Name: in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli
Uploaded: 2021-02-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli at JoVE.com

Die Autoren danken S. Humayun für die Maushaltung. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde teilweise durch den Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) und NIH-SC2-GM130411 der UTSA an L.J.M bereitgestellt.

Tierprotokolle wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees der University of Texas San Antonio überprüft und genehmigt.
1. Präoperative Einrichtung
HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass die Ersteinrichtung der Ausrüstung hier nicht behandelt wird, da sie je nach Verwendeten Pumpensystem, Mikroskop, Kamera und Bildgebungssoftware variiert. Anweisungen zur Einrichtung finden Sie in den Anleitungsmaterialien des Geräteherstellers. Für die von den Autore...

<ol>
	<li>Krimm, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+regulate+embryonic+gustatory+development.">Factors that regulate embryonic gustatory development.</a> BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).</li><li>Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+taste+cells+lacking+synapses+mediate+neurotransmission?+CALHM1,+a+voltage-gated+ATP+channel.">How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel.</a> Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).</li><li>Taruno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+transduction+and+channel+synapses+in+taste+buds.">Taste transduction and channel synapses in taste buds.</a> Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).</li><li>Kinnamon, S. C., Finger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taste+for+ATP:+neurotransmission+in+taste+buds.">A taste for ATP: neurotransmission in taste buds.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+modulates+taste+responsiveness+and+stimulates+gustatory+neurons+in+the+rat+geniculate+ganglion.">Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion.</a> Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits:+A+decade+of+progress.">Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress.</a> Neuron. 98 (4), 865 (2018).</li><li>Barreto, R. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517, 373-376 (2015).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+animal+calcium+imaging+of+the+geniculate+ganglion.">Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion.</a> Protocol Exchange. , 106 (2015).</li><li>Lee, H., Macpherson, L. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>. dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/5817461">https://gist.github.com/ackman678/5817461</a> (2014)</li><li>Cantu, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZcalcium:+Open-source+toolbox+for+analysis+of+calcium+imaging+data.">EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data.</a> Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sour+sensing+from+the+tongue+to+the+brain.">Sour sensing from the tongue to the brain.</a> Cell. 179 (2), 392-402 (2019).</li><li>Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+logic+of+sensory+coding+revealed+by+optical+tagging+of+physiologically-defined+neuronal+types.">A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types.</a> bioRxiv. , 692079 (2019).</li><li>Moeyaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+marking+active+neuron+populations.">Improved methods for marking active neuron populations.</a> Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).</li></ol>

Diese Arbeit beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um das geniculate Ganglion chirurgisch freizulegen und die Aktivität seiner Neuronen mit GCaMP6s visuell aufzuzeichnen. Dieses Verfahren ist dem zuvor beschriebenen17sehr ähnlich, mit einigen bemerkenswerten Ausnahmen. Erstens ermöglicht die Verwendung eines Kopfpfostens eine einfache Anpassung der Kopfpositionierung während der Operation. Zweitens, in Bezug auf die Stimulusabgabe, fließt der Ansatz von Wu und Dvoryanchikov Geschmack...

