Name: in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli
Uploaded: 2021-02-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli at JoVE.com

يشكر المؤلفون س. همايون على تربية الفئران. وقد تم توفير التمويل لهذا العمل جزئيا من قبل اتحاد صحة الدماغ UTSA خريج ومنحة بذور ما بعد الدكتوراه (B.E.F.) والمعاهد الوطنية للصحة-SC2-GM130411 إلى L.J.M.

تم مراجعة البروتوكولات الحيوانية والموافقة عليها من قبل اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة تكساس سان أنطونيو.
1. الإعداد قبل العملية
ملاحظة: يرجى ملاحظة أن الإعداد الأولي للمعدات لا يتم تناوله هنا، حيث سيختلف استنادا إلى نظام المضخة والمجه?...

<ol>
	<li>Krimm, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+regulate+embryonic+gustatory+development.">Factors that regulate embryonic gustatory development.</a> BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).</li><li>Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+taste+cells+lacking+synapses+mediate+neurotransmission?+CALHM1,+a+voltage-gated+ATP+channel.">How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel.</a> Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).</li><li>Taruno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+transduction+and+channel+synapses+in+taste+buds.">Taste transduction and channel synapses in taste buds.</a> Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).</li><li>Kinnamon, S. C., Finger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taste+for+ATP:+neurotransmission+in+taste+buds.">A taste for ATP: neurotransmission in taste buds.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste.">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li><li>Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+sense+about+taste:+from+mammals+to+insects.">Common sense about taste: from mammals to insects.</a> Cell. 139 (2), 234-244 (2009).</li><li>Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+neural+response+in+the+mouse.">Gustatory neural response in the mouse.</a> Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).</li><li>Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opponent+effects+of+quinine+and+sucrose+on+single+fiber+taste+responses+of+the+chorda+tympani+nerve.">Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve.</a> Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).</li><li>Frank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+classification+of+mammalian+afferent+taste+nerve+fibers.">The classification of mammalian afferent taste nerve fibers.</a> Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).</li><li>Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+gustatory+nerve+fiber+discharge+pattern+with+change+in+stimulus+concentration+and+quality.">Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality.</a> Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).</li><li>Sollars, S. I., Hill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recordings+from+rat+geniculate+ganglia:+taste+response+properties+of+individual+greater+superficial+petrosal+and+chorda+tympani+neurones.">In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones.</a> Journal of Physiology. 564, 877-893 (2005).</li><li>Yokota, Y., Bradley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geniculate+ganglion+neurons+are+multimodal+and+variable+in+receptive+field+characteristics.">Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics.</a> Neuroscience. 367, 147-158 (2017).</li><li>Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+modulates+taste+responsiveness+and+stimulates+gustatory+neurons+in+the+rat+geniculate+ganglion.">Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion.</a> Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits:+A+decade+of+progress.">Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress.</a> Neuron. 98 (4), 865 (2018).</li><li>Barreto, R. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517, 373-376 (2015).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+animal+calcium+imaging+of+the+geniculate+ganglion.">Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion.</a> Protocol Exchange. , 106 (2015).</li><li>Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rewiring+the+taste+system.">Rewiring the taste system.</a> Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>. dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/5817461">https://gist.github.com/ackman678/5817461</a> (2014)</li><li>Cantu, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZcalcium:+Open-source+toolbox+for+analysis+of+calcium+imaging+data.">EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data.</a> Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sour+sensing+from+the+tongue+to+the+brain.">Sour sensing from the tongue to the brain.</a> Cell. 179 (2), 392-402 (2019).</li><li>Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+logic+of+sensory+coding+revealed+by+optical+tagging+of+physiologically-defined+neuronal+types.">A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types.</a> bioRxiv. , 692079 (2019).</li><li>Moeyaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+marking+active+neuron+populations.">Improved methods for marking active neuron populations.</a> Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).</li></ol>

يصف هذا العمل بروتوكول خطوة بخطوة لفضح العقدة الجينية جراحيا وتسجيل نشاط خلاياها العصبية بصريا باستخدام GCaMP6s. هذا الإجراء مشابه جدا لتلك التي وصفت سابقا17، مع استثناءات ملحوظة قليلة. أولا ، استخدام منصب رئيس يسمح لتعديل سهل لتحديد المواقع في الرأس أثناء الجراحة. ثانيا، فيما ي?...

