Name: in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli
Uploaded: 2021-02-11T15:00:00
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저자는 마우스 축산에 대한 S. 후마윤에게 감사드립니다. 이 작업에 대한 자금은 UTSA의 뇌 건강 컨소시엄 대학원 및 박사 후 종자 보조금 (B.E.F.) 및 NIH-SC2-GM130411에서 L.J.M부분적으로 제공되었습니다.

동물 프로토콜은 텍사스 샌 안토니오 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토및 승인되었습니다.
1. 수술 전 설정
참고: 장비의 초기 설정은 펌프 시스템, 현미경, 카메라 및 사용되는 이미징 소프트웨어에 따라 다르므로 여기에서 다루지 않습니다. 설치 지침은 장비 공급업체에서 제공하는 교육 자료를 참조하십시오. 저자가 사용하는 장비의 경...

<ol>
	<li>Krimm, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+regulate+embryonic+gustatory+development.">Factors that regulate embryonic gustatory development.</a> BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).</li><li>Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+taste+cells+lacking+synapses+mediate+neurotransmission?+CALHM1,+a+voltage-gated+ATP+channel.">How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel.</a> Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).</li><li>Taruno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+transduction+and+channel+synapses+in+taste+buds.">Taste transduction and channel synapses in taste buds.</a> Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).</li><li>Kinnamon, S. C., Finger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taste+for+ATP:+neurotransmission+in+taste+buds.">A taste for ATP: neurotransmission in taste buds.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+modulates+taste+responsiveness+and+stimulates+gustatory+neurons+in+the+rat+geniculate+ganglion.">Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion.</a> Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits:+A+decade+of+progress.">Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress.</a> Neuron. 98 (4), 865 (2018).</li><li>Barreto, R. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517, 373-376 (2015).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+animal+calcium+imaging+of+the+geniculate+ganglion.">Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion.</a> Protocol Exchange. , 106 (2015).</li><li>Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rewiring+the+taste+system.">Rewiring the taste system.</a> Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>. dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/5817461">https://gist.github.com/ackman678/5817461</a> (2014)</li><li>Cantu, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZcalcium:+Open-source+toolbox+for+analysis+of+calcium+imaging+data.">EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data.</a> Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sour+sensing+from+the+tongue+to+the+brain.">Sour sensing from the tongue to the brain.</a> Cell. 179 (2), 392-402 (2019).</li><li>Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+logic+of+sensory+coding+revealed+by+optical+tagging+of+physiologically-defined+neuronal+types.">A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types.</a> bioRxiv. , 692079 (2019).</li><li>Moeyaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+marking+active+neuron+populations.">Improved methods for marking active neuron populations.</a> Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).</li></ol>

이 작품은 조폐성 신경절을 외과적으로 노출하고 GCaMP6s로 뉴런의 활동을 시각적으로 기록하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 몇 가지 주목할 만한 예외를 제외하고 이전에 설명된17과매우 유사합니다. 첫째, 헤드 포스트를 사용하면 수술 중 헤드 포지셔닝을 쉽게 조정할 수 있습니다. 둘째, 자극 전달에 관해서는, 우와 드보리안치코프의 접근법은 식도?...

