Name: ubiquitous and tissue-specific rna targeting in drosophila melanogaster using crispr/casrx
Uploaded: 2021-02-05T15:00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx at JoVE.com

Bu çalışma kısmen DARPA Güvenli Genler Programı Hibesi (HR0011-17-2-0047) ve O.S.A.'ya verilen NIH ödülleri (R21RAI149161A, DP2AI152071) tarafından finanse edildi.

<ol>
	<li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nat Communications. 9, 1911 (2018).</li><li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector.">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), 5573 (2016).</li><li>East-Seletsky, A., O'Connell, M., Burstein, D., Knott, G., Doudna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Targeting+by+Functionally+Orthogonal+Type+VI-A+CRISPR-Cas+Enzymes.">RNA Targeting by Functionally Orthogonal Type VI-A CRISPR-Cas Enzymes.</a> Molecular Cell. 66 (3), 373-383 (2017).</li><li>Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N., Oki, J., Shokhirev, M., Hsu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+Engineering+with+RNA-Targeting+Type+VI-D+CRISPR+Effectors.">Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.</a> Cell. 173 (3), 665-676 (2018).</li><li>Buchman, A., Brogan, D., Sun, R., Yang, T., Hsu, P., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+RNA+Targeting+Using+CasRx+in+Flies.">Programmable RNA Targeting Using CasRx in Flies.</a> The CRISPR Journal. 3 (3), 164-176 (2020).</li><li>Kushawah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas13d+Induces+Efficient+mRNA+Knockdown+in+Animal+Embryos.">CRISPR-Cas13d Induces Efficient mRNA Knockdown in Animal Embryos.</a> Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).</li><li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13.">RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> Nature. 550, 280-284 (2017).</li><li>Perrimon, N., Ni, J., Perkins, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+RNAi:+today+and+tomorrow.">In vivo RNAi: today and tomorrow.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 003640 (2010).</li><li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+resource+of+transgenic+RNAi+lines+for+neurogenetics.">A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics.</a> Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+shRNA+resource+for+transgenic+RNAi+in+Drosophila.">A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila.</a> Nature Methods. 8, 405-407 (2011).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+and+parameters+for+targeted+transgenic+RNA+interference+in+Drosophila+melanogaster.">Vector and parameters for targeted transgenic RNA interference in Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 5, 49-51 (2008).</li><li>Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)+Screening+in+Drosophila.">RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila.</a> Genetics. 208 (3), 853-874 (2018).</li><li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+off-target+effects+associated+with+long+dsRNAs+in+Drosophila+melanogaster+cell-based+assays.">Evidence of off-target effects associated with long dsRNAs in Drosophila melanogaster cell-based assays.</a> Nature Methods. 3, 833-838 (2006).</li><li>Ma, Y., Creanga, A., Lum, L., Beachy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+off-target+effects+in+Drosophila+RNA+interference+screens.">Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens.</a> Nature. 443, 359-363 (2006).</li><li>Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matter+arising:+off-targets+and+genome-scale+RNAi+screens+in+Drosophila.">Matter arising: off-targets and genome-scale RNAi screens in Drosophila.</a> Fly. 1 (1), 1-5 (2007).</li><li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes.">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nature Genetics. 40, 476-483 (2008).</li><li>Champer, J., Buchman, A., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cheating+evolution:+engineering+gene+drives+to+manipulate+the+fate+of+wild+populations.">Cheating evolution: engineering gene drives to manipulate the fate of wild populations.</a> Nature Review Genetics. 17 (3), 146-159 (2016).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+dengue+neutralization+in+mosquitoes+expressing+an+engineered+antibody.">Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody.</a> PLoS Pathogens. 16 (4), 1008103 (2020).</li><li>Mathur, G., Sanchez-Vargas, I., Alvarez, D., Olson, K., Marinotti, O., James, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene-mediated+suppression+of+dengue+viruses+in+the+salivary+glands+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">Transgene-mediated suppression of dengue viruses in the salivary glands of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Insect Molecular Biology. 19 (6), 753-763 (2011).</li><li>Franz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+RNA+interference-based+resistance+to+dengue+virus+type+2+in+genetically+modified+Aedes+aegypti.">Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4198-4203 (2006).</li><li>Yen, P., James, A., Li, J., Chen, C., Failloux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+miRNAs+induce+dual+arboviral-resistance+phenotypes+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Synthetic miRNAs induce dual arboviral-resistance phenotypes in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> Communications Biology. 1, 11 (2018).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Zika+virus+in+transgenic+Aedes+aegypti+expressing+a+polycistronic+cluster+of+synthetic+small+RNAs.">Engineered resistance to Zika virus in transgenic Aedes aegypti expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).</li><li>. Addgene Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/">https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/</a> (2020)</li><li>Gibson, D., Young, L., Chuang, R., Venter, J., Hutchison, C., Smith, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>. Addgene Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr/">https://www.addgene.org/protocols/pcr/</a> (2020)</li><li>. Indiana University Bloomington Available from: <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL</a> (2020)</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Jiang, W., Brueggeman, A., Horken, K., Plucinak, T., Weeks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+transient+expression+of+Cas9+and+single+guide+RNA+genes+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Eukaryotic Cell. 13 (11), 1465-1469 (2014).</li><li>Poe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+CRISPR/Cas9-Mediated+Tissue-Specific+mutagenesis+reveals+gene+redundancy+and+perdurance+in+Drosophila.">Robust CRISPR/Cas9-Mediated Tissue-Specific mutagenesis reveals gene redundancy and perdurance in Drosophila.</a> Genetics. 211 (2), 459-472 (2019).</li><li>Port, F., Chen, H., Lee, T., Bullock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+ger+mLine+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient ger mLine and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 2967-2976 (2014).</li><li>Yang, S., Li, S., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shortening+the+Half-Life+of+Cas9+maintains+its+gene+editing+ability+and+reduces+neuronal+toxicity.">Shortening the Half-Life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity.</a> Cell Reports. 25 (10), 2653-2659 (2018).</li><li>Port, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+resource+for+tissue-specific+CRISPR+mutagenesis+in+Drosophila.">A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila.</a> eLife. 9, 53865 (2020).</li><li>Zhang, X., Tee, L., Wang, X., Huang, Q., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+Effects+in+CRISPR/Cas9-mediated+Genome+Engineering.">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4 (17), 264 (2015).</li><li>Huynh, N., Depner, N., Larson, R., King-Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+toolkit+for+CRISPR-Cas13-based+RNA+manipulation+in+Drosophila.">A versatile toolkit for CRISPR-Cas13-based RNA manipulation in Drosophila.</a> Genome Biology. 21, 279 (2020).</li></ol>

