Name: in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli
Uploaded: 2021-02-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli at JoVE.com

Forfatterne takker S. Humayun for musehold. Finansieringen af dette arbejde er til dels blevet ydet af UTSA's Brain Health Consortium Graduate og Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) og NIH-SC2-GM130411 til LJ.M.

Dyreprotokoller blev gennemgået og godkendt af de institutionelle dyrepleje- og brugsudvalg ved University of Texas San Antonio.
1. Præoperativ opsætning
BEMÆRK: Bemærk, at den første opsætning af udstyr ikke er behandlet her, da det vil variere afhængigt af pumpesystem, mikroskop, kamera og billedbehandlingssoftware, der bruges. Du kan finde en installationsvejledning til instruktionsmaterialer fra udstyrsleverandøren. For udstyr, der anvendes af forfatterne...

<ol>
	<li>Krimm, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+regulate+embryonic+gustatory+development.">Factors that regulate embryonic gustatory development.</a> BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).</li><li>Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+taste+cells+lacking+synapses+mediate+neurotransmission?+CALHM1,+a+voltage-gated+ATP+channel.">How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel.</a> Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).</li><li>Taruno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+transduction+and+channel+synapses+in+taste+buds.">Taste transduction and channel synapses in taste buds.</a> Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).</li><li>Kinnamon, S. C., Finger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taste+for+ATP:+neurotransmission+in+taste+buds.">A taste for ATP: neurotransmission in taste buds.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste.">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li><li>Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+sense+about+taste:+from+mammals+to+insects.">Common sense about taste: from mammals to insects.</a> Cell. 139 (2), 234-244 (2009).</li><li>Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+neural+response+in+the+mouse.">Gustatory neural response in the mouse.</a> Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).</li><li>Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opponent+effects+of+quinine+and+sucrose+on+single+fiber+taste+responses+of+the+chorda+tympani+nerve.">Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve.</a> Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).</li><li>Frank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+classification+of+mammalian+afferent+taste+nerve+fibers.">The classification of mammalian afferent taste nerve fibers.</a> Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).</li><li>Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+gustatory+nerve+fiber+discharge+pattern+with+change+in+stimulus+concentration+and+quality.">Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality.</a> Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).</li><li>Sollars, S. I., Hill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recordings+from+rat+geniculate+ganglia:+taste+response+properties+of+individual+greater+superficial+petrosal+and+chorda+tympani+neurones.">In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones.</a> Journal of Physiology. 564, 877-893 (2005).</li><li>Yokota, Y., Bradley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geniculate+ganglion+neurons+are+multimodal+and+variable+in+receptive+field+characteristics.">Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics.</a> Neuroscience. 367, 147-158 (2017).</li><li>Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+modulates+taste+responsiveness+and+stimulates+gustatory+neurons+in+the+rat+geniculate+ganglion.">Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion.</a> Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits:+A+decade+of+progress.">Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress.</a> Neuron. 98 (4), 865 (2018).</li><li>Barreto, R. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517, 373-376 (2015).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+animal+calcium+imaging+of+the+geniculate+ganglion.">Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion.</a> Protocol Exchange. , 106 (2015).</li><li>Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rewiring+the+taste+system.">Rewiring the taste system.</a> Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>. dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/5817461">https://gist.github.com/ackman678/5817461</a> (2014)</li><li>Cantu, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZcalcium:+Open-source+toolbox+for+analysis+of+calcium+imaging+data.">EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data.</a> Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sour+sensing+from+the+tongue+to+the+brain.">Sour sensing from the tongue to the brain.</a> Cell. 179 (2), 392-402 (2019).</li><li>Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+logic+of+sensory+coding+revealed+by+optical+tagging+of+physiologically-defined+neuronal+types.">A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types.</a> bioRxiv. , 692079 (2019).</li><li>Moeyaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+marking+active+neuron+populations.">Improved methods for marking active neuron populations.</a> Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).</li></ol>

Dette arbejde beskriver en trin-for-trin protokol til kirurgisk at udsætte geniculate ganglion og visuelt registrere aktiviteten af sine neuroner med GCaMP6s. Denne procedure ligner meget den, der tidligere er beskrevet17, med nogle få bemærkelsesværdige undtagelser. For det første giver brugen af en hovedstolpe mulighed for nem justering af hovedpositionering under operationen. For det andet, med hensyn til stimulus levering, tilgangen af Wu og Dvoryanchikov flyder smag stimuli gennem spiser...