포유류 말초 맛 시스템의 핵심 성분은 조질성 신경절입니다. 귀의 정점을 내면으로 만드는 일부 소마토 감각 뉴런 외에도, 조닐은 전방 혀와 입맛을 내면에 가두는 구형 뉴런의 세포 체로 구성됩니다. 다른 말초 감각 뉴런과 유사하게, 조폐성 신경절 뉴런은 미각에 말초로 투사되는 긴 축삭을 가진 의사 단극성이며, 고독한1의뇌줄기 핵에 중앙으로 투사된다. 이러한 뉴런은 주로 구강2,3에서맛 자극에 반응하는 맛 수용체 세포에 의해 ATP의 방출에 의해 활성화된다. ATP는 맛 신호에 필수적인 신경 전달 물질이며, 구술 신경절 뉴런에 의해 발현된P2rx 수용체는 활성화4에 필요하다. 맛 수용체 세포가 특정 맛 양식 (달콤한, 쓴 맛, 짠, 감칠맛 또는 신맛)에 대한 특정 맛 수용체를 표현하는 것을 감안할 때, 맛 자극에 대한 구술 신경절 뉴런 반응도 좁게 조정 될 것이라고 가설되었습니다5.
전체 신경 기록은 코다 티파니와 더 큰 우수한 석유 신경이 조랑말 신경절6,7에모든 다섯 맛 양식체를 나타내는 돌풍 신호를 실시 모두 보여 주었다. 그러나, 이것은 여전히 주어진 술에 신경 응답의 특이성에 대 한 질문을 왼쪽: 맛 양식 특정 뉴런이 있는 경우, polymodal 뉴런, 또는 둘 다의 혼합물. 단일 섬유 레코딩은 개별 섬유의 활성과 화학적 민감도8,9,10에대한 자세한 정보를 제공하지만, 이 방법론은 소수의 섬유로부터 데이터를 수집하는 것으로 제한됩니다. 유사하게, 개별 쥐 의 생체 내 전기생리학적 기록에서 신경절 뉴런은 개별 뉴런11,12,13의반응에 대한 정보를 제공하지만, 여전히 인구의 활성을 잃고 동물당 상대적으로 적은 뉴런 기록을 산출한다. 개별 뉴런의 활성의 시력을 잃지 않고 신경 앙상블의 반응 패턴을 분석하기 위해 새로운 기술을 사용할 필요가 있습니다.
칼슘 이미징, 특히 GCaMP와 같은 유전자 로 인코딩 된 칼슘 지표를 사용하여이 기술적 돌파구를 제공했습니다14,15,16,17,18. GCaMP는 칼슘을 신경 활동의 대리자로 사용하여 세포 내의 칼슘 수준으로 녹색 형광을 증가시킵니다. 새로운 형태의 GCaMP는 신호 대 노이즈 비율을 개선하고, 결합 운동학을 조정하며, 특수실험(19)에적응하기 위해 지속적으로 개발되고 있다. GCaMP는 전체 신경 기록과 달리 단일 신경 해상도를 제공하며 단일 섬유 또는 단일 세포 기록과 달리 뉴런 앙상블의 반응을 동시에 측정할 수 있습니다. 조닐칼갱리아의 칼슘 이미징은 이미 야생형 마우스16,20에서이들 뉴런의 튜닝 프로파일에 대한 중요한 정보를 제공하고 있으며, 유전자 조작마우스(18)에서표현형을 잘못 배선하는 말초 맛을 확인하였다.
비보 칼슘 이미징 기술을 조닐레이트 신경절에 적용하는 한 가지 주요 어려움은 뼈 성 막판 불라 내에 캡슐화된다는 것입니다. 조폐제에 대한 광학 적 접근을 얻으려면 신경절을 그대로 유지하면서 뼈층을 제거하기 위해 섬세한 수술이 필요합니다. 그 목적을 위해, 우리는 그밖 연구원이 조닐레이트 신경절에 접근하고 생체 내 자극을 맛하기 위하여 이 뉴런의 GCaMP 중재형 반응을 심상에 접근하는 것을 돕기 위하여 이 가이드를 만들었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 x #5 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NC9792102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe with luer lock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x #3 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>M3S 11200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge Blunt Dispensing Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1372532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0398332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Machine Screw Hex Nuts</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SNMS004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Socket Head Cap Screw</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SSCS04C004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Points</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-930-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acesulfame K</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A149025G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>59399-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>18200-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>MB8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A95-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Liquid</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Powder</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-062-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Head Post Holder</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202410.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Metal Head Post</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202406.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disection Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Clippers</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL7300-Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6195906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Ketaved</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cold Light Source</td>
			<td>Leica Mcrosystems</td>
			<td>KL300LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 1/16&#34; Tubing Adapters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-000-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series Optical Posts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1723230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXC-2.5 Rotatable probe Clamp</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>14030000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-947-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressurized air</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI Z300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC163720050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self Sticking Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>159015R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Pinch Valve Tubing 1/32&#34; x 1/16&#34; o.d. (per foot)</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sola SM Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap25-2A-GCaMP6s-D</td>
			<td>JAX</td>
			<td>025111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe Holder</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thread</td>
			<td>G&#252;termann</td>
			<td>02776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-046941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two Stage Gas Regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12FM244B580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon vinyl tubing - 1/16&#34;</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 digital/manual controller</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>17-pp-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Anased</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli

지난 10 년 이내에, 유전자 로 코딩 된 칼슘 지표 (GECIs)의 발전은 생체 기능 적 이미징의 혁명을 촉진했습니다. 신경 활동에 대 한 프록시로 칼슘을 사용 하 여, 이러한 기술은 실시간으로 자극의 다양 한 큰 신경 앙상블 내에서 개별 세포의 응답을 모니터링 하는 방법을 제공. 우리 등은 이러한 기술을 적용하여 개별 조니컬트 신경절 뉴런의 반응을 이미지화하여 살아있는 마취 마우스의 혀에 적용되는 자극을 맛볼 수 있습니다. 조닐레이트 신경절은 전방 혀와 입맛을 내면에 가두는 구형 뉴런의 세포 체와 귀의 정강을 가두는 일부 세포 감각 뉴런으로 구성됩니다. GCaMP를 사용하여 개별 조개 신경절 신경전 뉴런의 맛에 자극된 반응을 이미징하는 것은 야생 형 마우스에서 이러한 뉴런의 튜닝 프로파일뿐만 아니라 유전적으로 조작 된 마우스의 표현형을 잘못 배선하는 말초 맛을 감지하는 방법에 대한 중요한 정보를 제공했습니다. 여기서 는 조폐성 신경절, GCaMP 형광 이미지 수집, 데이터 분석을 위한 초기 단계 및 문제 해결을 노출시키는 외과 적 절차를 시연합니다. 이 기술은 형질적으로 인코딩된 GCaMP 또는 AAV 매개 GCaMP 발현과 함께 사용될 수 있으며, 특정 유전 적 관심 하위 집합(즉, Cre-mediated GCaMP 발현)을 이미지하도록 수정할 수 있다. 전반적으로, 조폐성 신경절 신경의 생체 내 칼슘 이미징은 말초 구형 뉴런의 활동을 모니터링하기위한 강력한 기술이며 전통적인 전신경 코르다 tympani 녹음 또는 맛 행동 분석에 보완 적인 정보를 제공합니다.

프로토콜에 따라, 형질전환 Snap25-GCaMP6s 동물은 진정되고, 조네이큐레이트 간리아가 노출되고, 비디오가 녹화되는 동안 태액을 혀에 적용했다. 실험의 목적은 각 세포에서 어떤 술관이 반응을 유도하는지 정의하는 것이었습니다. 태스트(30mM AceK, 5m키닌, 60mM NaCl, 50mM IMP + 1mM MPG, 50mM 양연산)18은 DI 수에 용해되어 DI 수의 13s로 분리된 2s에 혀에 적용되었다.
<p class="jove_content" fo:keep-t...

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In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

여기에서 우리는 살아있는, 마취 실험실 마우스의 조야성 신경절 신경절을 드러내는 방법과 각성제를 맛보기 위하여 이 뉴런의 앙상블의 반응을 측정하기 위하여 칼슘 화상 진찰을 사용하는 방법을 제시합니다, 다른 각성제를 가진 다중 예심을 허용하. 이것은 어떤 신경 세포가 어떤 tastants에 반응하는지의 깊이 비교를 허용합니다.