Eine Schlüsselkomponente des peripheren Geschmackssystems von Säugetieren ist das geniculate Ganglion. Zusätzlich zu einigen somatosensorischen Neuronen, die die Pinna des Ohres innervieren, besteht das Genikulat aus den Zellkörpern von Gustatorneuronen, die die vordere Zunge und den Gaumen innervieren. Ähnlich wie andere periphere sensorische Neuronen sind die geniculaten Ganglienneuronen pseudo-unipolar mit einem langen Axon, das peripher auf die Geschmacksknospen und zentral auf den Hirnstammkern des Solitärtraktsprojiziert 1. Diese Neuronen werden in erster Linie durch die Freisetzung von ATP durch Geschmacksrezeptorzellen aktiviert, die auf Geschmacksreize in der Mundhöhle reagieren2,3. ATP ist ein essentieller Neurotransmitter für die Geschmackssignalisierung, und P2rx-Rezeptoren, die von den gustatorischen Ganglienneuronen exprimiert werden, sind für ihre Aktivierung notwendig4. Angesichts der Tatsache, dass Geschmacksrezeptorzellen spezifische Geschmacksrezeptoren für eine bestimmte Geschmacksmodalität (süß, bitter, salzig, Umami oder sauer) exprimieren, wurde die Hypothese aufgestellt, dass gustatorische Ganglienneuronreaktionen auf Geschmacksreize ebenfalls eng abgestimmt wären5.
Ganze Nervenaufnahmen haben gezeigt, dass sowohl die Chorda-Tympani als auch die größeren oberen Petrosalnerven Gustatoriken leiten, die alle fünf Geschmacksmodalitäten zum geniculaten Ganglion6,7darstellen. Dies ließ jedoch immer noch Fragen über die Spezifität neuronaler Reaktionen auf ein bestimmtes Tastant offen: wenn es geschmacksmodalitätsspezifische Neuronen, polymodale Neuronen oder eine Mischung aus beidem gibt. Einzelfaseraufzeichnungen geben mehr Informationen über die Aktivität einzelner Fasern und ihre chemischenEmpfindlichkeiten 8,9,10, aber diese Methodik beschränkt sich auf die Erfassung von Daten aus einer kleinen Anzahl von Fasern. In ähnlicher Weise geben elektrophysiologische In-vivo-Aufzeichnungen einzelner Genikulat-Ganglienneuronen von Ratten Aufschluss über die Reaktionen einzelner Neuronen11,12,13, verlieren aber immer noch die Aktivität der Population und liefern relativ wenige Neuronenaufnahmen pro Tier. Um die Reaktionsmuster neuronaler Ensembles zu analysieren, ohne die Aktivität einzelner Neuronen aus den Augen zu verlieren, mussten neue Techniken eingesetzt werden.
Die Calcium-Bildgebung, insbesondere unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren wie GCaMP, hat diesen technischen Durchbruch gebracht14,15,16,17,18. GCaMP verwendet Kalzium als Proxy für neuronale Aktivität und erhöht die grüne Fluoreszenz, wenn der Kalziumspiegel in der Zelle ansteigt. Neue Formen von GCaMP werden weiterhin entwickelt, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, die Bindungskinetik anzupassen und sich für spezialisierte Experimente anzupassen19. GCaMP bietet im Gegensatz zur Aufzeichnung ganzer Nerven eine Auflösung einzelner Neuronen und kann im Gegensatz zur Einzelfaser- oder Einzelzellaufzeichnung gleichzeitig die Reaktionen von Ensembles von Neuronen messen. Die Calcium-Bildgebung der Genikulatganglien hat bereits wichtige Informationen über die Tuning-Profile dieser Neuronen bei Wildtyp-Mäusen16,20geliefert und periphere Geschmacksfehlverdrahtungsphänotypen bei genetisch manipulierten Mäusen identifiziert18.
Eine große Schwierigkeit bei der Anwendung von In-vivo-Calcium-Bildgebungstechniken auf das geniculate Ganglion besteht darin, dass es in der knöchernen Paukenbulle eingekapselt ist. Um einen optischen Zugang zum Genikulat zu erhalten, ist eine heikle Operation erforderlich, um die Knochenschichten zu entfernen und gleichzeitig das Ganglion intakt zu halten. Zu diesem Zweck haben wir diesen Leitfaden erstellt, um anderen Forschern den Zugang zum geniculaten Ganglion zu helfen und die GCaMP-vermittelten fluoreszierenden Reaktionen dieser Neuronen abbilden, um Reize in vivo zu schmecken.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1 x #5 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NC9792102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe with luer lock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x #3 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>M3S 11200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge Blunt Dispensing Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1372532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0398332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Machine Screw Hex Nuts</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SNMS004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Socket Head Cap Screw</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SSCS04C004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Points</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-930-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acesulfame K</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A149025G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>59399-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>18200-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>MB8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A95-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Liquid</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Powder</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-062-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Head Post Holder</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202410.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Metal Head Post</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202406.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disection Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Clippers</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL7300-Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6195906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Ketaved</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cold Light Source</td>
			<td>Leica Mcrosystems</td>
			<td>KL300LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 1/16&#34; Tubing Adapters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-000-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series Optical Posts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1723230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXC-2.5 Rotatable probe Clamp</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>14030000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-947-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressurized air</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI Z300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC163720050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self Sticking Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>159015R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Pinch Valve Tubing 1/32&#34; x 1/16&#34; o.d. (per foot)</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sola SM Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap25-2A-GCaMP6s-D</td>
			<td>JAX</td>
			<td>025111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe Holder</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thread</td>
			<td>G&#252;termann</td>
			<td>02776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-046941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two Stage Gas Regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12FM244B580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon vinyl tubing - 1/16&#34;</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 digital/manual controller</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>17-pp-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Anased</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli

In den letzten zehn Jahren haben Fortschritte bei genetisch kodierten Kalziumindikatoren (GECIs) eine Revolution in der funktionellen In-vivo-Bildgebung gefördert. Mit Kalzium als Proxy für neuronale Aktivität bieten diese Techniken eine Möglichkeit, die Reaktionen einzelner Zellen innerhalb großer neuronaler Ensembles auf eine Vielzahl von Reizen in Echtzeit zu überwachen. Wir und andere haben diese Techniken angewendet, um die Reaktionen einzelner genikulater Ganglienneuronen auf Geschmacksreize abbilden, die auf die Zungen lebender anästhesierierter Mäuse angewendet werden. Das geniculate Ganglion besteht aus den Zellkörpern von Gustatorneuronen, die die vordere Zunge und den Gaumen innervieren, sowie einigen somatosensorischen Neuronen, die die Pinna des Ohres innervieren. Die Abbildung der geschmacksbedingten Reaktionen einzelner genikulater Ganglienneuronen mit GCaMP hat wichtige Informationen über die Tuning-Profile dieser Neuronen bei Wildtyp-Mäusen sowie eine Möglichkeit zum Nachweis peripherer Geschmacksfehlverdrahtungsphänotypen bei genetisch manipulierten Mäusen geliefert. Hier demonstrieren wir den chirurgischen Eingriff zur Freilegen des geniculaten Ganglions, die GCaMP-Fluoreszenzbildaufnahme, erste Schritte zur Datenanalyse und die Fehlerbehebung. Diese Technik kann mit transgen kodiertem GCaMP oder mit AAV-vermittelter GCaMP-Expression verwendet und modifiziert werden, um bestimmte genetische Untergruppen von Interesse abbilden (d. H. Cre-vermittelte GCaMP-Expression). Insgesamt ist die In-vivo-Calcium-Bildgebung von geniculaten Ganglien-Neuronen eine leistungsstarke Technik zur Überwachung der Aktivität peripherer Gustator-Neuronen und liefert ergänzende Informationen zu traditionelleren Ganznerven-Chorda-Tympani-Aufnahmen oder Geschmacksverhaltenstests.

Nach dem Protokoll wurde ein transgenes Snap25-GCaMP6s-Tier sediert, genulierte Ganglien wurden freigelegt und Tastant wurde während der Videoaufnahme auf die Zunge aufgetragen. Ziel des Experiments war es zu definieren, welche Tastants Reaktionen aus jeder Zelle hervorrief. Tastantien (30 mM AceK, 5 mM Chinin, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM Zitronensäure)18 wurden in DI-Wasser gelöst und 2 s getrennt durch 13 s DI-Wasser auf die Zunge aufgetragen.
<p class="jove_content" fo:keep-t...

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In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Hier präsentieren wir, wie man das genikulierte Ganglion einer lebenden, betäubten Labormaus freilegt und wie man Kalziumbildgebung verwendet, um die Reaktionen von Ensembles dieser Neuronen auf Geschmacksreize zu messen, was mehrere Versuche mit verschiedenen Stimulanzien ermöglicht. Dies ermöglicht detaillierte Vergleiche, welche Neuronen auf welche Tastants reagieren.