أحد المكونات الرئيسية لنظام الذوق المحيطي للثدييات هو العقدة الجينية. بالإضافة إلى بعض الخلايا العصبية الحسية التي ت الداخلي بينا الأذن، ويتكون geniculate من أجسام الخلايا العصبية gustatory الداخلية اللسان الأمامي والحنك. على غرار الخلايا العصبية الحسية الطرفية الأخرى ، فإن الخلايا العصبية العقدية الجينية هي أحادية القطب الزائفة مع محور عصبي طويل إسقاط هامشيا لبراعم الذوق ، ومركزية إلى نواة جذع الدماغ في الجهاز الانفرادي1. يتم تنشيط هذه الخلايا العصبية في المقام الأول عن طريق الافراج عن ATP من قبل خلايا مستقبلات الذوق الاستجابة لمحفزات الذوق في تجويف الفم2,3. ATP هو ناقل عصبي أساسي للإشارات الذوق, ومستقبلات P2rx التي أعرب عنها الخلايا العصبية العقدة gustatory ضروريةلتفعيلها 4. وبالنظر إلى أن خلايا مستقبلات الذوق تعبر عن مستقبلات طعم محددة لصيغة طعم معين (الحلو، المر، المالحة، أومامي، أو الحامض)، فقد افترض أن استجابات الخلايا العصبية العقدية gustatory لمحفزات الذوق سيكون أيضا ضبطها بشقالأنفس 5.
وقد أظهرت تسجيلات الأعصاب كلها على حد سواء و chorda tympani والأعصاب بتروسال متفوقة أكبر إجراء إشارات gustatory تمثل جميع طرائق الذوق الخمسة إلى العقدة geniculate6،7. ومع ذلك، هذا لا يزال يترك أسئلة حول خصوصية الاستجابات العصبية لتسانت معين: إذا كان هناك طريقة الذوق الخلايا العصبية محددة، والخلايا العصبية متعددة الوسائط، أو خليط من كليهما. تسجيلات الألياف واحدة تعطي المزيد من المعلومات حول نشاط الألياف الفردية والحساسيات الكيميائية8،9،10، ولكن هذه المنهجية تقتصر على جمع البيانات من أعداد صغيرة من الألياف. وبالمثل، في التسجيلات الكهربية في الجسم الحي من الخلايا العصبية العقدة geniculate الفئران الفردية تعطي معلومات حول استجابات الخلايا العصبية الفردية11،12،13، ولكن لا يزال يفقد نشاط السكان وتسفر عن تسجيلات الخلايا العصبية قليلة نسبيا لكل. من أجل تحليل أنماط الاستجابة للفرق العصبية دون إغفال نشاط الخلايا العصبية الفردية، وتقنيات جديدة تحتاج إلى استخدامها.
وقد وفرت التصوير الكالسيوم، وخاصة باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا مثل GCaMP، هذا الاختراق التقني14،15،16،17،18. يستخدم GCaMP الكالسيوم كوكيل لنشاط الخلايا العصبية ، مما يزيد من الفلورة الخضراء مع ارتفاع مستويات الكالسيوم داخل الخلية. أشكال جديدة من GCaMP لا تزال تتطور لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، وضبط الحركية ملزمة، والتكيف مع التجارب المتخصصة19. يوفر GCaMP دقة خلية عصبية واحدة ، على عكس التسجيل العصبي بأكمله ، ويمكنه في وقت واحد قياس استجابات مجموعات الخلايا العصبية ، على عكس الألياف الفردية أو تسجيل الخلايا الواحدة. وقد قدم تصوير الكالسيوم من العقدة geniculate بالفعل معلومات هامة حول ملامح ضبط هذه الخلايا العصبية في الفئران البرية من النوع16،20، وحددت الذوق المحيطي miswiring الأنماط الظاهرية في الفئران التلاعب وراثيا18.
إحدى الصعوبات الرئيسية لتطبيق تقنيات تصوير الكالسيوم في الجسم الحي على العقدة الجينية هي أنه مغلف داخل الثور التكتل العظمي. من أجل الحصول على الوصول البصري إلى geniculate ، مطلوب جراحة دقيقة لإزالة طبقات العظام ، مع الحفاظ على العقدة سليمة. لهذا الغرض، أنشأنا هذا الدليل لمساعدة الباحثين الآخرين على الوصول إلى العقدة الجينية وصورة استجابات GCaMP الفلورية بوساطة هذه الخلايا العصبية لتذوق المحفزات في الجسم الحي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 x #5 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NC9792102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe with luer lock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x #3 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>M3S 11200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge Blunt Dispensing Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1372532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0398332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Machine Screw Hex Nuts</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SNMS004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Socket Head Cap Screw</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SSCS04C004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Points</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-930-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acesulfame K</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A149025G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>59399-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>18200-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>MB8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A95-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Liquid</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Powder</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-062-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Head Post Holder</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202410.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Metal Head Post</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202406.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disection Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Clippers</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL7300-Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6195906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Ketaved</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cold Light Source</td>
			<td>Leica Mcrosystems</td>
			<td>KL300LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 1/16&#34; Tubing Adapters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-000-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series Optical Posts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1723230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXC-2.5 Rotatable probe Clamp</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>14030000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-947-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressurized air</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI Z300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC163720050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self Sticking Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>159015R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Pinch Valve Tubing 1/32&#34; x 1/16&#34; o.d. (per foot)</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sola SM Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap25-2A-GCaMP6s-D</td>
			<td>JAX</td>
			<td>025111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe Holder</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thread</td>
			<td>G&#252;termann</td>
			<td>02776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-046941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two Stage Gas Regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12FM244B580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon vinyl tubing - 1/16&#34;</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 digital/manual controller</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>17-pp-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Anased</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli

خلال السنوات العشر الماضية، عززت التطورات في مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) ثورة في التصوير الوظيفي في الجسم الحي. باستخدام الكالسيوم كوكيل لنشاط الخلايا العصبية، توفر هذه التقنيات وسيلة لرصد استجابات الخلايا الفردية داخل مجموعات الخلايا العصبية الكبيرة لمجموعة متنوعة من المحفزات في الوقت الحقيقي. نحن، وآخرون، قد طبقت هذه التقنيات لتصوير استجابات الخلايا العصبية العقدة geniculate الفردية لتذوق المحفزات المطبقة على ألسنة الفئران مخدر الحية. تتكون العقدة الجينية من أجسام الخلايا العصبية gustatory الداخلية اللسان الأمامي والحنك، فضلا عن بعض الخلايا العصبية الحسية سوماتوسوسي ت الداخلي بينا الأذن. وقد قدم تصوير الاستجابات التي أثارها الذوق من الخلايا العصبية العقدة geniculate الفردية مع GCaMP معلومات هامة حول ملامح ضبط هذه الخلايا العصبية في الفئران البرية من نوع فضلا عن وسيلة للكشف عن الأنماط الظاهرية الذوق المحيطي miswiring في الفئران التلاعب وراثيا. هنا نعرض الإجراء الجراحي لكشف العقدة الجينية ، واكتساب صورة GCaMP الفلورية ، والخطوات الأولية لتحليل البيانات ، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. يمكن استخدام هذه التقنية مع GCaMP المشفرة وراثيا ، أو مع تعبير GCaMP بوساطة AAV ، ويمكن تعديلها لتصوير مجموعات فرعية وراثية معينة ذات أهمية (أي تعبير GCaMP بوساطة Cre). عموما، في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي من الخلايا العصبية العقدة geniculate هو تقنية قوية لرصد نشاط الخلايا العصبية gustatory الطرفية ويوفر معلومات تكميلية لتسجيلات أكثر تقليدية وتر العصب كله tympani أو المقايسات سلوك الذوق.