마우스 의 생체 칼슘 이미징에서 맛 자극에 신경절 신경 반응

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

이 기술은 내부 chorda tympani 맛 경로의 중요한 부분인 조닐컬트 신경리아의 맛에 대한 신경 반응에 대한 중요한 기능적 질문에 대답할 수 있습니다. 이 기술은 동물당 기록된 세포가 전형적으로 전기생리학적 방법을 통해 관찰되는 것보다 훨씬 높기 때문에 단일 실험 시험에서 다중 개별 뉴런의 실시간 반응을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 가열 패드의 척추 위치에 헤드 포스트 장착 마우스를 사용하면 흉골에서 턱까지 목 구멍 위에 피부에 2 센티미터 중간 개목을 만듭니다.그리고 피부와 상악샘을 완전히 노출시키기 위해 피부와 상악샘을 철회합니다. 파라트라세이머 의 솔기를 분리한 후, 솔기를 무딘 해부로 분리하고 조직을 철회하여 열게 한다. 기관지의 직경을 반이상 절단하지 않고 폴리에틸렌 튜브의 조각을 맞출 수있을만큼 큰 기관의 상단에 구멍을 신중하게 잘라 폐를 향해 기관체에 튜브를 삽입합니다.리트랙터를 재배치하여 분리된 근육을 방출하고 상악선 이하의 땀샘을 후퇴시킵니다. 그런 다음 소량의 수의 접착제를 사용하여 튜브 위에 함께 paratracheal 근육을 밀봉하십시오. 고리패닉 불라를 열어 놓기 위해 원하는 디거스트릭 근육을 부드럽게 애타게 하고 결합 조직을 분리합니다.혈관을 피하고 근육의 앞쪽 끝에서 절개를하십시오. 그리고 정폭 황소가 지울 때까지 뒤로 당깁니다. 머리를 약간 뒤로 기울여 고리관절을 들어 올리고 경동맥 전방의 가지를 디거스근육의 후방 삽입 지점으로 찾습니다.팔파테는 정사각형 황소의 볼록한 구조를 위해 이 혈관을 후방으로 만들고 근육에 솔기를 찾습니다. 두 세트의 미세 한 집게를 사용하여, 타일라패닉 불라의 뼈가 보일 때까지 솔기에서 무딘 해부하고 골격의 명확한 보기를 유지하기 위해 방망기를 사용합니다. 황소의 후방에 전방을 달리는 솔기를 찾아 외과 프로브를 사용하여 솔기의 중앙에 뼈에 구멍을 찌른 다음 미세 한 끝 가위를 사용하여 뼈의 원형 영역을 잘라내고 혈관을 앞쪽과 후방을 황소 또는 아래에 자르지 않도록주의하십시오.천재를 노출하려면 달팽이관을 찾습니다. 달팽이관에 전방은 텐서 티파니 근육입니다. 스프링 가위를 사용하여 이 근육을 자르고 제거하십시오.외과 프로브를 사용하여 달팽이관 포동에 구멍을 뚫고 즉시 흡입을 사용하여 구멍에서 흐르는 액체를 흡입하십시오. 달팽이관의 구멍을 확대하여 달팽이관에 둘러싸인 혈관을 손상시키지 않도록 주의하여 후방 및 측면 가장자리로 확대합니다. 그리고 마우스의 머리를 앞으로 기울여 이전 달팽이관 구조 아래에 측두골의 구멍을 찾습니다.일곱 번째 신경 위에 직접 앉아 구멍에 능선 전방의 주의하십시오. 그리고 일곱 번째 신경을 노출하기 위해 현세골이 조심스럽게 들어 올릴 수 있도록 구멍에 수술 프로브를 삽입합니다. 조료가 완전히 보이지 않으면 동물의 머리를 부드럽게 뒤로 기울여 뼈 앞쪽을 신경에 끌어 올리십시오.신경리아가 여전히 가려지면, 뼈 아래에 프로브를 배치하지 않도록주의, 아래에서 더 많은 뼈를 당겨, 이 geniculate을 손상 시킬 수 있습니다. 술판을 실행하려면 흡입을 사용하여 조폐물 위로 액체를 제거하고 해부 현미경 아래에 흡수 패드에 마우스를 놓습니다. 황소에 남아있는 구멍, 측두골뼈의 구멍, 일곱 번째 신경을 사용하여 조랑말 신경절을 찾습니다.그리고 피광성 범위에 FITCGFP 필터를 사용하여 조닐레이트 신경절 뉴런을 발현하는 개별 GCaMP를 확인한다. 디스펜싱 바늘을 한 번의 타질 라인에 단단히 놓고 페트리 접시를 입 아래에 놓고 액체를 잡습니다. 녹화 시 응답, 드리프트 및 seepage에 대한 실시간 피드를 보고, 녹화 시작과 함께 비디오 녹화의 시작을 동기화합니다.시페이지가 발생하면, 조니큐레이트의 시야가 명확해질 때까지 액체를 흡입하고 술물을 다시 전달한다. 드리프트가 발생하면 헤드포스트의 모든 부분이 단단히 조여있는지 확인합니다. 응답이 발생하지 않으면 액체가 흐르고 현미경과 카메라가 시야를 가리는 것이 없는 적절한 위치에 초점을 맞추고 있는지 확인하십시오.원하는 모든 실험이 완료되면, 부드럽게 re트랙터를 완화하고 동물의 반대편에 노출 및 맛 분석을 반복합니다. 관찰된 바와 같이, 혀에 적용된 맛 자극은 GCaMP 형광의 급격한 일시적인 증가를 초래하여 반응하는 뉴런 들 사이에서 밝기의 눈에 띄는 변화를 야기해야 합니다. 형광 비디오 푸티지를 분석하면 시간이 지남에 따라 관심 있는 개별 영역 내에서 기준 응답에 대한 형광 변화에 대응하는 추적을 생성할 수 있습니다.임계값 수준 이상의 형광 강도의 변화는 긍정적인 반응으로 간주됩니다. 간경을 손상시키는 것 외에도 출혈을 피하는 것이 중요합니다. 출혈이 발생하면, 혈액이 혈전을 기다렸다가 식염수와 흡입을 적용하여 시야에서 혈액을 제거하십시오.조니쿨레이트 신경리아의 시각화는 연구원이 직접 맛과 같은 자극에 뉴런의 반응을 측정하고 Cre-의존하는 GCaMP와 같은 도구로 이러한 뉴런을 식별 할 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

연구

신경과학

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

광학 일관성 단층 촬영: 마우스 망막 신경 절 세포에서 Vivo에서 화상 진 찰

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

신경 생리학적 실험에서 신경 스파이크 활동을 사용하여 폐쇄 루프 자극을 트리거합니다.

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

행동과 자극 반응 도중 전체 두뇌 화상 진찰을 위한 성인 Drosophila melanogaster를 준비합니다

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...