Name: in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli
Uploaded: 2021-02-11T15:00:00
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著者らは、マウスの夫のためにS.フマユンに感謝します。この研究のための資金は、UTSAの脳健康コンソーシアムの卒業生とポスドクシードグラント(B.E.F.)とNIH-SC2-GM130411によってL.J.Mに提供されています。

動物のプロトコルは、テキサス大学サンアントニオ校の施設動物ケアと使用委員会によって見直され、承認されました。
1. 事前操作のセットアップ
注:機器の初期設定は、使用するポンプシステム、顕微鏡、カメラ、イメージングソフトウェアによって異なるため、ここでは取り扱いません。設定手順については、機器ベンダーから提供される説明資?...

<ol>
	<li>Krimm, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+regulate+embryonic+gustatory+development.">Factors that regulate embryonic gustatory development.</a> BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).</li><li>Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+taste+cells+lacking+synapses+mediate+neurotransmission?+CALHM1,+a+voltage-gated+ATP+channel.">How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel.</a> Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).</li><li>Taruno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+transduction+and+channel+synapses+in+taste+buds.">Taste transduction and channel synapses in taste buds.</a> Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).</li><li>Kinnamon, S. C., Finger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taste+for+ATP:+neurotransmission+in+taste+buds.">A taste for ATP: neurotransmission in taste buds.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste.">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li><li>Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+sense+about+taste:+from+mammals+to+insects.">Common sense about taste: from mammals to insects.</a> Cell. 139 (2), 234-244 (2009).</li><li>Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+neural+response+in+the+mouse.">Gustatory neural response in the mouse.</a> Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).</li><li>Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opponent+effects+of+quinine+and+sucrose+on+single+fiber+taste+responses+of+the+chorda+tympani+nerve.">Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve.</a> Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).</li><li>Frank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+classification+of+mammalian+afferent+taste+nerve+fibers.">The classification of mammalian afferent taste nerve fibers.</a> Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).</li><li>Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+gustatory+nerve+fiber+discharge+pattern+with+change+in+stimulus+concentration+and+quality.">Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality.</a> Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).</li><li>Sollars, S. I., Hill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recordings+from+rat+geniculate+ganglia:+taste+response+properties+of+individual+greater+superficial+petrosal+and+chorda+tympani+neurones.">In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones.</a> Journal of Physiology. 564, 877-893 (2005).</li><li>Yokota, Y., Bradley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geniculate+ganglion+neurons+are+multimodal+and+variable+in+receptive+field+characteristics.">Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics.</a> Neuroscience. 367, 147-158 (2017).</li><li>Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+modulates+taste+responsiveness+and+stimulates+gustatory+neurons+in+the+rat+geniculate+ganglion.">Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion.</a> Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits:+A+decade+of+progress.">Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress.</a> Neuron. 98 (4), 865 (2018).</li><li>Barreto, R. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517, 373-376 (2015).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+animal+calcium+imaging+of+the+geniculate+ganglion.">Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion.</a> Protocol Exchange. , 106 (2015).</li><li>Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rewiring+the+taste+system.">Rewiring the taste system.</a> Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>. dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/5817461">https://gist.github.com/ackman678/5817461</a> (2014)</li><li>Cantu, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZcalcium:+Open-source+toolbox+for+analysis+of+calcium+imaging+data.">EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data.</a> Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sour+sensing+from+the+tongue+to+the+brain.">Sour sensing from the tongue to the brain.</a> Cell. 179 (2), 392-402 (2019).</li><li>Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+logic+of+sensory+coding+revealed+by+optical+tagging+of+physiologically-defined+neuronal+types.">A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types.</a> bioRxiv. , 692079 (2019).</li><li>Moeyaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+marking+active+neuron+populations.">Improved methods for marking active neuron populations.</a> Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).</li></ol>

この研究は、ジェニュー酸神経節を外科的に暴露し、GCaMP6sでそのニューロンの活動を視覚的に記録するためのステップバイステッププロトコルを記述する。この手順は、前述の17と非常によく似ていますが、いくつかの顕著な例外があります。まず、ヘッドポストを使用することで、手術中の頭部の位置調整が容易になります。第二に、刺激送達に関して、呉とドボヤンチ?...