بعد البروتوكول ، تم تخدير Snap25-GCaMP6s المعدل وراثيا ، وتم الكشف عن العقدة الجينية ، وتم تطبيق التذيل على اللسان أثناء تسجيل الفيديو. وكان الهدف من التجربة هو تحديد التيستات التي أثارت ردودا من كل خلية. تم إذابة التستانتس (30 mM AceK، 5 mM كوينين، 60 mM NaCl، 50 mM IMP + 1 mM MPG، 50 mM Citric Acid)18 في ماء DI و?...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli at JoVE.com

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

هنا نقدم كيفية فضح العقدة geniculate من حية، مخدر الماوس المختبر وكيفية استخدام التصوير الكالسيوم لقياس استجابات مجموعات من هذه الخلايا العصبية لتذوق المحفزات، مما يسمح لتجارب متعددة مع المنشطات المختلفة. وهذا يسمح لمقارنات متعمقة من الخلايا العصبية التي تستجيب التي التي tastants.

في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي من الماوس Geniculate استجابات الخلايا العصبية العقدية لتذوق المحفزات

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

هذه التقنية يمكن الإجابة على الأسئلة الوظيفية الهامة حول استجابات الخلايا العصبية لتذوق في العقدة geniculate, جزء حاسم من المسار الذوق وترا tympani الداخلية. يمكن استخدام هذه التقنية لمراقبة ردود الفعل في الوقت الحقيقي لعدة خلايا عصبية فردية في تجربة تجريبية واحدة ، حيث أن الخلايا المسجلة لكل أعلى بكثير مما لوحظ عادة عن طريق الطريقة الكهربية. مع الماوس المثبت على الرأس في وضع السطخ على وسادة التدفئة ، قم بإجراء شق منتصف الخط سنتيمترين في الجلد فوق الحلق ، من القص إلى الذقن.وتراجع الجلد والغدد شبه الفكية لفضح العضلات digastric تماما. بعد تحديد موقع التماس في العضلات paratracheal، فصل التماس مع تشريح حادة وسحب الأنسجة لفتحه. قطع بعناية فتحة في الجزء العلوي من القصبة الهوائية كبيرة بما يكفي لتناسب قطعة من أنابيب البولي ايثيلين دون قطع أكثر من منتصف الطريق من خلال قطر القصبة الهوائية وإدراج أنابيب في القصبة الهوائية نحو الرئتين.إعادة وضع الرافضات للافراج عن العضلات paratracheal والتراجع عن الغدد الفكية الفرعية. ثم، استخدم كمية صغيرة من الغراء البيطري لختم العضلات paratracheal معا على الأنبوب. لكسر فتح بولا التيمبية، ندف بلطف العضلات digastric المطلوب صعودا وسحب النسيج الضام وبصرف النظر.إجراء شق في الطرف الأمامي من العضلات، وتجنب الأوعية الدموية. وانسحب للخلف حتى تصبح واضحة من الثيران التيمبية إمالة الرأس إلى الوراء قليلا لرفع بولا التيمبية وتحديد فرع الشريان السباتي الأمامي إلى نقطة الإدراج الخلفي للعضلات digastric.بالبات فقط الخلفي لهذا الأوعية الدموية لهيكل محدب من بولا التيمبية وتحديد موقع التماس في العضلات. باستخدام مجموعتين من ملقط ناعم، تشريح حادة في التماس حتى عظم بولا التيمبية مرئية واستخدام الجرافات للحفاظ على رؤية واضحة للعظم. تحديد موقع التماس تشغيل الأمامي إلى الخلفي على بولا واستخدام مسبار جراحي لكزة ثقب في العظام في وسط التماس، ثم، واستخدام مجموعة من مقص نهاية غرامة لقطع منطقة دائرية في العظام، مع الحرص على عدم قطع الأوعية الدموية الأمامي والخلفي إلى أو تحت الثور.لكشف geniculate، حدد موقع القوقعة. الأمامي إلى القوقعة هو عضلة التيماني الشد. استخدام مقص الربيع لقطع وإزالة هذه العضلات.استخدام التحقيق الجراحي لكزة ثقب في الرعن cochlear واستخدام الشفط فورا لتنشق أي السائل الذي يتدفق من الحفرة. تكبير الثقب في القوقعة ، مع الحرص على عدم تلف الأوعية الدموية التي تحيط القوقعة ، إلى الحافة الخلفية والظريلية. وإمالة رأس الفأر إلى الأمام لتحديد موقع ثقب في العظام الزمنية تحت هيكل القوقعة السابقة.