Name: in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli
Uploaded: 2021-02-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli at JoVE.com

De auteurs bedanken S. Humayun voor de muizenhouderij. Financiering voor dit werk is gedeeltelijk verstrekt door UTSA's Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) en NIH-SC2-GM130411 aan L.J.M.

Dierprotocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van de University of Texas San Antonio.
1. Pre-operatieve installatie
OPMERKING: Houd er rekening mee dat de eerste installatie van apparatuur hier niet wordt behandeld, omdat deze varieert op basis van het gebruikte pompsysteem, microscoop, camera en beeldbewerkingssoftware. Raadpleeg voor installatie-instructies het instructiemateriaal van de leverancier van de appa...

<ol>
	<li>Krimm, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+regulate+embryonic+gustatory+development.">Factors that regulate embryonic gustatory development.</a> BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).</li><li>Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+taste+cells+lacking+synapses+mediate+neurotransmission?+CALHM1,+a+voltage-gated+ATP+channel.">How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel.</a> Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).</li><li>Taruno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+transduction+and+channel+synapses+in+taste+buds.">Taste transduction and channel synapses in taste buds.</a> Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).</li><li>Kinnamon, S. C., Finger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taste+for+ATP:+neurotransmission+in+taste+buds.">A taste for ATP: neurotransmission in taste buds.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste.">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li><li>Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+sense+about+taste:+from+mammals+to+insects.">Common sense about taste: from mammals to insects.</a> Cell. 139 (2), 234-244 (2009).</li><li>Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+neural+response+in+the+mouse.">Gustatory neural response in the mouse.</a> Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).</li><li>Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opponent+effects+of+quinine+and+sucrose+on+single+fiber+taste+responses+of+the+chorda+tympani+nerve.">Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve.</a> Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).</li><li>Frank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+classification+of+mammalian+afferent+taste+nerve+fibers.">The classification of mammalian afferent taste nerve fibers.</a> Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).</li><li>Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+gustatory+nerve+fiber+discharge+pattern+with+change+in+stimulus+concentration+and+quality.">Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality.</a> Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).</li><li>Sollars, S. I., Hill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recordings+from+rat+geniculate+ganglia:+taste+response+properties+of+individual+greater+superficial+petrosal+and+chorda+tympani+neurones.">In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones.</a> Journal of Physiology. 564, 877-893 (2005).</li><li>Yokota, Y., Bradley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geniculate+ganglion+neurons+are+multimodal+and+variable+in+receptive+field+characteristics.">Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics.</a> Neuroscience. 367, 147-158 (2017).</li><li>Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+modulates+taste+responsiveness+and+stimulates+gustatory+neurons+in+the+rat+geniculate+ganglion.">Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion.</a> Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits:+A+decade+of+progress.">Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress.</a> Neuron. 98 (4), 865 (2018).</li><li>Barreto, R. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517, 373-376 (2015).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+animal+calcium+imaging+of+the+geniculate+ganglion.">Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion.</a> Protocol Exchange. , 106 (2015).</li><li>Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rewiring+the+taste+system.">Rewiring the taste system.</a> Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>. dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/5817461">https://gist.github.com/ackman678/5817461</a> (2014)</li><li>Cantu, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZcalcium:+Open-source+toolbox+for+analysis+of+calcium+imaging+data.">EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data.</a> Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sour+sensing+from+the+tongue+to+the+brain.">Sour sensing from the tongue to the brain.</a> Cell. 179 (2), 392-402 (2019).</li><li>Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+logic+of+sensory+coding+revealed+by+optical+tagging+of+physiologically-defined+neuronal+types.">A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types.</a> bioRxiv. , 692079 (2019).</li><li>Moeyaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+marking+active+neuron+populations.">Improved methods for marking active neuron populations.</a> Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).</li></ol>

Dit werk beschrijft een stapsgewijs protocol om het geniculate ganglion operatief bloot te leggen en de activiteit van zijn neuronen visueel vast te leggen met GCaMP6s. Deze procedure lijkt erg op die eerder beschreven17, met een paar opmerkelijke uitzonderingen. Ten eerste zorgt het gebruik van een hoofdpost voor een eenvoudige aanpassing van de hoofdpositie tijdens de operatie. Ten tweede, met betrekking tot stimulusafgifte, stroomt de aanpak van Wu en Dvoryanchikov smaakprikkels door slokdarmbu...