O.S.A. Agragene, Inc.'in kurucusudur, özkaynak menfaati vardır ve şirketin Bilimsel Danışma Kurulu'nda görev yapmaktadır. Bu düzenlemenin şartları, Kaliforniya Üniversitesi, San Diego tarafından çıkar çatışması politikalarına uygun olarak gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Diğer tüm yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

CasRx sisteminin üç farklı uygulama tasarımı ile bu çalışma, sineklerde vivoprogramlanabilir RNA hedeflemesini gösterdi. Farklı stratejiler, endojen ve eksojen gen hedeflemesi ve dokuya özgü RNA hedeflemesi gibi farklı proje ihtiyaçlarına hitap eder. RNA hedeflemesinin etkileri arasında hedef gen spesifik fenotipik değişiklikler, hedef RNA transkript azaltma ve casrx proteininin yüksek ekspresyumu ve kollateral aktivite ile ilişkili zaman zaman ölümcüllük fenotipleri yer aldı. Genel olarak, bu sonuçlar CasRx sisteminin organizma düzeyinde RNA transkript azaltmayı programlanabilir ve verimli bir şekilde hedefleyebildiğini göstermiştir.
CasRx sisteminin başarılı bir şekilde özelleştirilmesindeki temel faktörlerden biri gRNA'ların tasarımıdır. Özellikle, aşağıdaki tavsiyelere dikkat edilmelidir: hedef sıra yaklaşık 30 nükleotit uzunluğundadır, hedef dizideki poli-U esnemelerinin uzunluğu 4 baz çift veya daha azdır, hedef dizi GC içeriği% 30 - % 70 aralığındadır, hedef sıranın güçlü RNA saç tokası yapıları oluşturacağı tahmin edilmemiştir ve hedef dizi minimum tahmin edilen RNA ikincil veya üçüncül yapı içerir5.
GRNA tasarımlarına ek olarak, her protokoldeki sinek genetiği adımı da başarılı bir uygulamada kritik öneme sahiptir. Soylardaki ebeveynlerden aktarılan tanımlanmış fenotiplerin varlığı veya eksikliği, transtereroziplerde CasRx sistemi tarafından indüklenen fenotiplerin tanımlanması ve ölçülmesi için önemlidir. Ayrıca, dCasRx sineklerini paralel olarak kullanarak kontrol haçlarının kurulması, transheterozipöz soylardaki spesifik olmayan fenotiplerin e elenmesinde de yararlıdır.
Bu sonuçların, CasRx sisteminin bir sınırlaması olan sinekte CasRx ve dCasRx proteinini her yerde ifade ederek ortaya çıkan toksisite sorununu ortaya çıkardığına dikkat etmek gerekir. Sadece Ubiq promotörü altında CasRx veya dCasRx'in her yerde ifade edilmesi, gRNA'lar olmadan, ne Ubiq-CasRx ne de Ubiq-dCasRx sinekleri homozigous çizgiler olarak kurulamadığı için önemsiz fitness maliyetleriyle birlikte geldi. Aksine, UASt-CasRx ve UASt-dCasRx sinekleri sağlıklı homozigöz stoklar olarak kurulabilir, ancak çapraz şemanın tasarımı nedeniyle çift dengeli stoklar olarak tutulurlar, bu da her yerde bulunan CasRx protein ekspresyonunun neden olduğu toksisitenin varlığını destekleyen bir gerçektir. Bir başka destekleyici kanıt, katalize olarak aktif olmayan dCasRx'i içeren kontrol deneylerinde, F1 neslindeki toplam sinek sayısından hem dCasRx hem de gRNA yapılarını taşıyan sineklerin yüzdelerinin sürekli olarak% 50'den düşük olduğu, dCasRx ile ilişkili toksisite yoksa Mendelian genetiğine dayanarak beklenen oranın. Bu, her yerde ifade edilen dCasRx'in gRNA'larla birlikte uçucuda toksisiteye neden olduğunu ve beklenen kalıtım oranının daha az olduğunu gösterdi. Transheterozigöz UASt-dCasRx, gRNA, GAL4 sineklerinin kalıtım oranları, özellikle CasRx ve dCasRx proteinlerinin her yerde ifade edilen toksisitesini düşündüren Mendelian genetiğini takip etti. CRISPR/Cas sisteminde toksisite yeni değildir. Yüksek miktarda Cas9 proteininin sinekler de dahil olmak üzere çeşitli organizmalarda toksik olduğu gösterilmiştir29,30,31,32. Yeni bir çalışma, UAS dizisi ile UAS-Cas9 yapısı33'teki Cas9 dizisi arasında değişen uzunlukta bir açık okuma çerçevesi ekleyerek sineklerde ifade edilen Cas9 protein miktarını ayarlayabilen özelleştirilmiş bir GAL4 /UAS sistemi geliştirmiştir. Bu nedenle, CasRx protein ekspresyon seviyesini ayarlayarak CasRx kaynaklı toksisiteyi azaltmanın yollarını araştırmaya değer.
CasRx ve dCasRx proteinlerinin her yerde ifade edilen toksisitesi dışında, sonuçlar casrx sisteminin spesifik olmayan kollateral hedef dışı etkilerine bağlı ölümcüllük gösterdi, birçok CRISPR sisteminin bir özelliği1,2,7,34. CasRx ve gerekli olmayan gen gRNA ifade eden çift veya üçlü transheterozigöz sineklerin bazılarında, örneğin Çentik hedeflendiğinde, transheterozigous CasRx sinekleri transheterozgyous dCasRx sineklerine kıyasla önemli ölçüde daha düşük sağkalım oranlarına sahiptir. Bu CasRx ve gRNA eksprese edici transheterozipöz sineklerin RNA-seq analizinde hem hedef gen transkript seviyelerinin azalması hem de hedef dışı gen transkriptlerinin azalması gözlenmiştir. Bu kollateral etkiler CasRx'e bağımlı ve hedefe bağımlıydı, çünkü sadece Hem CasRx proteinini hem de gRNA'yı ifade eden transheterozigöz sineklerde gözlendiler. Hedef genlerden biri olan beyazın, beyaz gen CasRx tarafından hedeflendiğinde transkriptlerde sadece sınırlı, istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir azalma gösterdiğini ve bunun açık pigment azaltma fenotipinin aksine olduğunu belirtmek gerekir. Bunun, 1) RNA-seq örnek toplamanın zamanlamasının, beyaz genin erken gelişim sırasında en yüksek ifadeye ulaştığı zaman zamanlaması ile iyi hizalanmamış olması ve 2) beyaz genin gözlerdeki lokalize ifadesinin, sadece tüm vücut örneği toplamanın mümkün olduğu erken gelişim aşamasında ilgili dokuların toplanmasını zorlaştırdığı varsayımında bulunur. CasRx sistemindeki ikincil aktiviteyi azaltmak için, gelecekteki çalışmaların organizma düzeyinde hedef dışı fenomen sisteminin altında kalan mekanizmaları tam olarak anlaması için çağrıda bulunulmaktadır.
İlginçtir ki, sineklerde RNA hedefleme Cas13 araçlarını tanımlayan yeni bir çalışma35 , casrx ekspresyumu ile ilişkili genel toksisiteyi birkaç olası nedenden dolayı iyileştirici olarak ortaya çıktı. İlk olarak, yazarlar Cas13 transgenes'i Drosophila'daki ifadeyi optimize etmek için yeniden kodladılar ve mevcut çalışmada kullanılan ubiquitin promotörüne kıyasla daha zayıf ifade eden bir promotör (actin 5C) kullandılar, muhtemelen cas13 ekspresyonunun daha düşük seviyelerine ve dolayısıyla daha az toksisiteye yol açtılar. Gerçekten de, bu çalışma (ve 35'teki yazarlar) UASt-CasRx sineklerinde belirgin bir ölümcüllük gözlemlemediği için, UASt güdümlü CasRx ve dCasRx ekspresyonunun tek başına toksik olmadığı gözlemleri tarafından desteklenmektedir. Ayrıca, bu yazarlar gRNA'larını bu çalışmaya kıyasla farklı kodlamıştır, bu da ifadelerini etkilemiş ve transtererozigöz Cas13 / gRNA sineklerinde sistemin toksisitesini azaltmış olabilir. Örneğin, çalışmalarında iki gRNA U6:3 promotörü kullanılarak ifade edildi ve CasRx35 gerektirmeden tRNA olgunlaşması üzerine gRNA işlenmesini sağlamak için tRNA'lar tarafından kuşatıldı. Tersine, bu çalışmada, gRNA'lar gen başına 4 konuma kadar hedef alan ve bakterilerde bulunan endojen Cas13 dizi yapısını taklit eden diziler olarak kodlanmıştır, bu da Cas13 enziminin her gRNA'yı işlemesini gerektirir. Bu farklı yaklaşımlar gRNA ekspresyon düzeylerinde farklılıklara ve tüm sistemin toksisitesi üzerinde doğal etkileri olabilecek diğer faktörlere yol açmış olabilir. Son olarak, Huynh ve arkadaşları, hedef-Cas/gRNA etkileşimi ve kollateral aktivitede farklılıklara neden olan ve gözlenen ölümcüllük seviyeleri üzerinde etkileri olabilen bu çalışmada hedeflenenlerden farklı genleri hedefledi. Gözlenen toksisitedeki bu farklılıklar, genel sistemlerin geliştirilme yollarını belirlemek için daha fazla araştırma yapılmasını garanti ediyor.
Genel olarak, bu çalışma D. melanogaster'da genetik olarak kodlanmış işlevsel bir programlanabilir RNA hedefleme Cas sisteminin ilk gösterimidir, ancak CasRx sisteminin daha fazla optimizasyonu (bildirilenlere paralel olarak35) hedef dışı öldürücülüğü daha da azaltmak ve CasRx hedefteki bölünmenin etkinliğini artırmak gerekecektir. Cas enzimleri ile RNA hedefleme, böcek vektör kontrolünden terapötik kullanımlara kadar birçok potansiyel uygulamaya sahip hızla gelişen bir alandır1,2,3,4,5,6,7 ve bu protokol, özelleştirme ve sistemin daha da optimizasyonu ile uyumlu olurken, sineklerde ilk CasRx sistemini tasarlamak isteyen herkes için bir başlangıç paketi sunmaktadır. Burada sunulan örnekler, bu sistemin in vivo uygulanması sırasında karşılaşabileceği bir dizi sonucu göstermektedir ve casrx sisteminin uygulamalarındaki performansını değerlendirirken diğer kullanıcılar için ölçüt görevi görebilir.

Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromiyal Tekrarlar (CRISPR) teknolojilerinin ortaya çıkmasından bu yana, bu alandaki odak noktasının çoğu tıp ve biyoteknolojide dönüştürücü uygulamalar sunan DNA düzenleme üzerine olmuştur1. Bununla birlikte, DNA dizilerinin kalıcı olarak değiştirilmesi, etik hususlar nedeniyle her zaman istenmez. Bunun ışığında, son çalışmalar RNA'yı hedeflemek için CRISPR tabanlı araçlar geliştirmeye başladı ve CRISPR teknolojilerinin çeşitli biyolojik sistemlerde RNA hedeflemesi için gerçekten kullanılabileceğini gösterdi2,3,4,5,6,7. Test edilen bu sistemlerin çoğunda, RNA ve transkript azaltmayı hedeflemek için yaygın olarak kullanılan mevcut yaklaşım, mükemmel olmaktan uzak olan, genellikle vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17'de kullanıldığında çeşitli etkinlik ve yüksek hedef dışı aktivite sergileyen RNA parazitidir (RNAi) . Bu nedenle, bu teknolojilerin durumu göz önüne alındığında, RNA hedeflemesi için CRISPR tabanlı araçların potansiyellerini daha fazla araştırmaya değer.
Son zamanlarda yapılan önemli bir çalışmada, Cas13d sınıfının bir üyesi olan ribonükleaz CasRx'in insan hücre kültüründeki gen transkript seviyelerini verimli bir şekilde azaltabileceği ve çekici bir hedef dışı profile sahip olduğu bildirilmiştir4. Bu bulgu, bu yeni ribonikleazın organizma düzeyinde RNA hedeflemesi için etkinliğini ve düşük hedef dışı oranını koruyup koruyamayacağı sorusuna yol açtı. Yeni bir çalışma, CasRx sisteminin Drosophila melanogaster5'te her yerde bulunan ve dokuya özgü gen transkriptini azaltmayı sağlamak için kullanılabileceğini göstererek bu soruyu ele haline geldi.
Yakın zamanda yayınlanan bu yaklaşımın kullanılabilirliğini kolaylaştırmak için, bu protokol üç ana bölümden oluşan bu son çalışmadan yöntemleri detaylandırıyor: 1) iki bileşenli bir CasRx sistemi kullanarak her yerde bulunan in vivo RNA hedeflemesi; 2) üç bileşenli CasRx sistemi kullanarak her yerde bulunan in vivo eksojen RNA hedeflemesi; ve 3) üç bileşenli CasRx sistemi kullanılarak doku spesifikin vivo RNA hedeflemesi.
Her yerde bulunan bir organizatörün kontrolü altındaki farklı hedef genleri hedefleyen kılavuz RNA'lar (gRNA) tasarlanmış ve bu gRNA içeren yapıları ifade eden sinek hatları oluşturulmuştır. Her yerde bulunan bir promotörün veya GAL4 transkripsiyon faktörü tarafından etkinleştirilebilen koşullu bir yukarı akış aktivasyon dizisi (UASt) promotörünün kontrolü altındaki CasRx yapıları da tasarlanmış ve bu CasRx içeren yapıları barındıran uçucu hatlar oluşturulmuştır. Katalitik olarak etkin olmayan CasRx yapıları, dCasRx, negatif kontroller olarak tasarlanmış ve kullanılmıştır. Sineklerde her yerde bulunan RNA hedeflemesi, gRNA ekspresyöz sinek hatlarını her yerde bulunan CasRx ifade eden sinek hatları ile geçerek elde edilir. Hem belirli bir gen transkriptini hedefleyen gRNA yapısını hem de CasRx proteinini ifade eden soy, hedeflenen gen transkriptlerinde her yerde bir azalmaya sahiptir. Sineklerde dokuya özgü RNA hedeflemesi, gRNA eksprese eden sinekleri ilk olarak UASt-CasRx eksprese eden sineklerle geçerek, hem gRNA hem de UASt-CasRx yapılarını taşıyan transheterozygöz sinekler elde ederek elde edilir. Bu tür sinekler dokuya özgü GAL4 ekspresyon sinekleri ile geçilir, bu da dokuya özgü CasRx ekspresyonunun üretilmesine ve sineklerde RNA hedeflemesine neden edilir.
CasRx sisteminin programlanabilir doğası, in vivo RNA hedeflemesi için yüksek etkinlik ve düşük hedef dışı etkinlik elde etmeye yardımcı olmak için özelleştirme ve optimizasyon imkanı sunar. CRISPR tabanlı RNA hedeflemesinin potansiyel uygulamaları, laboratuvarda RNAi'nin değiştirilmesi ve vahşi doğada böcek vektör kontrolüne katkıda bulunmak da dahil olmak üzere çok sayıdadır. İkincisi, karşılanmamış küresel ihtiyaçlardan biri, sivrisinekler yoluyla bulaşan RNA virüslerinin enfeksiyonlarıyla mücadele etmek için etkili araçların geliştirilmesidir. Dang humması, Zika ve chikungunya virüsü gibi birçok RNA virüsü sivrisinekler yoluyla bulaşır, insan sağlığını etkiler ve mortaliteye katkıda girer. Hastalığın önlenmesi için virüs direnci olan sivrisinek popülasyonlarının mühendisliği için birçok öneride bulunulmuştır; bununla birlikte, hiçbir mevcut teknoloji sivrisinekleri aynı anda tüm önemli RNA virüslerine karşı dirençli hale getiremez18,19,20,21,22,23. RNA hedefleme Cas sistemleri, sivrisinek kaynaklı tüm RNA virüslerini hedeflemek için programlanabilir bir platform sağlayarak böyle bir teknoloji için bir başlangıç noktası sağlayabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% Grape Juice</td>
			<td>Welch Foods Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Active Dry Yeast (908g)</td>
			<td>Red Star Yeast Company, LLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 color camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMC4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAL4-GMR flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>29967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAL4-y flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>44373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glomax 20/20 Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 Sequencer</td>
			<td>Illumina, Inc.</td>
			<td>HiSeq2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165FC fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>NDONEC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>E7770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 112686</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 112688</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132416</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132417</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132419</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132420</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132421</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132422</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132425</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132426</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 133304</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 164586</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>164586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid #132418</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pJFRC81</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases AscI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0558L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases NotI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases PacI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0547L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases PstI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0140L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases SwaI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0604L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases XbaI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0145L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo DNase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-Fluc flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-N flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-w flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-y flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UASt-CasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UASt-dCasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiq-CasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiq-dCasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kits</td>
			<td>Zymo Research Corporation</td>
			<td>D4007</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ubiquitous and tissue-specific rna targeting in drosophila melanogaster using crispr/casrx