يحيط علما من الحافة الأمامية إلى الحفرة التي تقع مباشرة على العصب السابع. وأدخل مسبار جراحي في الحفرة للسماح برفع العظم الصدغي بعناية لفضح العصب السابع. إذا لم تكن geniculate مرئية تماما ، قم بإمالة رأس الحيوان بلطف إلى الخلف وحاول سحب الجزء الأمامي من العظام إلى العصب.إذا كانت العقدة لا تزال غامضة، وسحب ما يصل المزيد من العظام من تحت، مع الحرص على عدم وضع التحقيق العميق تحت العظام، لأن هذا قد يضر geniculate. لتشغيل لوحة التسطان، استخدم الشفط لإزالة السائل من فوق geniculate ووضع الماوس على لوحة ماصة تحت المجهر تشريح. استخدم الثقب المتبقي في الثيران، والثقب في العظم الصدغي، والعصب السابع لتحديد موقع العقدة الجينية.واستخدام فلتر FITCGFP على نطاق epifluorescent للتحقق من GCaMP الفردية التي تعبر عن الخلايا العصبية العقدة geniculate. ضع إبرة الاستغناء عن خط واحد من التسح بقوة في فم الحيوان ووضع طبق بيتري تحت الفم للقبض على أي سائل. مزامنة بداية تسجيل الفيديو مع بداية العرض التقديمي tastant، ومشاهدة البث المباشر للاستجابات والانجراف، وتسرب أثناء التسجيل.إذا حدث تسرب، شفط السائل حتى عرض geniculate واضحة وإعادة تسليم التستان. إذا حدث الانجراف، تحقق من أن جميع أجزاء الرأس يتم تشديدها بشدة. إذا لم تحدث استجابة، تحقق من أن السائل يتدفق وأن المجهر والكاميرا يركزان على الموقع المناسب دون أي شيء يحجب مجال الرؤية.عند الانتهاء من جميع التجارب المطلوبة، تخفيف بلطف الواجهات وتكرار التعرض وتحليل تذوق على الجانب الآخر من الحيوان. كما لوحظ، ومحفزات الذوق المطبقة على اللسان ينبغي أن يؤدي إلى زيادة عابرة سريعة في مضان GCaMP، مما تسبب في تغيير ملحوظ في السطوع بين الخلايا العصبية المستجيبة. يسمح تحليل لقطات الفيديو الفلورية بتوليد آثار تتوافق مع التغيرات في الفلورسينس على الاستجابة الأساسية داخل المناطق الفردية ذات الاهتمام بمرور الوقت.وتعتبر التغيرات في كثافة الفلورسينس فوق مستوى العتبة استجابة إيجابية. بالإضافة إلى إتلاف العقدة ، من المهم تجنب النزيف. في حالة حدوث نزيف، انتظر حتى يتخثر الدم قبل وضع المحلول الملحي والشفط لإزالة الدم من المجال البصري.وقد سمح تصور العقدة geniculate الباحثين لقياس مباشرة استجابات الخلايا العصبية لتذوق مثل المحفزات وتحديد هذه الخلايا العصبية مع أدوات مثل GCaMP تعتمد على كري.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

التصوير الكالسيوم من الردود، رائحة أثار في ذبابة الفاكهة لوب Antennal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

الردود الكالسيوم في الخلايا العصبية التصوير GFP الموسومة تحت المهاد البصري من شرائح مخ الفأر

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

الطريقة الكهربية لالردود تسجيل بين الخلايا الجهد ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء وInterneurons إلى النور المحفزات<em&gt; في فيفو</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

التصوير المقطعي التماسك البصري: التصوير الماوس العقدة الشبكية خلايا في فيفو

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم لتصور استجابات الدماغ للإشارات الغدد الصماء في المورفولوجية

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

استخدام العصبية النشاط Spiking لتحريك المحفزات حلقه مغلقه في التجارب الفسيولوجية العصبية

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

إعداد الكبار Drosophila melanogaster لتصوير الدماغ كله أثناء السلوك والمحفزات الاستجابات

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...