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Reaktionen auf Geschmacksreize

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

Diese Technik kann wichtige funktionelle Fragen über neuronale Reaktionen auf den Geschmack in den genikulären Ganglien beantworten, einem entscheidenden Teil des inneren Chorda-Tympani-Geschmackswegs. Diese Technik kann verwendet werden, um die Echtzeitreaktionen mehrerer einzelner Neuronen in einer einzigen experimentellen Studie zu überwachen, da die pro Tier aufgezeichneten Zellen signifikant höher sind als typischerweise mit der elektrophysiologischen Methode beobachtet. Mit der am Kopfpfosten montierten Maus in Rückenlage auf einem Heizkissen machen Sie einen zwei Zentimeter mittleren Schnitt in der Haut über dem Hals, vom Brustbein bis zum Kinn.Und ziehen Sie die Haut und die Unterkieferdrüsen zurück, um die digastrischen Muskeln vollständig freizulegen. Nachdem Sie die Naht in der paratrachealen Muskulatur lokalisiert haben, trennen Sie die Naht mit stumpfer Dissektion und ziehen Sie das Gewebe zurück, um es zu öffnen. Schneiden Sie vorsichtig eine Öffnung in der Oberseite der Luftröhre, die groß genug ist, um ein Stück Polyethylenschlauch zu montieren, ohne mehr als die Hälfte des Durchmessers der Luftröhre zu schneiden, und führen Sie den Schlauch in die Luftröhre in Richtung Lunge ein.Positionieren Sie die Retraktoren neu, um die paratracheale Muskulatur freizugeben und die Unterkieferdrüsen zurückzuziehen. Verwenden Sie dann eine kleine Menge Veterinärkleber, um die paratracheale Muskulatur über dem Schlauch zu versiegeln. Um die Paukenbulle aufzubrechen, necken Sie den gewünschten Digastrinnenmuskel vorsichtig nach oben und ziehen Sie das Bindegewebe auseinander.Machen Sie einen Schnitt am vorderen Ende des Muskels und vermeiden Sie die Blutgefäße. Und ziehen Sie sich nach hinten zurück, bis die Paukenbulle frei ist. Neigen Sie den Kopf leicht nach hinten, um die Paukenbulle anzuheben, und lokalisieren Sie den Ast der Halsschlagader vor der hinteren Einstichstelle des Digastritoriumsmuskels.Palpatieren Sie nur hinter diesem Blutgefäß für die konvexe Struktur der Paukenbulle und lokalisieren Sie eine Naht in der Muskulatur. Mit zwei Sätzen feiner Zangen an der Naht stumpf sezieren, bis der Knochen der Paukenbulla sichtbar ist, und verwenden Sie Retraktoren, um eine klare Sicht auf den Knochen zu behalten. Lokalisieren Sie die Naht, die vorne bis nach hinter auf der Bulla verläuft, und verwenden Sie eine chirurgische Sonde, um ein Loch in den Knochen in der Mitte der Naht zu stechen, dann verwenden Sie eine feine Endschere, um einen kreisförmigen Bereich im Knochen zu schneiden, wobei Sie darauf achten, die Blutgefäße nicht vor und hinter oder unter der Bulla zu schneiden.Um das Genikulat freizulegen, lokalisieren Sie die Cochlea. Anterior zur Cochlea befindet sich der Tensor-Tympani-Muskel. Verwenden Sie eine Federschere, um diesen Muskel zu schneiden und zu entfernen.Verwenden Sie die chirurgische Sonde, um ein Loch in das Cochlea-Vorgebirge zu stechen, und saugen Sie sofort an, um jede Flüssigkeit abzusaugen, die aus dem Loch fließt. Vergrößern Sie das Loch in der Cochlea und achten Sie darauf, das Blutgefäß, das die Cochlea umgibt, nicht am hinteren und seitlichen Rand zu beschädigen. Und neigen Sie den Kopf der Maus nach vorne, um das Loch im Schläfenbein unter der ehemaligen Cochlea-Struktur zu lokalisieren.Beachten Sie den Grat vor dem Loch, das direkt über dem siebten Nerv sitzt. Und führen Sie eine chirurgische Sonde