Visualisera effekterna av oxidativ skada på Drosophila äggkammare med levande avbildning

Vårt labb använder Drosophila melanogaster för att identifiera och karakterisera gener och vägar som reglerar mitokondriell funktion under utveckling och fysiologisk homeostas. Protokollet som presenteras här använder levande avbildning med tillägg av väteperoxid för att visualisera effekterna av oxidativ skada på lokalisering och dynamik av subcellulära strukturer i den vuxna Drosophila äggstocken. Vi använder ofta bildframställning protokoll för att studera hur mutationer förändrar normala mitokondriell lokalisering och rörlighet i kvinnliga könsceller.

Under våra studier fann vi att stress som infördes genom dissekering eller andra cellstressorer hade en djupgående inverkan på mitokondriell lokalisering. Som en kontroll för att identifiera om allmän stress, i motsats till experimentell behandling, är orsaken till eventuella förändringar i lokaliseringen eller beteendet hos subcellulära strukturer. Vi utvecklade detta protokoll för att införa kontrollspänning med väteperoxid.

I den här videon kommer vi att visa hur väteperoxid inducerad oxidativ skada förändrar fördelningen av mitokondrier och ribonukleoproteinet Clu. De medier som lämpar sig bäst för denna levande bildteknik innehöll Schneiders Drosophila-medier som innehöll 15% värmeinaktiverat fetala nötkreatursserum, 0,6 X Pen-Strep och 200 mikrogram per mikroliter bovint insulin, nedan kallat komplett Schneiders media. Att utföra mediepreparatet under sterila förhållanden säkerställer att det inte blir förorenat.

Blanda innehållet väl och förvara över natten vid fyra grader. Insulin löses inte upp helt i hela Schneiders media och du kommer att märka en fällning bosätta sig i botten av röret. Gör alikvoter, se till att lämna denna fällning eftersom det kommer att störa avbildningen.

Denna lösning kan användas i en månad om den förvaras i alikvoter vid fyra grader. För optimal kvinnlig bakteriecellsavbildning, förbered först en flaska som innehåller en klick våtjästpasta som är konsistensen av jordnötssmör. Detta säkerställer att honorna är välmatade och kommer att producera alla follikelutvecklingsstadier för avbildning.

För optimalt friska flugor, samla noll till en dag gamla honor och överför med män till en flugmatflaska som innehåller våt jästpasta. Se till att de sovande flugorna inte kommer i kontakt med jästpasta eftersom de kan hålla fast vid den. Mata flugorna tre till sju dagar och ändra jästpasta dagligen.

Se till att jästpastan kommer i kontakt med flugmaten, så att den inte torkar ut. För att inducera oxidativ skada kommer vi att använda en stamlösning på 30% väteperoxid och för att visualisera mitokondrier kommer vi att använda en stamlösning på 100 millimolar TMRE. Det är viktigt att förbereda medielösningarna färska eftersom väteperoxid är mottagligt för oxidation och TMRE bryts ned med tiden.

Precis före dissekering, i komplett Schneiders media, förbereda en färsk alikvot av två mikromolar väteperoxid, en färsk alikvot på 46 nanomolar TMRE och en färsk alikvot på 46 nanomolar TMRE plus två mikromolar väteperoxid. För ägglossning behöver du två par fina tångar och ett par elektrolytiskt slipade volframnålar. För att dissekera äggstockarna fyll ett urglas med komplett Schneiders media som har värmts upp till rumstemperatur och placera sedan en enda fluga i media med tång.

Ta försiktigt tag i flugan vid bröstkorgen med ett par fina tångar. Med de andra tångarna, ta tag i den bakre och dra försiktigt för att ta bort äggstockarna. Ta bort eventuell främmande nagelband eller vävnad och överför sedan äggstocken till en ny brunn som innehåller färska medier.

Äggstockarna bör fortfarande röra sig från den omgivande muskelsenan. Använd de vässade volframnålarna, reta försiktigt isär ovariolerna, var noga med att ta bort den omgivande muskelsylet. Om muskelsyttan inte tas bort, vilket visas här, kommer äggariatet att rycka, vilket orsakar problem med bildförvärv.

När ovariolerna har dissekerats rent, överför dem i en 100 mikroliter droppe media till en MatTek-maträtt om du visualiserar endogent märkta strukturer. Överför ovariolerna i en 100 mikroliter droppe TMRE-media till en MatTek-maträtt om du visualiserar mitokondrier märkta med TMRE. Ovariolerna sjunker till botten av droppen.

Det är viktigt att öva dissekeringar för att börja avbilda vävnaden så snabbt som möjligt. När ovariolerna är monterade placerar du skålen på det inverterade mikroskopet och skaffar stillbilder eller korta videor som ett register över förbehandlingsförhållanden. När detta är gjort, pausa den levande avbildningen, ta bort locket och tillsätt försiktigt 100 mikroliter av de två mikromolära väteperoxidberedda lösningen.

Undvik att bryta ytan på den befintliga mediedroppar eller tillsätt lösningen för snabbt, för att inte förskjuta ovariolerna som vilar på botten. Sätt tillbaka diskluckan, flytta och rikta om önskad ovariole och fortsätt avbildningen. Var noga med att återuppta avbildningen så snabbt som möjligt, eftersom den experimentella behandlingen är tidskänslig.

Här visas fortfarande bilder från en film, tagna efter väteperoxidbehandling. Mitokondrier och kvinnliga könsceller sprids i hela cytoplasman när flugorna är välmatade och friska. Efter väteperoxid tillsats orsakar den oxidativa skadan mitokondrier att klumpa ihop sig, vilket kan ses så snabbt som 10 minuter efter behandlingen.

Efter 20 minuter orsakar skadan mitokondriell membranpotential att försvinna. Således bleknar majoriteten av mitokondrierna. I denna livefilm av processen kan mitokondrier ses snabbt klumpa ihop sig och majoriteten av mitokondrier bleknar slutligen.

Pulserande blinkar i cytoplasman, särskilt i de omgivande follikelcellerna, verkar karakteristiska för TMRE tillägg. Som nämnts tidigare måste avbildning ske snabbt efter väteperoxid addition. Som visas här, om för mycket tid går, är mitokondriellt membranpotential redan förlorad och TMRE-märkningen försvinner, vilket gör data oförtolkningsbara.

I dessa video stillbilder är GFP endogent märkta Clu-partiklar robusta och rikliga i bakterieplasman hos välmatade honor. Efter väteperoxid tillsats skingras Clu partiklar inom 10 minuter. Detta visas i den medföljande videon.

Efter väteperoxid tillsats skingras Clu bliss partiklar snabbt. Vi har funnit detta protokoll vara ett användbart verktyg för att säkerställa korrekt avbildning av vild typ lokalisering av mitokondrier och Clu lycksalighet partiklar i Drosophila kvinnliga könsceller. Detta protokoll bör tillämpas för ett brett spektrum av levande bildstudier och kan också användas för att behandla vävnader före fixering.

De viktigaste stegen är att isolera ovarioler fria från muskelsenan, att försiktigt lägga till väteperoxiden, för att inte lossa ovariolerna och att snabbt avbilda efter väteperoxid tillsats. Vi hoppas att du kommer att hitta detta en användbar kontroll för live imaging en mängd subcellulära strukturer. Tack för att du tittade och lycka till med dina experiment.