RNA hedeflemeli Cas13 ailesinin bir üyesi olan CasRx, crispr/cas teknolojilerinin hem hücresel hem de organizma düzeyinde çekici bir hedef dışı profille verimli gen transkript azaltmada umut verici yeni bir ilavesi. Yakın zamanda CRISPR/CasRx sisteminin Drosophila melanogaster'da her yerde bulunan ve dokuya özgü gen transkriptinde azalma sağlamak için kullanılabileceği bildiriliyor. Bu makale, üç bölümden oluşan son çalışmadan yöntemleri detaylandırıyor: 1) iki bileşenli casrx sistemi kullanarak her yerde bulunan in vivo endojen RNA hedeflemesi; 2) üç bileşenli CasRx sistemi kullanarak her yerde bulunan in vivo eksojen RNA hedeflemesi; ve 3) üç bileşenli CasRx sistemi kullanılarak dokuya özgü in vivo RNA hedeflemesi. Gözlenen RNA hedeflemesinin etkileri arasında hedefe yönelik gen spesifik fenotipik değişiklikler, hedeflenen RNA transkript azaltma ve CasRx proteininin yüksek ekspresyumu ve kollateral aktivite ile ilişkili zaman zaman ölümcüllük fenotipleri sayıldı. Genel olarak, bu sonuçlar CasRx sisteminin organizma düzeyinde RNA transkript azaltmayı programlanabilir ve verimli bir şekilde hedefleyebildiğini, in vivo transkriptom hedeflemenin ve mühendisliğin mümkün olduğunu ve vivo CRISPR tabanlı RNA hedefleme teknolojilerinde geleceğin temelini atabileceğini göstermiştir.

