Name: in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli
Uploaded: 2021-02-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli at JoVE.com

המחברים מודים לס. הומאיון על גידול העכברים. מימון עבור עבודה זו ניתן בחלקו על ידי בוגר הקונסורציום לבריאות המוח של UTSA ומענק זרע פוסט-דוקטורט (B.E.F.) ו- NIH-SC2-GM130411 ל- L.J.M.

פרוטוקולים של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת טקסס סן אנטוניו.
1. התקנה טרום ניתוחית
הערה: שים לב כי ההתקנה הראשונית של הציוד אינה מטופלת כאן, שכן היא תשתנה בהתאם למערכת המשאבה, המיקרוסקופ, המצלמה ותוכנת ההדמ...

<ol>
	<li>Krimm, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+regulate+embryonic+gustatory+development.">Factors that regulate embryonic gustatory development.</a> BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).</li><li>Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+taste+cells+lacking+synapses+mediate+neurotransmission?+CALHM1,+a+voltage-gated+ATP+channel.">How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel.</a> Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).</li><li>Taruno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+transduction+and+channel+synapses+in+taste+buds.">Taste transduction and channel synapses in taste buds.</a> Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).</li><li>Kinnamon, S. C., Finger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taste+for+ATP:+neurotransmission+in+taste+buds.">A taste for ATP: neurotransmission in taste buds.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste.">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li><li>Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+sense+about+taste:+from+mammals+to+insects.">Common sense about taste: from mammals to insects.</a> Cell. 139 (2), 234-244 (2009).</li><li>Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+neural+response+in+the+mouse.">Gustatory neural response in the mouse.</a> Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).</li><li>Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opponent+effects+of+quinine+and+sucrose+on+single+fiber+taste+responses+of+the+chorda+tympani+nerve.">Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve.</a> Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).</li><li>Frank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+classification+of+mammalian+afferent+taste+nerve+fibers.">The classification of mammalian afferent taste nerve fibers.</a> Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).</li><li>Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+gustatory+nerve+fiber+discharge+pattern+with+change+in+stimulus+concentration+and+quality.">Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality.</a> Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).</li><li>Sollars, S. I., Hill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recordings+from+rat+geniculate+ganglia:+taste+response+properties+of+individual+greater+superficial+petrosal+and+chorda+tympani+neurones.">In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones.</a> Journal of Physiology. 564, 877-893 (2005).</li><li>Yokota, Y., Bradley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geniculate+ganglion+neurons+are+multimodal+and+variable+in+receptive+field+characteristics.">Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics.</a> Neuroscience. 367, 147-158 (2017).</li><li>Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+modulates+taste+responsiveness+and+stimulates+gustatory+neurons+in+the+rat+geniculate+ganglion.">Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion.</a> Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits:+A+decade+of+progress.">Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress.</a> Neuron. 98 (4), 865 (2018).</li><li>Barreto, R. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517, 373-376 (2015).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+animal+calcium+imaging+of+the+geniculate+ganglion.">Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion.</a> Protocol Exchange. , 106 (2015).</li><li>Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rewiring+the+taste+system.">Rewiring the taste system.</a> Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>. dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/5817461">https://gist.github.com/ackman678/5817461</a> (2014)</li><li>Cantu, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZcalcium:+Open-source+toolbox+for+analysis+of+calcium+imaging+data.">EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data.</a> Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sour+sensing+from+the+tongue+to+the+brain.">Sour sensing from the tongue to the brain.</a> Cell. 179 (2), 392-402 (2019).</li><li>Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+logic+of+sensory+coding+revealed+by+optical+tagging+of+physiologically-defined+neuronal+types.">A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types.</a> bioRxiv. , 692079 (2019).</li><li>Moeyaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+marking+active+neuron+populations.">Improved methods for marking active neuron populations.</a> Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).</li></ol>

עבודה זו מתארת פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לחשוף בניתוח את גנגליון geniculate ולתעד חזותית את הפעילות של הנוירונים שלה עם GCaMP6s. הליך זה דומה מאוד לזה שתואר קודם לכן17, עם כמה יוצאים מן הכלל בולטים. ראשית, השימוש בתנוחת ראש מאפשר התאמה קלה של מיצוב הראש במהלך הניתוח. שנית, לגבי משלוח גירוי...