En vigtig del af pattedyrets perifere smagssystem er den geniculate ganglion. Ud over nogle somatosensoriske neuroner, der innerverer ørets pinna, består geniculaten af cellelegemerne af gustatory neuroner innervating den forreste tunge og gane. Svarende til andre perifere sensoriske neuroner, de geniculate ganglion neuroner er pseudo-unipolar med en lang axon projicere perifert til smagsløg, og centralt til hjernestammen kernen i den ensomme tarmkanalen1. Disse neuroner aktiveres primært ved frigivelse af ATP af smagsreceptorceller, der reagerer på smagsstimuli i mundhulen2,3. ATP er en vigtig neurotransmitter til smag signalering, og P2rx receptorer udtrykt af gustatory ganglion neuroner er nødvendige for deres aktivering4. I betragtning af at smag receptor celler udtrykke specifikke smag receptorer for en bestemt smag modalitet (sød, bitter, salt, umami, eller sur), er det blevet antaget, at gustatory ganglion neuron reaktioner på smag stimuli ville også være snævert tunet5.
Hele nerveoptagelser har vist både chorda tympani og de større overlegne petrosale nerver foretage gustatory signaler, der repræsenterer alle fem smag modaliteter til geniculate ganglion6,7. Dette efterlod dog stadig spørgsmål om specificiteten af neuronale reaktioner på en given smag: hvis der er smagsmodalitet specifikke neuroner, polymodale neuroner eller en blanding af begge. Enkelt fiber optagelser giver mere information om aktiviteten af de enkelte fibre og deres kemiske følsomheder8,9,10, men denne metode er begrænset til at indsamle data fra et lille antal fibre. På samme måde giver in vivo elektrofysiologiske optagelser af individuelle rottegenulate ganglion neuroner oplysninger om de enkelte neuroners svar11,12,13, men mister stadig befolkningens aktivitet og giver relativt få neuronoptagelser pr. Dyr. For at analysere responsmønstrene hos neuronale ensembler uden at tabe aktiviteten af individuelle neuroner af syne, skulle der anvendes nye teknikker.
Calcium imaging, især ved hjælp af genetisk kodede calcium indikatorer som GCaMP, har givet dette tekniske gennembrud14,15,16,17,18. GCaMP bruger calcium som en proxy for neuronal aktivitet, øge grøn fluorescens som calcium niveauer i cellen stige. Nye former for GCaMP fortsætter med at blive udviklet for at forbedre signal til støj-forholdet, justere bindende kinetika, og tilpasse sig specialiserede eksperimenter19. GCaMP giver enkelt neuron opløsning, i modsætning til hele nerve optagelse, og kan samtidig måle svar fra ensembler af neuroner, i modsætning til enkelt fiber eller enkelt celle optagelse. Calcium imaging af geniculate ganglier har allerede givet vigtige oplysninger om tuning profiler af disse neuroner i vilde-type mus16,20, og har identificeret perifer smag miswiring fænotyper i genetisk manipulerede mus18.
Et stort problem at anvende in vivo calcium imaging teknikker tilgeniculate ganglion er, at det er indkapslet i knoglet tympanic bulla. For at opnå optisk adgang til geniculate kræves delikat kirurgi for at fjerne knoglernes lag, samtidig med at ganglionen holdes intakt. Til dette formål har vi skabt denne vejledning for at hjælpe andre forskere med at få adgang til den geniculate ganglion og billede GCaMP medierede fluorescerende reaktioner af disse neuroner til at smage stimuli in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 x #5 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NC9792102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe with luer lock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x #3 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>M3S 11200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge Blunt Dispensing Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1372532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0398332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Machine Screw Hex Nuts</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SNMS004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Socket Head Cap Screw</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SSCS04C004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Points</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-930-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acesulfame K</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A149025G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>59399-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>18200-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>MB8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A95-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Liquid</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Powder</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-062-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Head Post Holder</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202410.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Metal Head Post</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202406.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disection Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Clippers</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL7300-Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6195906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Ketaved</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cold Light Source</td>
			<td>Leica Mcrosystems</td>
			<td>KL300LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 1/16&#34; Tubing Adapters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-000-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series Optical Posts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1723230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXC-2.5 Rotatable probe Clamp</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>14030000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-947-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressurized air</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI Z300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC163720050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self Sticking Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>159015R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Pinch Valve Tubing 1/32&#34; x 1/16&#34; o.d. (per foot)</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sola SM Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap25-2A-GCaMP6s-D</td>
			<td>JAX</td>
			<td>025111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe Holder</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thread</td>
			<td>G&#252;termann</td>
			<td>02776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-046941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two Stage Gas Regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12FM244B580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon vinyl tubing - 1/16&#34;</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 digital/manual controller</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>17-pp-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Anased</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli

Inden for de sidste ti år har fremskridt inden for genetisk kodede calciumindikatorer (GEFI'er) fremmet en revolution inden for in vivo funktionel billeddannelse. Ved hjælp af calcium som en proxy for neuronal aktivitet, disse teknikker giver en måde at overvåge svarene fra de enkelte celler i store neuronale ensembler til en række stimuli i realtid. Vi og andre har anvendt disse teknikker til at afbilde svarene fra individuelle geniculate ganglion neuroner for at smage stimuli, der påføres tungen på levende bedøvede mus. Den geniculate ganglion består af cellelegemer af gustatory neuroner innervating den forreste tunge og gane samt nogle somatosensoriske neuroner innervating pinna af øret. Imaging den smag-fremkaldte svar af individuelle geniculate ganglion neuroner med GCaMP har givet vigtige oplysninger om tuning profiler af disse neuroner i vilde-type mus samt en måde at opdage perifer smag miswiring fænotyper i genetisk manipulerede mus. Her demonstrerer vi den kirurgiske procedure for at eksponere den geniculate ganglion, GCaMP fluorescens billedopsamling, indledende trin til dataanalyse og fejlfinding. Denne teknik kan bruges med transgenisk kodet GCaMP, eller med AAV-medieret GCaMP udtryk, og kan ændres til billede særlige genetiske delmængder af interesse (dvs. Cre-medieret GCaMP udtryk). Samlet set in vivo calcium imaging af geniculate ganglion neuroner er en kraftfuld teknik til overvågning af aktiviteten af perifere gustatory neuroner og giver supplerende oplysninger til mere traditionelle hele nerve chorda tympani optagelser eller smag adfærd assays.

Efter protokollen blev et transgent Snap25-GCaMP6s-dyr bedøvet, geniculate ganglier blev udsat, og der blev anvendt smagsstoffer på tungen, mens videoen blev optaget. Formålet med eksperimentet var at definere, hvilke smagsmaganter fremkaldte svar fra hver celle. Smagsstoffer (30 mM AceK, 5 mM Kinin, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM citronsyre)18 blev opløst i DI vand og blev anvendt på tungen i 2 s adskilt af 13 s DI vand.
<...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli at JoVE.com

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Her præsenterer vi, hvordan man udsætter den geniculate ganglion af en levende, bedøvet laboratoriemus og hvordan man bruger calcium imaging til at måle svarene fra ensembler af disse neuroner til at smage stimuli, der giver mulighed for flere forsøg med forskellige stimulanser. Dette giver mulighed for dybdegående sammenligninger, som neuroner reagerer på hvilke smagsstoffer.

In vivo Calcium Imaging af Mus Geniculate Ganglion Neuron Svar på Smag Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