İki Bileşenli CasRx Sistemi Kullanılarak Her Yerde Bulunan In vivo RNA Hedeflemesi Hem Ubiq-CasRx hem de gRNA (hem endojen hem de eksojen genleri hedefleyen) yapılarını ifade eden F1 transheterozygous sinekleri, Ubiq-dCasRx ve gRNA yapılarını ifade eden kontrol sineklerine kıyasla belirgin fenotipler göstermiştir (Şekil 2 ve Şekil 4). Özellikle, transheterozipöz CasRx sinekleri, Ubiq-CasRx sisteminin toksisitesini gösteren transtererozgyous dCasRx sineklerine kıyasla önemli ölçüde daha düşük sağkalım oranlarına sahiptir (Şekil 2A ve Şekil 4A). Hem transheterozygous CasRx hem de dCasRx sineklerinin, Mendelian genetiğine dayanarak beklenen oran olan% 50'den daha az kalıtım oranına sahip olduğunu belirtmek gerekir. Üç hedef genden Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAN/+ sinekleri ve Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAy/+ sinekler canlı değildir (%0 kalıtım) ve ikinci başlangıç larva aşamasının ötesinde büyümedi (Şekil 2A-2B). Hayatta kalan Ubiq-CasRx/+; Kalıtımı %12,9 olan U6-gRNAw/+ sinekleri belirgin bir tam penetrant beyaz gözlü fenotip göstermiştir (Şekil 2B). CasRx ile ilişkili gözlemlenebilir özelliklere ek olarak, 3 hedef gen için hedef gen transkriptlerinde önemli bir azalmayı doğrulayabildik: Çentik, sarı ve GFP (Şekil 2E-2G). Beyaz gen transkriptlerinde azalma Ubiq-CasRx/+, U6-gRNAw/+ sineklerinde, Ubiq-dCasRx/+, U6-gRNAw/+ sinek kontrolüne kıyasla gözlenmiştir, ancak azalma istatistiksel olarak anlamlı değildir (Şekil 2E - 2F). CasRx'in indüklediği hedef dışı aktivitenin kanıtı, CasRx eksprese eden sineklerden alınan örnekler ile dCasRx eksprese eden sineklerden alınan örnekler arasındaki farklı ifade edilen transkriptler karşılaştırılırken bulunmuştur (Şekil 2E, 2G). Hedef dışı transkriptlerin sayısı önemli ölçüde farklı olarak ifade edilir: beyaz, 253 (toplam transkriptlerin% 1.4'ü); Çentik, 300 (%1,7); sarı, 41 (%0,23); GFP, 5.880 (%33) (Şekil2G). Toplam 17.779 farklı transkriptten 6'sının hedef dışı transkriptleri 4 örnek grubunda da anlamlı bir şekilde farklı ifade edildi. Tespit edilen 6 transkriptten biri, sineklerde apoptoz ve hücresel arreste karışan bir gen olan Gadd45'tir ve CasRx'in enzimatik eyleminin doğrudan hücresel apoptozu tetikleyebileceği veya dolaylı olarak diğer genlerin yanlış ifadesini tetikleyebileceği olasılığını artırmıştır, bu da apoptoza yol açar. Son olarak, Ubiq-CasRx ve Ubiq-dCasRx sineklerinin, muhtemelen yüksek her yerde bulunan ifade ile verilen toksisite nedeniyle homozigöz stoklar olarak kurulmadığını belirtmek gerekir. Sonuç olarak, homozigot gRNA sinek hatları ile geçiş için heterozipöz Ubiq-CasRx/CyO ve Ubiq-dCasRx/CyO sinekleri kullanılmıştır. Özetle, iki bileşenli Ubiq-CasRx sistemi, gözlemlenebilir fenotipler ve transkript azaltma ile sonuçlanan hem endojen hem de eksojen hedefler için her yerde RNA hedeflemesi elde edebilir. Bu sonuçlar ayrıca CasRx aracılı RNA hedeflemenin vivo toksisiteye neden olabileceğini göstermiştir.
Üç Bileşenli CasRx Sistemi Kullanılarak Her Yerde Bulunan In vivo Eksojen RNA Hedeflemesi İki adımlı haçtan elde edilen sonuçlar, hedef genin eksojen doğasına rağmen (yani, Fluc), F2 üçlü transheterozygotes (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) üç transjen ifade Ubiq-dCasRx içeren kontrol haçlarına kıyasla% 100 öldürücülük ile sonuçlandı, F2 üçlü transheterozygotlarda (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) öldürücülük görülmediği durumlarda (Şekil 3B-C ). Daha spesifik olarak, sadece üç transjenin (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) kombinasyonu % 100 öldürücülükle (Şekil 3B ve D) sonuçlanırken (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/TM6) ve (Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6) genotipleri uygulanabilirdi ve beklenen Mendelian iletim oranlarına uyan kalıtım oranları ile fenotiplerden yoksundu, Hedef sıranın (yani ateş böceği luciferaz) Ubiq-CasRx/+ ve gRNAFluc ile birlikte kullanılabilirliğinin, muhtemelen Cas13 enzimlerinin ikincil aktivitesinden kaynaklanan gözlenen ölümcüllük fenotipleriyle sonuçlandığını öne sürüyor2,8 . Buna ek olarak, F1 transheterozygotlarında (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/+ veya Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Ubic-Ubiq-Rluc/+) Ubiq-dCasRx kontrollerine (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/+ veya Ubiq-dCasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) (Şekil 3B), gözlenen öldürücülük fenotiplerini elde etmek için katalitik olarak aktif bir enzimin gerekli olduğunu gösterir. Ayrıca, tüm uygulanabilir genotiplerin sineklerindeki Fluc ve Rluc ekspresyon seviyeleri, çift luciferase muhabir kontrolüne kıyasla Ubiq-dCasRx üçlü transheterozygotlarında (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) Fluc ifadesinde önemli bir azalma göstermedi. Bu, Fluc protein ekspresyon seviyelerinin dCasRx hedeflemesi ile azalmadığını göstermektedir (Şekil 3D). Birlikte ele alındığında, casrx aracılı iki farklı RNA hedefleme deneyindeki yaygın öldürücülük fenotipi, dokularda her yerde kullanıldığında, CasRx aracılı RNA hedeflemesinin organizma için toksik olabileceğini göstermektedir.