מרכיב מרכזי במערכת הטעם ההיקפית של היונקים הוא גנגליון geniculate. בנוסף לכמה נוירונים סומטוסנסוריים המ innervate את הפינה של האוזן, geniculate מורכב מגופי התא של נוירונים gustatory innervating הלשון והחך הצפוניים. בדומה לנוירונים חושיים היקפיים אחרים, נוירוני הגנגליון הגנולטים הם פסאודו-חד קוטביים עם אקסון ארוך המקרין באופן היקפי לבלוטות הטעם, ובמרכז לגרעין גזע המוח של מערכת הבודדת1. נוירונים אלה מופעלים בעיקר על ידי שחרור של ATP על ידי תאי קולטן טעם המגיבים לגירויים טעם בחלל הפה2,3. ATP הוא נוירוטרנסמיטר חיוני עבור איתות טעם, קולטני P2rx לידי ביטוי על ידי נוירונים גנגליון gustatory נחוצים להפעלתם4. בהתחשב בכך שתאי קולטן הטעם מבטאים קולטני טעם ספציפיים עבור מודאליות טעם מסוימת (מתוק, מריר, מלוח, אומאמי, או חמוץ), ההשערה היא כי תגובות נוירון גנגליון gustatory טעם גירויים יהיה גם מכוון בקושי5.
הקלטות עצבים שלמות הראו הן את chorda tympani ואת העצבים פטרוסאלי מעולה גדול יותר לבצע אותות gustatory המייצגים את כל חמש שיטות הטעם כדי גנגליון geniculate6,7. עם זאת, זה עדיין השאיר שאלות על הספציפיות של תגובות עצביות לטעם נתון: אם יש מודאליות טעם נוירונים ספציפיים, נוירונים פולימודליים, או תערובת של שניהם. הקלטות סיבים בודדים לתת מידע נוסף על הפעילות של סיבים בודדים רגישויות כימיות שלהם8,9,10, אבל מתודולוגיה זו מוגבלת לאיסוף נתונים ממספר קטן של סיבים. באופן דומה, בהקלטות אלקטרופיזיולוגיות vivo של נוירוני גנגליון geniculate חולדה בודדים לתת מידע על התגובות של נוירונים בודדים11,12,13, אבל עדיין מאבד את הפעילות של האוכלוסייה ומניב הקלטות נוירון מעט יחסית לכל חיה. על מנת לנתח את דפוסי התגובה של הרכבים עצביים מבלי לאבד את הפעילות של נוירונים בודדים, טכניקות חדשות צריך להיות מועסק.
הדמיית סידן, במיוחד באמצעות אינדיקטורים סידן מקודד גנטית כמו GCaMP, סיפק פריצת דרך טכנית זו14,15,16,17,18. GCaMP משתמש בסידן כבא כוח לפעילות עצבית, הגדלת פלואורסצנטיות ירוקה ככל שרמות הסידן בתוך התא עולות. צורות חדשות של GCaMP ממשיכות להיות מפותחות כדי לשפר את יחס האות לרעש, להתאים קינטיקה מחייבת, ולהתאים לניסויים מיוחדים19. GCaMP מספק רזולוציית נוירון יחיד, שלא כמו הקלטת עצב שלמה, והוא יכול בו זמנית למדוד תגובות של הרכבים של נוירונים, שלא כמו סיב יחיד או הקלטת תא יחיד. הדמיית סידן של הגרעינים geniculate כבר סיפק מידע חשוב על פרופילי כוונון של נוירונים אלה בעכברים מסוג בר16,20, וזיהה טעם היקפי חיווט פנוטיפים במניפולציה גנטית עכברים18.
אחד הקושיים העיקריים ליישם בטכניקות הדמיית סידן ויוו על גנגליון geniculate הוא שזה עטוף בתוך בולה טימפנית גרמית. על מנת לקבל גישה אופטית geniculate, ניתוח עדין נדרש כדי להסיר את שכבות העצמות, תוך שמירה על הגנגליון שלם. לשם כך, יצרנו מדריך זה כדי לעזור לחוקרים אחרים לגשת לגנגליון geniculate ולדמות את GCaMP מתווך תגובות פלואורסצנטיות של נוירונים אלה לטעום גירויים ב vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 x #5 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NC9792102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe with luer lock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x #3 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>M3S 11200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge Blunt Dispensing Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1372532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0398332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Machine Screw Hex Nuts</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SNMS004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Socket Head Cap Screw</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SSCS04C004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Points</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-930-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acesulfame K</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A149025G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>59399-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>18200-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>MB8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A95-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Liquid</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Powder</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-062-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Head Post Holder</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202410.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Metal Head Post</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202406.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disection Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Clippers</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL7300-Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6195906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Ketaved</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cold Light Source</td>
			<td>Leica Mcrosystems</td>
			<td>KL300LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 1/16&#34; Tubing Adapters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-000-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series Optical Posts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1723230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXC-2.5 Rotatable probe Clamp</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>14030000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-947-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressurized air</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI Z300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC163720050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self Sticking Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>159015R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Pinch Valve Tubing 1/32&#34; x 1/16&#34; o.d. (per foot)</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sola SM Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap25-2A-GCaMP6s-D</td>
			<td>JAX</td>
			<td>025111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe Holder</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thread</td>
			<td>G&#252;termann</td>
			<td>02776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-046941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two Stage Gas Regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12FM244B580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon vinyl tubing - 1/16&#34;</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 digital/manual controller</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>17-pp-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Anased</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli

בעשר השנים האחרונות, ההתקדמות במדדי סידן (GECIs) המקודדים גנטית קידמה מהפכה בהדמיה תפקודית של vivo. באמצעות סידן כבא כוח לפעילות עצבית, טכניקות אלה מספקות דרך לפקח על התגובות של תאים בודדים בתוך הרכבים עצביים גדולים למגוון גירויים בזמן אמת. אנחנו, ואחרים, יישמנו טכניקות אלה כדי לדמיין את התגובות של נוירונים גנגליון geniculate בודדים לטעום גירויים להחיל על הלשונות של עכברים מרדים חיים. הגנגליון הגנולט מורכב מגופי התא של נוירונים גוסטטוריים המחדירים את הלשון והחך העורפיים, כמו גם כמה נוירונים סומטוסנסוריים המחדירים את הפינה של האוזן. הדמיית התגובות מעוררות הטעם של נוירוני גנגליון geniculate בודדים עם GCaMP סיפק מידע חשוב על פרופילי כוונון של נוירונים אלה בעכברים מסוג בר, כמו גם דרך לזהות פנוטיפים טעם היקפי miswiing בעכברים מניפולציה גנטית. כאן אנו מדגימים את ההליך הכירורגי כדי לחשוף את גנגליון geniculate, רכישת תמונה פלואורסצנטית GCaMP, צעדים ראשוניים לניתוח נתונים, ופתרון בעיות. טכניקה זו יכולה לשמש עם GCaMP מקודד מהונדס, או עם ביטוי GCaMP בתיווך AAV, וניתן לשנות אותה לתמונה תת-קבוצות גנטיות מסוימות של עניין (כלומר, ביטוי GCaMP בתיווך Cre). בסך הכל, בהדמיית סידן ויו של נוירוני גנגליון geniculate היא טכניקה רבת עוצמה לניטור הפעילות של נוירונים גוסטטוריים היקפיים ומספקת מידע משלים להקלטות מסורתיות יותר של chorda tympani עצב שלם או טעם התנהגות ישבן.