Een belangrijk onderdeel van het perifere smaaksysteem van zoogdieren is het geniculate ganglion. Naast enkele somatosensorische neuronen die de pinna van het oor innerveren, bestaat het geniculate uit de cellichamen van smaakneuronen die de voorste tong en het gehemelte innerveren. Net als andere perifere sensorische neuronen zijn de geniculate ganglionneuronen pseudo-unipolair met een lang axon dat perifeer projecteert naar de smaakpapillen en centraal naar de hersenstamkern van het solitaire kanaal1. Deze neuronen worden voornamelijk geactiveerd door de afgifte van ATP door smaakreceptorcellen die reageren op smaakprikkels in de mondholte2,3. ATP is een essentiële neurotransmitter voor smaaksignalering en P2rx-receptoren uitgedrukt door de smaakganglionneuronen zijn nodig voor hun activering4. Gezien het feit dat smaakreceptorcellen specifieke smaakreceptoren uitdrukken voor een bepaalde smaakmodaliteit (zoet, bitter, zout, umami of zuur), is verondersteld dat smaakganglionneuronreacties op smaakprikkels ook nauw afgestemd zouden zijn5.
Hele zenuwopnamen hebben aangetoond dat zowel de chorda tympani als de grotere superieure petrosale zenuwen smaaksignalen geleiden die alle vijf smaakmodaliteiten vertegenwoordigen voor het geniculate ganglion6,7. Dit liet echter nog steeds vragen over de specificiteit van neuronale reacties op een bepaalde smaakstof: als er smaakmodaliteitsspecifieke neuronen, polymodale neuronen of een mengsel van beide zijn. Enkelvoudige vezelopnamen geven meer informatie over de activiteit van individuele vezels en hun chemische gevoeligheden8,9,10,maar deze methodologie is beperkt tot het verzamelen van gegevens van kleine aantallen vezels. Evenzo geven in vivo elektrofysiologische opnames van individuele ratgeniculate ganglionneuronen informatie over de reacties van individuele neuronen11,12,13, maar verliezen nog steeds de activiteit van de populatie en leveren relatief weinig neuronregistraties per dier op. Om de responspatronen van neuronale ensembles te analyseren zonder de activiteit van individuele neuronen uit het oog te verliezen, moesten nieuwe technieken worden gebruikt.
Calciumbeeldvorming, vooral met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren zoals GCaMP, heeft deze technische doorbraakopgeleverd 14,15,16,17,18. GCaMP gebruikt calcium als een proxy voor neuronale activiteit, waardoor groene fluorescentie toeneemt naarmate het calciumgehalte in de cel stijgt. Nieuwe vormen van GCaMP worden nog steeds ontwikkeld om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, de bindingskinetiek aan te passen en aan te passen voor gespecialiseerde experimenten19. GCaMP biedt resolutie van één neuron, in tegenstelling tot hele zenuwopname, en kan tegelijkertijd reacties van ensembles van neuronen meten, in tegenstelling tot enkelvoudige vezel- of enkele celregistratie. Calciumbeeldvorming van de geniculate ganglia heeft al belangrijke informatie opgeleverd over de afstemmingsprofielen van deze neuronen in wild-type muizen16,20, en heeft perifere smaakmisdrading fenotypes geïdentificeerd in genetisch gemanipuleerde muizen18.
Een grote moeilijkheid bij het toepassen van in vivo calciumbeeldvormingstechnieken op het geniculate ganglion is dat het is ingekapseld in de benige trommelvliesbula. Om optische toegang tot het geniculate te verkrijgen, is delicate chirurgie vereist om de lagen botten te verwijderen, terwijl het ganglion intact blijft. Voor dat doel hebben we deze gids gemaakt om andere onderzoekers te helpen toegang te krijgen tot het geniculate ganglion en de GCaMP-gemedieerde fluorescerende reacties van deze neuronen op smaakstimuli in vivo in beeld te brengen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 x #5 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NC9792102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe with luer lock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x #3 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>M3S 11200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge Blunt Dispensing Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1372532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0398332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Machine Screw Hex Nuts</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SNMS004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Socket Head Cap Screw</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SSCS04C004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Points</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-930-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acesulfame K</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A149025G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>59399-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>18200-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>MB8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A95-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Liquid</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Powder</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-062-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Head Post Holder</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202410.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Metal Head Post</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202406.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disection Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Clippers</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL7300-Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6195906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Ketaved</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cold Light Source</td>
			<td>Leica Mcrosystems</td>
			<td>KL300LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 1/16&#34; Tubing Adapters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-000-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series Optical Posts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1723230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXC-2.5 Rotatable probe Clamp</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>14030000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-947-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressurized air</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI Z300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC163720050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self Sticking Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>159015R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Pinch Valve Tubing 1/32&#34; x 1/16&#34; o.d. (per foot)</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sola SM Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap25-2A-GCaMP6s-D</td>
			<td>JAX</td>
			<td>025111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe Holder</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thread</td>
			<td>G&#252;termann</td>
			<td>02776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-046941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two Stage Gas Regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12FM244B580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon vinyl tubing - 1/16&#34;</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 digital/manual controller</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>17-pp-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Anased</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli

In de afgelopen tien jaar heeft de vooruitgang in genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GESI's) een revolutie in in vivo functionele beeldvorming bevorderd. Met behulp van calcium als een proxy voor neuronale activiteit, bieden deze technieken een manier om de reacties van individuele cellen binnen grote neuronale ensembles op een verscheidenheid aan stimuli in realtime te volgen. Wij, en anderen, hebben deze technieken toegepast om de reacties van individuele geniculate ganglionneuronen op smaakprikkels toegepast op de tongen van levende verdoofde muizen in beeld te brengen. Het geniculate ganglion bestaat uit de cellichamen van smaakneuronen die de voorste tong en het gehemelte innerveren, evenals enkele somatosensorische neuronen die de pinna van het oor innerveren. Het in beeld brengen van de smaak-opgeroepen reacties van individuele geniculate ganglion neuronen met GCaMP heeft belangrijke informatie opgeleverd over de afstemmingsprofielen van deze neuronen in wild-type muizen, evenals een manier om perifere smaak misdrainende fenotypes in genetisch gemanipuleerde muizen te detecteren. Hier demonstreren we de chirurgische procedure om het geniculate ganglion bloot te leggen, GCaMP fluorescentiebeeldacquisitie, eerste stappen voor gegevensanalyse en probleemoplossing. Deze techniek kan worden gebruikt met transgeen gecodeerde GCaMP of met AAV-gemedieerde GCaMP-expressie en kan worden gewijzigd om bepaalde genetische subsets van belang in beeld te brengen (d.w.z. Cre-gemedieerde GCaMP-expressie). Over het algemeen is in vivo calciumbeeldvorming van geniculate ganglionneuronen een krachtige techniek voor het monitoren van de activiteit van perifere smaakneuronen en biedt het aanvullende informatie aan meer traditionele chorda tympani-opnames van de hele zenuw of smaakgedragstests.

