstegskorset resulterar endast kombinationen av alla tre transgeneren i en 100% dödlighet. När vävnadsspecifikt RNA-mål med hjälp av en trekomponent CasRx-systemdesign används, reduceras toxicitetsnivån när det övergripande CasRx-uttrycket sänks med UAST-promotorn jämfört med Ubiq-promotorn.
Det är viktigt att ställa in den genetiska processen korrekt med flugor av korrekt kön och korrekta fenotyper.