בעקבות הפרוטוקול, חיה מהונדסת Snap25-GCaMP6s היה מסומם, גרעינים geniculate נחשפו, ו tastant הוחל על הלשון בזמן וידאו הוקלט. מטרת הניסוי הייתה להגדיר אילו תיחומות עוררו תגובות מכל תא. תמציתים (30 מ"מ AceK, 5 mM כינין, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 מ"מ חומצת לימון)18 היו מומסים במי DI והוחלו על הלשון עבור 2 s מופרדי...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli at JoVE.com

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

כאן אנו מציגים כיצד לחשוף את גנגליון geniculate של עכבר מעבדה חי, מרדים וכיצד להשתמש הדמיית סידן כדי למדוד את התגובות של הרכבים של נוירונים אלה לטעום גירויים, המאפשר ניסויים מרובים עם ממריצים שונים. זה מאפשר השוואות מעמיקות של אילו נוירונים מגיבים לאו תיוהמים.

In vivo סידן הדמיה של עכבר גניציה גנגליון נוירון תגובות לגירויים טעם

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

טכניקה זו יכולה לענות על שאלות פונקציונליות חשובות על תגובות עצביות לטעום הגרעינים geniculate, חלק מכריע של מסלול הטעם צ'ורדה טימפאני הפנימי. טכניקה זו יכולה לשמש לניטור התגובות בזמן אמת של נוירונים בודדים מרובים בניסוי ניסיוני יחיד, שכן תאים שנרשמו לכל חיה גבוהים באופן משמעותי ממה שנצפו בדרך כלל בשיטה האלקטרופיזיולוגית. עם העכבר רכוב על עמוד הראש בתנוחת העל-אדמה על כרית חימום, בצע חתכת קו האמצע של שני ס"מ בעור מעל הגרון, מעצם החזה לסנטר.ולחזר את העור ואת בלוטות תת-מקסילארי לחשוף באופן מלא את השרירים digastric. לאחר איתור התפר בשריר הפרצ'אל, להפריד את התפר עם ניתוח קהה ולבטל את הרקמה כדי לפתוח אותו. חותכים בזהירות פתח בחלק העליון של קנה הנשימה גדול מספיק כדי להתאים חתיכת צינורות פוליאתילן מבלי לחתוך יותר ממחצית הדרך דרך הקוטר של קנה הנשימה ולהכניס את הצינורות לתוך קנה הנשימה לכיוון הריאות.מקם מחדש את המפסקים כדי לשחרר את השרירים paratracheal ולבטל את בלוטות מקסילארי המשנה. לאחר מכן, השתמש בכמות קטנה של דבק וטרינרי כדי לאטום את השרירים paratracheal יחד מעל הצינור. כדי לשבור את הבולה הטימפנית, להקניט בעדינות את השריר digastric הרצוי כלפי מעלה ולמשוך את רקמת החיבור לגזרים.לעשות חותך בקצה האחורי של השריר, הימנעות כלי הדם. ולמשוך לאחור לאחור עד נקי של bulla טימפני. הטה את הראש מעט לאחור כדי להרים את הבולה הטימפנית ולאתר את הענף של העורק הראשי הקדמי לנקודת הכניסה האחורית של השריר digastric.יש לפשל רק אחורי לכלי הדם הזה למבנה הקמור של הבולה הטימפנית ולאתר תפר בשרירים. באמצעות שני סטים של מלקחיים עדינים, לנתח קהה בתפר עד העצם של bulla tympanic גלוי ולהשתמש מפסקים כדי לשמור על תצוגה ברורה של העצם. אתר את התפר פועל הקדמי כדי אחורי על bulla ולהשתמש בדיקה כירורגית לתקוע חור בעצם במרכז התפר, ולאחר מכן, להשתמש קבוצה של מספריים קצה עדין לחתוך אזור מעגלי בעצם, דואג לא לחתוך כלי דם הקדמי והאחורי אל או מתחת bulla.כדי לחשוף את ההיגיינה, אתר את השבלול. החלק האחורי של השבלול הוא שריר הטנסור טימפני. השתמש מספריים קפיץ לחתוך ולהסיר את השריר הזה.