in das Loch ein, damit der Schläfenbein vorsichtig angehoben werden kann, um den siebten Nerv freizulegen. Wenn das Genikulat nicht vollständig sichtbar ist, neigen Sie den Kopf des Tieres vorsichtig nach hinten und versuchen Sie, den Knochen vor dem Nerv hochzuziehen.Wenn die Ganglien noch verdeckt sind, ziehen Sie mehr Knochen von unten nach oben und achten Sie darauf, die Sonde nicht tief unter dem Knochen zu platzieren, da dies das Genikulat schädigen kann. Um das Tastant-Panel zu betreiben, verwenden Sie abgesaugt, um die Flüssigkeit über dem Genikulat zu entfernen und legen Sie die Maus auf ein saugfähiges Pad unter einem Seziermikroskop. Verwenden Sie das Loch in der Bulla, das Loch im Schläfenbein und den siebten Nerv, um das geniculate Ganglion zu lokalisieren.Und verwenden Sie den FITCGFP-Filter auf dem epifluoreszierenden Zielfernrohr, um nach einzelnen GCaMP-exprimierenden genulären Ganglienneuronen zu suchen. Legen Sie die Dosiernadel für eine Tastant-Linie fest in den Mund des Tieres und legen Sie eine Petrischale unter den Mund, um Flüssigkeit aufzufangen. Synchronisieren Sie den Beginn der Videoaufzeichnung mit dem Beginn der präsentation und beobachten Sie den Live-Feed auf Antworten, Drift und Versickerung während der Aufnahme.Wenn Versickerung auftritt, saugen Sie die Flüssigkeit ab, bis die Sicht auf das Genikulat klar ist, und versenden Sie das Tastant erneut. Wenn Drift auftritt, überprüfen Sie, ob alle Teile des Kopfpfostens fest angezogen sind. Wenn keine Reaktion auftritt, überprüfen Sie, ob die Flüssigkeit fließt und dass das Mikroskop und die Kamera auf die richtige Stelle fokussiert sind, ohne dass das Sichtfeld verdeckt wird.Wenn alle gewünschten Experimente abgeschlossen sind, erleichtern Sie die Retraktoren vorsichtig und wiederholen Sie die Exposition und die Tastantanalyse auf der gegenüberliegenden Seite des Tieres. Wie beobachtet, sollten Geschmacksreize, die auf die Zunge angewendet werden, zu einem schnellen vorübergehenden Anstieg der GCaMP-Fluoreszenz führen, was zu einer spürbaren Helligkeitsänderung unter den reagierenden Neuronen führt. Die Analyse des Fluoreszenz-Videomaterials ermöglicht die Erzeugung von Spuren, die den Veränderungen der Fluoreszenz über die Baseline-Reaktion innerhalb einzelner interessierenden Regionen im Laufe der Zeit entsprechen.Änderungen der Fluoreszenzintensität oberhalb des Schwellenwertes gelten als positive Reaktion. Neben der Schädigung der Ganglien ist es wichtig, Blutungen zu vermeiden. Wenn Blutungen auftreten, warten Sie, bis das Blut gerinnt, bevor Sie Kochsalzlösung und Absaugung auftragen, um das Blut aus dem Gesichtsfeld zu entfernen.Die Visualisierung der Genikulatganglien hat es den Forschern ermöglicht, die Reaktionen von Neuronen auf geschmacksähnliche Reize direkt zu messen und diese Neuronen mit Werkzeugen wie Cre-abhängigem GCaMP zu identifizieren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

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Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

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The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

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Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

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Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

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Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

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