Üç Bileşenli CasRx Sistemi Kullanılarak Dokuya Özgü In vivo RNA Hedefleme Her yerde bulunan RNA hedefleme deneylerinde gözlenen yüksek toksisite seviyesi, yöntemler bölümünde ayrıntılı olarak açıklanan üç bileşenli CasRx sistem tasarımını kullanarak dokuya özgü RNA hedeflemesini keşfetmemizi istemeye neden oldu. Gerçekten de, genel CasRx ifadesi UASt promotörü kullanılarak Ubiq organizatörüne kıyasla düşürüldüğünde gözlenen toksisite seviyesi azaltıldı, bu üç açıdan örneklenmiştir: 1) UASt-CasRx ve UASt-dCasRx hatları homozigous çizgiler olarak korunmuştur, ancak iki adımlı çapraz şemaya dayanarak çift dengeli UASt-CasRx ve UASt-dCasRx çizgileri haçları gerçekleştirmek için kullanılmıştır, 2) tüm F2 nesil dCasRx üçlü transheterozygous kalıtım oranları beklenen eşleşmiştir 25% Mendelian kalıtım oranı, ve 3) F2 nesil CasRx üçlü transheterozygous ölümcül ölümcüllük fenotip orta derecede azaltılmıştır. Beyaz hedefleme deneyinde, F2 üçlü transheterozygotlarda beklenen% 25 Mendelian kalıtım oranlarından, sadece% 0.57 uygulanabilir yetişkin sinekleri (UASt-CasRx / + + ; gRNAw / GMR-Gal4) gözlendi, bunların hepsi ciddi göz spesifik pigmentasyon ve morfoloji fenotipleri gösterdi (Şekil 4A ve 4B). Beyaz hedefleme çaprazı için CasRx eksprese edici üçlü transheterozygöz F2 kalıtım oranı dCasRx eksprese üçlü transheterozygöz kontrol grubundan (%27,6) önemli ölçüde düşüktü (Şekil 4A). Çentik hedefleme deneyinde, üç transjeni de taşıyan CasRx eksprese üçlü tranheterozygous% 100 ölümcülken, dCasRx kontrol kalıtım oranı% 29.3 idi (Şekil 4A). Sarı hedefleme deneyinde, F2 üçlü transheterozipöz CasRx-expressing, gRNAy ve y-GAL4, dCasRx kontrol grubundan (%25,2) çok daha düşük, %2,67 kalıtım oranına sahip toraks ve karın üzerinde küçük sarı kütikül lekeleri olarak marjinal kitin pigment azalması gösterdi (Şekil4A ). Tüm dCasRx kontrol üçlü transheterozygous sinekler CasRx ifade sinekleri olarak belirgin fenotipler sunmadı, bu da CasRx'in katalitik aktivitesinin gözlenen fenotiplere katkıda bulunduğunu gösterdi. CasRx üçlü transheterozygous grubundaki düşük kalıtım oranı, CasRx RNA hedeflemesinde iki toksisite kaynağının mevcut olduğunu öne sürmüştür: biri CasRx'in yüksek ekspresyumu ile ilişkilidir, toksisitesi kısıtlayıcı CasRx ekspresyumu ile azaltılmıştır, diğeri teminat aktivitesi ile ilişkilidir. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar CasRx sisteminin klasik Gal4 / UASt sisteminden yararlanarak dokuya özgü in vivo RNA hedeflemesi elde edebileceğini ve bu arada toksisiteyi azaltabileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, toksisite ve zaman zaman öldürücülük fenotipleri, her yerde bulunan yaklaşımlara kıyasla daha düşük bir şiddet seviyesinde gözlenmiştir, bu da kollateral bölünme aktivitesinin toksisite ile ilişkili olduğunu gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig01.jpg"> Şekil 1: Cas13D sistemi kullanarak RNA hedeflemesine genel bakış. (A) İki bileşenli casrx sistemi kullanarak her yerde bulunan in vivo RNA hedeflemesinde tek adımlı genetik haçın şemaları. (B) Üç bileşenli CasRx sistemi kullanılarak her yerde bulunan in vivo eksojen RNA hedeflemesinde iki adımlı bir genetik haçın şemaları. (C) Üç bileşenli CasRx sistemi kullanılarak dokuya özgü in vivo RNA hedeflemesinde iki aşamalı genetik haçın şemaları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig02.jpg"> Şekil 2: İki bileşenli CasRx sistemi kullanılarak her yerde bulunan in vivo RNA hedeflemesi (yeniden basılmıştır5). (A) Ubiq-CasRx (veya Ubiq-dCasRx) ve gRNA'ları devralan transheterozigöz sineklerin toplam kalıtım yüzdeleri. Kutu çiziminde mavi gölgelendirme fenotip penetrance gösterir. (B) Transheterozip sineklerin fenotipleri. Oklar gözdeki doku nekrozuna işaret eder. ''X'' ile işaretlenmiş siyah beyaz sinek ölümcüllüğü temsil eder. (C) Ubiq-CasRx (veya Ubiq-dCasRx) ve gRNAGFP-OpIE2-GFP sinekleri arasındaki çift yönlü haçların transtererozigöz sineklerinin toplam kalıtım yüzdeleri. M, CasRx'in anne mirası; P, CasRx'in baba mirası. (D) Baba çetinde F1 larvaları soyları. (E) Transkriptlerin logaritmik kat değişimi için tahmin eden maksimum posteriori değeri. DESeq2 ardışık düzeni kullanıldı. (F) CasRx veya dCasRx ile hedeflenen milyon başına transkript (TPM). (G) CasRx-depentent transkriptlerin farklı ifade edilen transkript yüzdesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig03.jpg"> Şekil 3: Üç bileşenli CasRx sistemi kullanılarak her yerde bulunan in vivo eksojen RNA hedeflemesi. (A) İki adımlı genetik haçın şemaları. (B) F2 kuşağında ortaya çıkan tüm genotipler için toplam kalıtım yüzdeleri. F2 soyundaki her üç transjenin (Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc ve gRNAFLuc) kalıtsal olarak devralınması %100 öldürücülükle sonuçlandı ve Ubiq-dCasRx üçlü transheterozygot kontrol grubuna kıyasla önemli ölçüde daha düşüktü (p = 0.001, t-test). (C) Tek başına Ubiq-CasRx/gRNAFluc veya Ubiq-CasRx ve Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc taşımak tek başına ciddi ölümcüllüğe yol açmadı, ve Ubiq-CasRx ve Ubiq-dCasRx transheterozygotlar arasındaki kalıtım oranları önemli ölçüde farklı değildi (sırasıyla p = 0.41 ve p = 0.51, t-test). (D) Luciferaz oranları normalleşen Fluc okumaları Rluc okumaları. Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc, gRNAFLuc'u ifade eden üçlü transheterozipöz sinekler embriyonik öldürücüydü, bu da "X" ile bir sinekle temsil edildi ve sonuç olarak luciferaz ekspresyumu ölçülmedi. Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6, Stb transheterozygotes'un Fluc/Rluc oranı diğer Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc-expressing gruplarından (p = 1.2e-06 veya daha düşük, t-test) önemli ölçüde daha düşüktü. Yalnızca gRNAFLuc grubundan elde edilen sonuçlar diğer tüm gruplardan önemli ölçüde daha düşüktü (p = 1.2e-06 veya daha düşük, t-test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig04.jpg"> Şekil 4: Üç bileşenli CasRx sistemi (yeniden basılmış5) kullanılarak dokuya özgü in vivo RNA hedeflemesi). (A) Üç transjen (UASt-CasRx veya UASt-dCasRx, gRNAs ve Gal4-driver) taşıyan üçlü transtererozigöz sineklerin toplam kalıtım yüzdesi. (B) Üçlü transheterozip sineklerin fenotipleri. Beyaz ok toraksta kitin pigment azalmasını gösterir. ''X'' ile işaretlenmiş siyah beyaz sinek ölümcüllüğü temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Yapmak</td>
			<td>Tarif</td>
			<td>Astar</td>
			<td>Astar Sırası (5' ila 3')</td>
			<td>PCR Şablonu</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1050E</td>
			<td rowspan="2">CasRx</td>
			<td>1050E. C3</td>
			<td>TACTAATTTTCCAC ATCTTATTTTGAC CCGCAGATTAATTA ATGAGCCCCAAGA AGAA</td>
			<td rowspan="2">pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGTTA TTTTAAAAACGATT CATTCTAGCTAGCT TAAGCGTAATCTGG AACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1050R</td>
			<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050E. C3</td>
			<td>TACTAATTTTCCAC ATCTTATTTTGAC CCGCAGATTAATTA ATGAGCCCCAAGA AGAA</td>
			<td rowspan="2">pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGTTA TTTTAAAAACGATT CATTCTAGCTAGCT TAAGCGTAATCTG GAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">OA-1050L</td>
			<td rowspan="2">UASt organizatörü</td>
			<td>1041.C9</td>
			<td>GCGGGTTCTCGA CGGTCACGGCGG GCATGTCGACGC GGCCGCAACCAA CAACACTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">pJFRC81</td>
		</tr>
<tr>
<td>1041.C11</td>
			<td>CTGGCCTCCACC TTTCTCTTCTTCTCT TGGGGCTCATGT TTAAACCCAATT CCCTATTCAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">CasRx</td>
			<td>1050L. C1</td>
			<td>AATACAAGAAGA GAACTCTGAATA GGGAATTGGGT TTAAACATGAGC CCCAAGAAGAA</td>
			<td rowspan="2">pCasRx</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGT TATTTTAAAAAC GATTCATTCTA GCTAGCTTAAG CGTAATCTGGA ACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">OA-1050'LER</td>
			<td rowspan="2">UASt organizatörü</td>
			<td>1041.C9</td>
			<td>GCGGGTTCTC GACGGTCACG GCGGGCATGT CGACGCGGCC GCAACCAACAA CACTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">pJFRC81</td>
		</tr>
<tr>
<td>1041.C11</td>
			<td>CTGGCCTCCA CCTTTCTCTTC TTCTTGGGGCT CATGTTTAAAC CCAATTCCCTA TTCAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050L. C1</td>
			<td>AATACAAGAAG AGAACTCTGAAT AGGGAATTGGG TTTAAACATGAG CCCCAAGAAGAA</td>
			<td rowspan="2">pdCasRx</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGT TATTTTAAAAAC GATTCATTCTAG CTAGCTTAAGCG TAATCTGGAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1043</td>
			<td rowspan="2">U6:3 organizatör</td>
			<td>1043.C1</td>
			<td>GGGAATTGGGA ATTGGGCAATAT TTAAATGGCGGC GCGCCGAATTCT TTTTTGCTCACCT</td>
			<td rowspan="2">Addgene plazmid #164586</td>
		</tr>
<tr>
<td>1043.C23</td>
			<td>ACACTAGTGGAT CTCTAGAGGTAC CGTTGCGGCCG CAAAAAGTTGT AATAGCCCCTCA AAACTGGACCTT CCACAACTGCAG CCGACGTTAAAT TGAAA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">OA-1052B</td>
			<td rowspan="2">Ubiq organizatörü</td>
			<td>1052B. C1</td>
			<td>GGGAATTGGGCA ATATTTAAATGGC GGCTGCAGCGC GCAGATCGCCGAT</td>
			<td rowspan="2">Addgene plazmid #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>1052B. C2</td>
			<td>TTTCTTTATGTTT TTGGCGTCTTCC ATCCTAGGTCTG CGGGTCAAAATA GAGATG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">T2A-eGFP</td>
			<td>908A1</td>
			<td>ATAAAGGCCAAG AAGGGCGGAAA GATCGCCGTGG AGGGCAGAGGA AGTCTTCTAACAT GC</td>
			<td rowspan="2">Addgene plazmid #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>908A2</td>
			<td>TTGTTATTTTAAAA ACGATTCATTCTA GGCGATCGCTTA CTTGTACAGCTC GTCCATGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Ters Ubiq promotörü</td>
			<td>908A3</td>
			<td>ACCGTGACCTAC ATCGTCGACACTA GTGGATCTCTAGA CGCGCAGATCGC CGATG</td>
			<td rowspan="2">Addgene plazmid #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>908A4</td>
			<td>GGATCATAAACTT TCGAAGTCATGC GGCCGCTCTGCG GGTCAAAATAGAG ATGT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan moleküler yapı ve astarların listesi. Bu liste, tüm yapıları (hem kimlik hem de açıklama) ve her yapının ilişkili astarlarını (hem kimlik hem de sıralar (5' ila 3')) ve kullanılan şablonları içerir.