השתמש בדיקה כירורגית כדי לתקוע חור בצהרת שבלול ומיד להשתמש בשאיבה כדי לשאוף כל נוזל שזורם מתוך החור. להגדיל את החור שבלול, דואג לא לפגוע בכלי הדם האופפת את השבלול, לקצה האחורי והלבטי. ולהטות את ראשו של העכבר קדימה כדי לאתר את החור בעצם הטמפורלית מתחת למבנה שבלול לשעבר.שימו לב לרכס החם לחור שיושב ישירות מעל העצב השביעי. ולהכניס בדיקה כירורגית לתוך החור כדי לאפשר לעצם הטמפורלית להיות מורמת בזהירות כדי לחשוף את העצב השביעי. אם geniculate אינו גלוי לחלוטין, בעדינות להטות את הראש של החיה בחזרה ולנסות למשוך את העצם האחורי אל העצב.אם הגרעינים עדיין מוסתרים, למשוך את העצם יותר מלמטה, דואג לא למקם את הגשוש עמוק מתחת לעצם, כמו זה עלול לפגוע geniculate. כדי להפעיל את לוח הטעם, השתמש בשאיבה כדי להסיר את הנוזל מעל geniculate ולהניח את העכבר על כרית סופגת תחת מיקרוסקופ ניתוח. השתמש בחור שנותר בבולה, החור בעצם הטמפורלית, ואת העצב השביעי כדי לאתר את גנגליון geniculate.ולהשתמש במסנן FITCGFP על היקף אפיפלואורסצנטי כדי לבדוק עבור GCaMP בודדים מבטאים גנגליון geniculate נוירונים. מניחים את המחט מחלק עבור קו אחד טעים בחוזקה לתוך הפה של החיה ומניחים צלחת פטרי מתחת לפה כדי לתפוס כל נוזל. סנכרן את תחילת הקלטת הווידאו עם תחילת המצגת הטעונה, צפייה בשידור החי לקבלת תגובות, סחף וחלחול במהלך ההקלטה.אם חלחול מתרחשת, שאיבה את הנוזל עד הנוף של geniculate ברור ומעביר מחדש את הטעים. אם מתרחשת סחף, בדוק שכל חלקי הראש מתהדקים היטב. אם לא מתרחשת תגובה, ודא שהנוזל זורם ושהמיקרוסקופ והמצלמה מתמקדים במיקום הנכון מבלי שמשהו יטשטש את שדה הראייה.כאשר כל הניסויים הרצויים הושלמו, הקל בעדינות על המפסקים וחזר על החשיפה והניתוח הטעים בצד השני של החיה. כפי שנצפו, גירויי טעם להחיל על הלשון צריך לגרום לעלייה ארעית מהירה פלואורסצנטיות GCaMP, גרימת שינוי ניכר בבהירות בקרב הנוירונים מגיבים. ניתוח קטעי הווידאו פלואורסצנטיים מאפשר יצירת עקבות המתאימים לשינויים בפלואורסצנטיות על התגובה הבסיסית בתוך אזורים בודדים של עניין לאורך זמן.שינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות מעל רמת הסף נחשבים לתגובה חיובית. בנוסף לפגיעה בגרעעים, חשוב להימנע מדימום. אם מתרחש דימום, המתן לקריש הדם לפני החלת תמיסת מלח ושאיבה כדי להסיר את הדם משדה הראייה.הדמיה של הגרעינים geniculate אפשרה לחוקרים למדוד ישירות את התגובות של נוירונים לגירויים דמויי טעם ולזהות נוירונים אלה עם כלים כגון GCaMP תלוי Cre.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית: הדמיה העכבר גנגליון תאים In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

שימוש בניותא פעילות העולה להדק לולאה סגורה גירויים בניסויים נוירולוגיים

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

הכנת מלנוגאסטר דרוזופילה למבוגרים להדמיית מוח שלמה במהלך תגובות התנהגות וגירויים

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...