Volgens het protocol werd een transgeen Snap25-GCaMP6s-dier verdoofd, geniculate ganglia werden blootgesteld en tastant werd op de tong aangebracht terwijl video werd opgenomen. Het doel van het experiment was om te definiëren welke smaakstoffen reacties uitlokten van elke cel. Tastanten (30 mM AceK, 5 mM Kinine, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM Citroenzuur)18 werden opgelost in DI-water en werden gedurende 2 s gescheiden door 13 s DI-water op de tong aangebracht.
<p class="jove_conten...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli at JoVE.com

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Hier presenteren we hoe we het geniculate ganglion van een levende, verdoofde laboratoriummuis kunnen blootleggen en hoe calciumbeeldvorming kan worden gebruikt om de reacties van ensembles van deze neuronen op smaakprikkels te meten, waardoor meerdere proeven met verschillende stimulerende middelen mogelijk zijn. Dit maakt diepgaande vergelijkingen mogelijk van welke neuronen op welke smaakstoffen reageren.

In vivo calciumbeeldvorming van muis geniculate ganglion neuron reacties op smaakprikkels

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

Deze techniek kan belangrijke functionele vragen beantwoorden over neuronale reacties op smaak in de geniculate ganglia, een cruciaal onderdeel van de inwendige chorda tympani smaakroute. Deze techniek kan worden gebruikt om de real-time reacties van meerdere individuele neuronen in een enkele experimentele proef te volgen, omdat cellen die per dier worden geregistreerd aanzienlijk hoger zijn dan gewoonlijk wordt waargenomen via de elektrofysiologische methode. Met de op de hoofdpost gemonteerde muis in rugligging op een verwarmingskussen, maak een twee centimeter middellijnincisie in de huid over de keel, van het borstbeen tot de kin.En trek de huid en sub-maxillaire klieren terug om de digastrische spieren volledig bloot te leggen. Na het lokaliseren van de naad in de paratracheale musculatuur, scheidt u de naad met stompe dissectie en trekt u het weefsel terug om het te openen. Snijd voorzichtig een opening in de bovenkant van de luchtpijp die groot genoeg is om een stuk polyethyleenbuis te passen zonder meer dan halverwege de diameter van de luchtpijp te snijden en steek de slang in de luchtpijp richting de longen.Verplaats de retractors om de paratracheale musculatuur vrij te maken en trek de sub-maxillaire klieren terug. Gebruik vervolgens een kleine hoeveelheid veterinaire lijm om de paratracheale musculatuur samen over de buis af te sluiten. Om de trommelvliesbula open te breken, plaagt u de gewenste digastrische spier voorzichtig naar boven en trekt u het bindweefsel uit elkaar.Maak een incisie aan het voorste uiteinde van de spier en vermijd de bloedvaten. En trek je naar achteren terug totdat je vrij bent van de trommelvliesbula. Kantel het hoofd iets naar achteren om de trommelvliesbula op te tillen en lokaliseer de tak van de halsslagader anterieur naar het achterste inbrengpunt van de digastrische spier.Palpeer net achter dit bloedvat voor de bolle structuur van de trommelvliesbula en lokaliseer een naad in de musculatuur. Gebruik twee sets fijne tangen, ontleed stomp bij de naad totdat het bot van de trommelvliesbula zichtbaar is en gebruik retractors om een duidelijk zicht op het bot te houden. Lokaliseer de naad die van voor naar achter op de bulla loopt en gebruik een chirurgische sonde om een gat in het bot in het midden van de naad te prikken, gebruik vervolgens een set fijne eindschaar om een cirkelvormig gebied in het bot te knippen, waarbij u ervoor zorgt dat de bloedvaten niet vooraan en achteraan naar of onder de bulla worden gesneden.Om het geniculate bloot te leggen, lokaliseer je het slakkenhuis. Vooraan in het slakkenhuis bevindt zich de tensor tympani spier. Gebruik een voorjaarsschaar om deze spier te knippen en te verwijderen.Gebruik de chirurgische sonde om een gat in het cochleaire voorgebergte te prikken en gebruik onmiddellijk zuigkracht om vloeistof die uit het gat stroomt op te zuigen. Vergroot het gat in het slakkenhuis en zorg ervoor dat het