哺乳類末梢味システムの重要な成分は、神経節の起源である。耳のピンナを内在させるいくつかの体性感覚ニューロンに加えて、原発は前舌と口蓋を内在させる味覚ニューロンの細胞体で構成される。他の末梢感覚ニューロンと同様に、原発性神経節ニューロンは、長い軸索が味覚芽に末梢に突き出て、そして一元的に孤独な管1の脳幹核に対して擬似ユニポーラである。これらのニューロンは主に口腔内の味覚刺激に反応する味覚受容体細胞によるATPの放出によって活性化される2、3。ATPは、味覚シグナル伝達に不可欠な神経伝達物質であり、そして、その活性化のために、味覚神経節ニューロンによって発現されるP2rx受容体が必要である。味覚受容体細胞が特定の味覚モダリティ(甘味、苦味、塩味、うま味、または酸っぱい)に対する特定の味覚受容体を発現することを考えると、味覚刺激に対する味覚神経節ニューロン応答も狭く調整されるであろうと仮定されている5。
全体の神経録音は、コルダ・タンパニと優れたペトロサル神経の両方が、5つの味覚モダリティすべてを表す射薬信号を、起源の神経節6,7に伝導することを示している。しかし、これはまだ与えられたタスタントに対する神経応答の特異性に関する疑問を残した:味モダリティ特異的ニューロン、ポリモーダルニューロン、またはその両方の混合物がある場合。単繊維の記録は、個々の繊維の活性に関するより多くの情報を与え、その化学的感受性8、9、10を与えるが、この方法論は、少数の繊維からのデータ収集に限定される。同様に、個々のラットの神経節ニューロンのインビボ電気生理学的記録は、個々のニューロン11、12、13の応答に関する情報を与えるが、それでも集団の活性を失い、動物1人あたりのニューロン記録が比較的少ない。個々のニューロンの活動を見失うことなく、ニューロンアンサンブルの応答パターンを分析するためには、新しい技術を採用する必要がありました。
カルシウムイメージングは、特にGCaMPのような遺伝的にコード化されたカルシウム指標を使用して、この技術的なブレークスルー14、15、16、17、18を提供してきました。GCaMPは、神経活動の代理としてカルシウムを使用し、細胞内のカルシウムレベルが上昇するにつれて緑色蛍光を増加させる。GCaMPの新しい形態は、信号対雑音比を改善し、結合性運動を調整し、特殊実験19に適応するために開発され続けている。GCaMPは、神経全体の記録とは異なり、単一のニューロンの解像度を提供し、同時に単一の繊維または単一細胞の記録とは異なり、ニューロンのアンサンブルの応答を測定することができます。原発性神経節のカルシウムイメージングは、野生型マウス16,20におけるこれらのニューロンのチューニングプロファイルに関する重要な情報を既に提供しており、遺伝的に操作されたマウス18における末梢の味の誤配線表現型を同定している。
インビボカルシウムイメージング技術を原発性神経節に適用する際の大きな難点の1つは、骨の鼓膜発作の中にカプセル化されるということです。ジェクレートへの光学的アクセスを得るためには、ガングリオンをそのまま維持しながら、骨の層を除去するために繊細な手術が必要です。そのために、他の研究者が原発性神経節にアクセスし、GCaMPがこれらのニューロンの蛍光応答を媒介して生体内で刺激を味わう画像を画像化するのを助けるために、このガイドを作成しました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 x #5 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NC9792102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe with luer lock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x #3 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>M3S 11200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge Blunt Dispensing Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1372532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0398332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Machine Screw Hex Nuts</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SNMS004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Socket Head Cap Screw</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SSCS04C004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Points</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-930-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acesulfame K</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A149025G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>59399-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>18200-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>MB8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A95-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Liquid</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Powder</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-062-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Head Post Holder</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202410.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Metal Head Post</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202406.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disection Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Clippers</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL7300-Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6195906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Ketaved</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cold Light Source</td>
			<td>Leica Mcrosystems</td>
			<td>KL300LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 1/16&#34; Tubing Adapters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-000-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series Optical Posts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1723230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXC-2.5 Rotatable probe Clamp</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>14030000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-947-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressurized air</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI Z300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC163720050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self Sticking Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>159015R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Pinch Valve Tubing 1/32&#34; x 1/16&#34; o.d. (per foot)</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sola SM Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap25-2A-GCaMP6s-D</td>
			<td>JAX</td>
			<td>025111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe Holder</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thread</td>
			<td>G&#252;termann</td>
			<td>02776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-046941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two Stage Gas Regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12FM244B580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon vinyl tubing - 1/16&#34;</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 digital/manual controller</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>17-pp-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Anased</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli

過去10年以内に、遺伝子組み換えカルシウム指標(GEC)の進歩は、生体内機能イメージングにおける革命を促進しました。これらの技術は、神経活動の代理としてカルシウムを使用して、大規模なニューロンアンサンブル内の個々の細胞の反応をリアルタイムで様々な刺激に対して監視する方法を提供する。我々や他の人々は、これらの技術を適用して、個々の原発性神経節ニューロンの応答を画像化し、生きた麻酔マウスの舌に加わる刺激を味わってきた。原発性神経節は、舌前舌と口蓋を内在させる気味ニューロンの細胞体と、耳のピナを内在させる体性感覚ニューロンで構成される。GCaMPを用いた個々の原発性神経節ニューロンの味覚誘発応答をイメージングすることは、野生型マウスにおけるこれらのニューロンの調整プロファイルに関する重要な情報と、遺伝的に操作されたマウスにおける末梢の味の誤配線表現型を検出する方法を提供した。ここでは、原発性神経節、GCaMP蛍光画像取得、データ分析の初期ステップ、およびトラブルシューティングを行うための外科的手順を示す。この技術は、トランスジェニックにコード化されたGCaMP、またはAAV媒介GCaMP発現で使用することができ、また、対象となる特定の遺伝的サブセット(すなわち、クレ媒介GCaMP発現)を画像に変更することができる。全体的に、神経節ニューロンのインビボカルシウムイメージングは、末梢の気味ニューロンの活性を監視するための強力な技術であり、より伝統的な全神経脊索のティンパニの記録または味覚行動アッセイに補完的な情報を提供する。

プロトコルに従って、トランスジェニックSnap25-GCaMP6s動物が鎮静され、ジェニューレ酸神経節が暴露され、ビデオが記録されている間に舌にタスタントが適用された。実験の目的は、各細胞から応答を引き出すタスタントを定義することであった。乳化剤(30mM AceK、5 mMキニーネ、60mM NaCl、50mM IMP+1mM MPG、50mMクエン酸)18 をDI水中に溶解し、13sのDI水で分離した2sの舌に塗布した。...

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In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

ここでは、生きた麻酔薬用マウスのジェニュー酸神経節を暴露する方法と、カルシウムイメージングを使用してこれらのニューロンのアンサンブルの応答を測定して刺激を味わう方法を紹介し、異なる覚醒剤を用いた複数の試験を可能にする。これにより、どのニューロンがどのタスタントに反応するかを深く比較することができます。