Denne teknik kan besvare vigtige funktionelle spørgsmål om neuronal reaktion på smag i geniculate ganglier, en afgørende del af den indvendige chorda tympani smag vej. Denne teknik kan bruges til at overvåge realtidsreaktioner fra flere individuelle neuroner i et enkelt eksperimentelt forsøg, da celler registreret pr. dyr er betydeligt højere end typisk observeret via den elektrofysiologiske metode. Med den hovedstol monterede mus i liggende position på en varmepude, lav et to centimeter midterlinje snit i huden over halsen, fra brystbenet til hagen.Og træk huden og sub-maxillary kirtler til fuldt ud at udsætte de digastriske muskler. Efter at have lokaliseret sømmen i paratracheal muskulatur, adskille sømmen med stump dissektion og trække vævet tilbage for at åbne den. Skær forsigtigt en åbning i toppen af luftrøret stort nok til at passe et stykke polyethylen slanger uden at skære mere end halvvejs gennem diameteren af luftrøret og indsætte slangen i luftrøret mod lungerne.Flyt retraktorerne for at frigøre paratracheal muskulaturen og trække sub maxillary kirtlerne tilbage. Brug derefter en lille mængde veterinær lim til at forsegle paratracheal muskulatur sammen over røret. For at bryde den tympaniske bulla op, forsigtigt drille den ønskede digastriske muskel opad og trække bindevævet fra hinanden.Lav et snit i den forreste ende af musklen, undgå blodkarrene. Og træk tilbage posteriorly indtil fri af den tympaniske bulla. Vip hovedet lidt tilbage for at løfte den tympaniske bulla og lokalisere grenen af halspulsåren forreste til det bageste indsætningspunkt for digastrisk muskel.Palpate bare posterior til dette blodkar for konveks struktur af tympanic bulla og finde en søm i muskulaturen. Ved hjælp af to sæt fine sammenkr vil du stump dissekere ved sømmen, indtil knoglen på den tympaniske bulla er synlig og bruge retraktorer til at holde et klart overblik over knoglen. Find sømmen kører forreste til posterior på bulla og bruge en kirurgisk sonde til at stikke et hul i knoglen i midten af sømmen, Så brug et sæt fine ende saks til at skære et cirkulært område i knoglen, passe på ikke at skære blodkar forreste og posterior til eller under bulla.For at eksponere geniculate skal du finde cochlea. Forreste til cochlea er tensor tympani muskel. Brug fjedersaks til at skære og fjerne denne muskel.Brug den kirurgiske sonde til at stikke et hul i cochlear forbjerget og straks bruge sugning til at aspirere enhver væske, der strømmer ud af hullet. Forstør hullet i cochlea, idet du sørger for ikke at beskadige blodkarret, der omkranser cochlea, til den bageste og laterale kant. Og vip musens hoved fremad for at finde hullet i den tidsmæssige knogle under den tidligere cochlear struktur.Vær opmærksom på højderyggen forreste til hullet, der sidder direkte over den syvende nerve. Og indsæt en kirurgisk sonde i hullet for at tillade, at den tidsmæssige knogle forsigtigt løftes for at udsætte den syvende nerve. Hvis geniculate ikke er fuldt synlig, hældes dyrets hoved forsigtigt tilbage og forsøger at trække knoglen forreste til nerven.Hvis ganglieren stadig er skjult, skal du trække mere knogle op nedefra og passe på ikke at placere sonden dybt under knoglen, da dette kan beskadige geniculaten. For at køre det velsmagende panel skal du bruge suget til at fjerne væsken fra over geniculaten og placere musen på en absorberende pude under et dissekeringmikroskop. Brug hullet tilbage i bulla, hullet i den tidsmæssige knogle, og den syvende nerve til at finde den geniculate ganglion.Og brug FITCGFP-filteret på epifluorescent-området til at kontrollere for individuelle GCaMP, der udtrykkergeniculate ganglion neuroner. Placer dispenseringsnålen til en smagslinje fast i dyrets mund, og læg en petriskål under munden for at fange væske. Synkroniser starten af videooptagelsen med starten af den smagfulde præsentation, og se livefeedet for svar, drift og nedsivning under optagelsen.Hvis der opstår nedsivning, skal du suge væsken, indtil visningen af geniculaten er klar og genopleve smagsvæsken. Hvis afdrift opstår, skal du kontrollere, at alle dele af hovedstolpen er fast strammet. Hvis der ikke opstår noget svar, skal du kontrollere, at væsken flyder, og at mikroskopet og kameraet er fokuseret på den rigtige placering, uden at noget tilslører synsfeltet.Når alle de ønskede eksperimenter er afsluttet, lettes retraktorerne forsigtigt og gentager eksponeringen og smagsanalysen på den modsatte side af dyret. Som observeret bør smagsstimuli, der påføres tungen, resultere i en hurtig forbigående stigning i GCaMP fluorescens, hvilket forårsager en mærkbar ændring i lysstyrken blandt de reagerende neuroner. Analyse af fluorescensvideooptagelser gør det muligt at frembringe spor svarende til ændringerne i fluorescensen i forhold til baselineresponset i de enkelte interesseregioner over tid.Ændringer i fluorescensintensiteten over tærskelværdien betragtes som et positivt svar. Ud over at beskadige ganglieren er det vigtigt at undgå blødning. Hvis blødning opstår, vente på blodet til at størkne, før du anvender saltvand og suge for at fjerne blodet fra synsfeltet.Visualisering af de geniculate ganglier har gjort det muligt for forskere at direkte måle neuronernes reaktioner på smagslignende stimuli og identificere disse neuroner med værktøjer som Cre-afhængige GCaMP.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Calcium Imaging af lugt-fremkaldte reaktioner i Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Calcium respons i GFP-mærkede neuroner i hypothalamus musehjerne Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Elektrofysiologiske Metode til Recording Intracellulær Voltage Responses af<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptorer og interneuroner til Light Stimuli<em&gt; In vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optisk kohærens tomografi: Imaging mus Retinal Ganglion celler In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging til at visualisere hjernen svar til hormonforstyrrende signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Brug neuron spiking aktivitet til at udløse lukkede loop stimuli i neurofysiologiske eksperimenter

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Forberedelse voksen Drosophila melanogaster til hele hjernen Imaging under adfærd og Stimuli Svar

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...