Watch this Scientific Journal Video about Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx at JoVE.com

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

Bu makalede, sineklerde RNA hedefleme cas13d enzimini (RfxCas13D) kullanmak için ayrıntılı bir protokol özetlenmiştir.

CRISPR/CasRx kullanarak Drosophila Melanogaster'da Her Yerde ve Dokuya Özgü RNA Hedeflemesi

CasRx, a member of the RNA-targeting Cas13 family, is a promising new addition of the CRISPR/Cas technologies in efficient gene transcript reduction with ...

Protokolümüzün gösterdiği gibi CRISPR CasRx teknolojileri, meyve sineklerinde her yerde bulunan ve dokuya özgü gen transkriptinde azalmalar elde etmek için kullanılabilir. Tekniğimiz, daha fazla özelleştirme ve optimizasyon ile uyumlu olurken meyve sineklerinde CRISPR tabanlı gen transkript azaltma kullanmak isteyen herkes için bir başlangıç paketi sunar. İki bileşenli casrx sistemi kullanarak her yerde bulunan bir in vivo RNA hedeflemesi kurmak için, homozigot gRNA ilgi hattından 10 bakire yetişkin dişi sinek ve dengeli heterozygous Ubiq CasRx CurlyO'dan beş yetişkin erkek sinek toplayın.Ebeveyn sineklerini 100 mikrogram kuru maya tozu ile desteklenmiş bir şişeye yerleştirin ve şişeleri 26 santigrat derecede 48 saat boyunca arkalayın. F1 kuşağının kasıklarından yeni bir yetişkin soyunun çıkıp çıkmadığını görmek için her gün şişeleri gözlemleyin ve yetişkinlerden herhangi birini 10 saniye boyunca karbondioksitle uyuşturun. Sinekler hareketsiz hale geldikten sonra şişeyi sürekli karbondioksit ile karbondioksit tankına bağlı bir sinek pedi üzerine boşaltın ve sineklerin fenotiplerini puanlamak ve görüntülemek için floresan stereo mikroskopa bağlı bir renkli kamera kullanın.Daha sonra floresan sinyal ifadesine göre farklı fenotiplere sahip soy sayılarını sayın. Mendelian genetiğine dayanarak, soyların% 50'sinin hedeflenen RNA'yı ifade etmesi beklenmektedir. Ubiq CasRx sisteminin toksisitesinin hedeflenen RNA ekspresyon soy oranını % 50'nin altına düşürebileceğini unutmayın Üç bileşenli casrx sistemi kullanarak her yerde bulunan bir in vivo eksojen RNA hedeflemesi kurmak, çift luciferaz ifade hattından sekiz ila 10 Bakire yetişkin dişi sinek ve dengeli heterozipöz Ubiq CasRx Curly artı TM6'dan dört ila beş yetişkin erkek sinek toplayın, Aynı anda beyaz gözler, kıvırcık kanatlar ve ds kırmızı floresan sergileyen STB hattı.Ebeveyn adımını 100 mikrogram kuru maya tozu ile desteklenmiş bir şişeye bir çapraz yerleştirin ve bu haçı 26 santigrat derecede 48 saat boyunca arkalayın. Kuluçkanın sonunda, her şişedeki tüm ebeveyn sineklerini çıkarın ve şişeleri en az 14 gün boyunca 26 santigrat derece inkübatöre geri verin. 14 gün boyunca, daha önce de belirtildiği gibi, gRNA hattını üç kez hedef alan homozigot ateş böceği luciferazından sekiz ila 10 dişi bakire toplayın.Pupalardan yeni yetişkin soylarının çıkıp çıkmadığını görmek için her gün bir çapraz şişe adımını gözlemleyin, karbondioksitle uyuşturarak hem Ubiq CasRx'i hem de çift Luciferase muhabirini ifade eden dört ila beş erkek sinek toplanmasına izin verin. Sinekleri gRNA hattını hedefleyen meyve sineği luciferazından 10 Virgin dişisiyle yeni bir şişeye yerleştirin ve bu adım iki haçı 48 saat boyunca 26 santigrat derecede yerleştirin. Bir günlük beş erkek daha toplayın hem Ubiq CasRx hem de çift luciferaz muhabirini birinci adım çapraz şişelerden ifade edin ve sinekleri eksi 80 santigrat derece depolama için 1,5 mililitre santrifüje aktarmadan önce 26 santigrat derecede tek başına iki ila dört gün kuluçkaya bırakın.Kuluçkanın sonunda, iki adım çapraz şişenin her birinden tüm ebeveyn şişelerini çıkarın. Ve şişeleri en az 20 gün boyunca 26 santigrat derece inkübatöre geri verin. Kasıktan yeni bir yetişkin soyunun çıkıp çıkmadığını görmek için her gün iki çapraz şişe adımını gözlemleyin, sinekleri kullanılabilir hale geldikçe karbondioksitle uyuşturun ve fenotiplerini gösterildiği gibi puanlayıp görüntülemeyin.Mendelian genetiği, tüm sinekler yaşayabilirse, soyların% 25'inin hedeflenen RNA'yı ifade etmesi gerektiğini göstermektedir. Bir luciferaz tahlil yapmak için, üçlü trans heterozegöz sinekleri ve kontrol, gösterildiği gibi uçar. Erkek sinekleri doğumda toplamak ve üç günlük olana kadar yaşlanmak.Üç günlük sinekleri 1,5 mililitre santrifüj tüplerine aktarın ve ticari olarak mevcut bir luciferaz test kitinden luciferaz liziz tamponunda bir tampon kullanarak onları yalım. Daha sonra standart luciferaz test protokollerine göre, hem meyve sineklerini hem de luciferaz aktivitesini ölçmek için her örnek ve armatürden beş mikrolitre lised doku kullanın. F1, trans heterozygous CasRx, trans heterozygous dCasRx sineklerine kıyasla önemli ölçüde daha düşük sağkalım oranlarına sahiptir.Üç hedef genin Ubiq CasRx sisteminin toksisitesini doğrulayan U6 gRNA Y heterozipöz sinekler dayanılmazdır ve ikinci başlangıç larva aşamasının ötesinde büyümez. Hayatta kalan Ubq CasRx ve U6 gRNA W heterozygous sinekleri, belirgin bir tamamen penetrant geniş gözlü fenotip göstermektedir. Ayrıca üç hedef gen için hedef gen transkriptlerinde de önemli bir azalma gözlenmektedir.CasRx tarafından indüklenen hedef dışı aktivitenin kanıtı, CasRx'ten sinekleri ifade eden örnekler ile dCasRx ifade eden sineklerden alınan örnekler arasındaki diferansiyel eksprese transkriptler karşılaştırıldığında da gözlenir. İki adımlı çaprazda, sadece üç trans genin kombinasyonu% 100 ölümcüllükle sonuçlanır. Üç bileşenli CasRx sistem tasarımı kullanılarak dokuya özgü RNA hedeflemesi kullanılırken, genel CasRx ifadesi UAST promotörü kullanılarak Ubiq promotörüne kıyasla düşürüldüğünde toksisite seviyesi azalır.Doğru cinsiyet sinekleri ve doğru fenotipler kullanılarak genetik sürecin doğru şekilde kurulması önemlidir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Tarama için ilgilendim Ana Faktörler Vaccinia Virüs Enfeksiyonu Drosophila Hücre

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

RNA Interference in Ticks

Keneler de RNA Girişim

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Tavlama Dolayımlı Elektroforez (ADI) Testi HIV-1 Nükieokapsit inhibitörlerinin Hızlı tanımlanması sağlar

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Sistemik Bakteriyel Enfeksiyon ve Bağışıklık Savunma FENOTİPİ içinde<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

16S rRNA Hedefleme Digoksin-etiketli DNA probu kullanılarak Parafine gömülmüş dokular içinde Bakterilerin in situ tespiti

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Biyofilm İlişkili Hedefleme<em&gt; Staphylococcus aureus</emKullanma&gt; Resazurin Tabanlı İlaç-duyarlılık Deneyi

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Viral enfeksiyon ve analiz Drosophila Melanogaster ana bilgisayar virüs etkileşimin kurulması

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...