マウスの神経節神経節ニューロン反応のインビボカルシウムイメージングが味覚刺激に反応する

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

この技術は、内なる脊髄のチンパニ味経路の重要な部分である、神経細胞性神経節の味に対する神経細胞応答に関する重要な機能的質問に答えることができる。この技術は、動物ごとに記録された細胞が電気生理学的方法を介して典型的に観察されるよりも有意に高いように、単一の実験試験で複数の個々のニューロンのリアルタイム反応を監視するために使用することができる。ヘッドポストに取り付けられたマウスを加熱パッドの上の位置に置いて、胸骨から顎まで、喉の上の皮膚に2センチメートルの正中線切開を行います。そして、皮膚と上顎下腺を引き込んで、筋の筋肉を完全に露出させます。パラトラチャー筋肉の縫い目を見つけ、鈍い解剖で縫い目を分離し、それを開くために組織を引き込みます。気管の直径の半分以上を切断することなく、ポリエチレンチューブの一部に収まるほどの大きさの気管の上部の開口部を慎重に切断し、チューブを肺に向かって気管に挿入します。再配置するリアトラクター筋肉を解放し、下顎腺を引っ込める.次に、少量の動物用接着剤を使用して、チューブの上にパラトラクヒールの筋肉を密封します。鼓膜ブラを開くには、望ましい筋を優しく上向きにいじめ、結合組織を引き離します。血管を避け、筋肉の前端で切開を行います。そして、鼓膜のブラをクリアするまで後に引き戻します。頭を少し後ろに傾けて鼓膜ブラを持ち上げ、頸動脈前部の枝をジガストマッスルの後部挿入点に向けます。鼓膜ブラの凸構造のためにこの血管の後部にパルパテと筋肉の縫い目を見つける.2組の細かい鉗子を使用して、鼓膜発作の骨が目に見えるまで縫い目で鈍い解剖をし、骨の明確なビューを保つためにリトラクターを使用する。ブラの後部に前部を走る縫い目を見つけ、外科プローブを使用して縫い目の中心の骨に穴を開け、次に、細かい端のはさみのセットを使用して骨の円形領域を切断し、血管の前部および後部をブラの下に切り取らない注意を払う。原発性を露出させるために、内痛を見つける。内痛の前にテンソルのリンパ筋です。この筋肉を切断し、除去するために春のはさみを使用してください。外科用プローブを使用して人工内科に穴を開け、すぐに吸引を使用して穴から流れ出る液体を吸引します。内の穴を拡大し、内膜を囲む血管を損傷しないように注意し、後部および横端に。そして、マウスの頭を前方に傾けて、以前の人工内骨構造の下の側頭骨に穴を見つけます。7番目の神経の上に直接座っている穴に尾根の前部に注意してください。そして、第7の神経を露出させるために側頭骨を慎重に持ち上げることを可能にするために、穴に外科用プローブを挿入します。原発が完全に見えない場合は、動物の頭を緩やかに後ろに傾け、骨の前を神経に引き上げようとします。神経節がまだ隠されている場合は、より多くの骨を下から引き上げ、骨の下にプローブを深く置かないように注意してください。タスタンパネルを動かすために、吸引して、液をジェラクレート上から取り除き、マウスを解剖顕微鏡の下の吸収パッドの上に置きます。ブラに残された穴、側頭骨の穴、7番目の神経を使用して、神経節の元素を見つけます。また、蛍光スコープ上のFITCGFPフィルタを使用して、神経節ニューロンを発現する個々のGCaMPを確認します。1つのタスタンラインの分配針を動物の口の中にしっかりと入れ、口の下にペトリ皿を置いて液体を捕まえます。ビデオ録画の開始を、tastant プレゼンテーションの開始と同期し、ライブフィードでの応答、ドリフト、および記録中の浸透を見ます。もし浸透が起こったら、原発の視野が明確になるまで液体を吸引し、タスタントを再送する。ドリフトが発生した場合は、ヘッドポストのすべての部分がしっかりと締め付けされていることを確認します。応答が発生しない場合は、液体が流れているか、顕微鏡とカメラが視野を隠すことなく適切な位置に焦点を当てているかを確認してください。すべての所望の実験が完了したら、リトラクタを穏やかに緩和し、動物の反対側の露出とタスタント分析を繰り返します。観察されたように、舌に加えられる味覚刺激は、GCaMP蛍光の急速な一過性増加をもたらし、応答ニューロン間の明るさの顕著な変化を引き起こす。蛍光ビデオ映像の分析は、時間の経過に伴う個々の関心領域内のベースライン応答に対する蛍光の変化に対応する痕跡の生成を可能にする。閾値レベルを超える蛍光強度の変化は、陽性反応と考えられる。神経節を傷つけることに加えて、出血を避けることが重要です。出血が起こった場合は、生理学と吸引を適用する前に血液が凝固するのを待って、視野から血液を取り除きます。ジェキラゲンリアの視覚化により、研究者はニューロンの反応を味覚のような刺激に直接測定し、Cre依存性GCaMPなどのツールでこれらのニューロンを同定することができました。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

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によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

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の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

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Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;光刺激に感光体と介在ニューロン<em&gt;インビボ</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

光干渉断層計: マウス網膜神経節細胞In Vivoイメージング

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウム イメージング

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

ニューロンスパイク活性を利用して神経生理学実験における閉ループ刺激を引き起こす

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

行動と刺激反応の間に全脳イメージングのための成人ショ ウジョウバエメラノガスター を準備する

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...