bloedvat rond het slakkenhuis rond het slakkenhuis niet wordt beschadigd, naar de achterste en laterale rand. En kantel het hoofd van de muis naar voren om het gat in het temporale bot onder de voormalige cochleaire structuur te lokaliseren.Let op de richel voor het gat dat direct boven de zevende zenuw zit. En steek een chirurgische sonde in het gat om het temporale bot voorzichtig te kunnen optillen om de zevende zenuw bloot te leggen. Als het geniculate niet volledig zichtbaar is, kantelt u het hoofd van het dier voorzichtig naar achteren en probeert u het botanterieur naar de zenuw op te trekken.Als de ganglia nog steeds verduisterd is, trek dan meer bot van onderaf omhoog en zorg ervoor dat u de sonde niet diep onder het bot plaatst, omdat dit het geniculate kan beschadigen. Om het smakelijke paneel te laten werken, gebruikt u zuiging om de vloeistof over het geniculate te verwijderen en plaatst u de muis op een absorberend pad onder een ontleedmicroscoop. Gebruik het gat in de bulla, het gat in het temporale bot en de zevende zenuw om het ganglion van het geniculate te lokaliseren.En gebruik het FITCGFP-filter op de epifluorescente scope om te controleren op individuele GCaMP-expressie van geniculate ganglionneuronen. Plaats de doseernaald voor één smaaklijn stevig in de mond van het dier en plaats een petrischaaltje onder de mond om eventuele vloeistof op te vangen. Synchroniseer het begin van de video-opname met het begin van de smakelijke presentatie en bekijk de live feed voor reacties, drift en kwel tijdens de opname.Als er kwel optreedt, zuigt u de vloeistof op totdat het zicht op het geniculaat helder is en voert u het smakelijke opnieuw uit. Als er drift optreedt, controleer dan of alle delen van de hoofdpost stevig zijn aangedraaid. Als er geen reactie optreedt, controleer dan of de vloeistof stroomt en of de microscoop en camera op de juiste locatie zijn gericht zonder dat het gezichtsveld wordt verduisterd.Wanneer alle gewenste experimenten zijn voltooid, laat u de retractors voorzichtig uit en herhaalt u de blootstelling en smakelijke analyse aan de andere kant van het dier. Zoals waargenomen, zouden smaakprikkels die op de tong worden toegepast, moeten resulteren in een snelle voorbijgaande toename van GCaMP-fluorescentie, waardoor een merkbare verandering in helderheid tussen de reagerende neuronen ontstaat. Analyse van de fluorescentievideobeelden maakt het mogelijk sporen te genereren die overeenkomen met de veranderingen in fluorescentie gedurende de basisrespons binnen individuele gebieden van belang in de loop van de tijd.Veranderingen in de fluorescentie-intensiteit boven het drempelniveau worden als een positieve respons beschouwd. Naast het beschadigen van de ganglia, is het belangrijk om bloedingen te voorkomen. Als er een bloeding optreedt, wacht dan tot het bloed stolt voordat u zoutoplossing en zuiging aanbrengt om het bloed uit het gezichtsveld te verwijderen.Visualisatie van de geniculate ganglia heeft onderzoekers in staat gesteld om de reacties van neuronen op smaakachtige stimuli direct te meten en deze neuronen te identificeren met hulpmiddelen zoals Cre-afhankelijk gcaMP.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Calcium Imaging van Geur-reacties van de consument in de Drosophila Antennaal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Calcium Reacties in GFP-gelabelde neuronen van de hypothalamus Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Elektrofysiologische Methode voor opname intracellulaire Voltage Reacties van<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptoren en Interneurons naar Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optische coherentie tomografie: Beeldvorming muis retinale Ganglion cellen In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Met behulp van neuron spiking activiteit trigger gesloten-lus stimuli in neurofysiologische experimenten

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Volwassen Drosophila melanogaster voorbereiden op whole brain imaging tijdens gedrags- en stimulireacties

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...