Name: in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli
Uploaded: 2021-02-11T15:00:00
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Os autores agradecem a S. Humayun pela criação de ratos. O financiamento para este trabalho foi fornecido em parte pelo Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) e nih-SC2-GM130411 para L.J.M.

Os protocolos animais foram revisados e aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas San Antonio.
1. Configuração pré-operatória
NOTA: Observe que a configuração inicial do equipamento não é tratada aqui, pois ela irá variar de acordo com o sistema de bomba, microscópio, câmera e software de imagem usados. Para obter instruções de configuração, consulte os materiais instrucionais fornecidos pelo fornecedo...

<ol>
	<li>Krimm, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+regulate+embryonic+gustatory+development.">Factors that regulate embryonic gustatory development.</a> BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).</li><li>Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+taste+cells+lacking+synapses+mediate+neurotransmission?+CALHM1,+a+voltage-gated+ATP+channel.">How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel.</a> Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).</li><li>Taruno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+transduction+and+channel+synapses+in+taste+buds.">Taste transduction and channel synapses in taste buds.</a> Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).</li><li>Kinnamon, S. C., Finger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taste+for+ATP:+neurotransmission+in+taste+buds.">A taste for ATP: neurotransmission in taste buds.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste.">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li><li>Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+sense+about+taste:+from+mammals+to+insects.">Common sense about taste: from mammals to insects.</a> Cell. 139 (2), 234-244 (2009).</li><li>Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+neural+response+in+the+mouse.">Gustatory neural response in the mouse.</a> Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).</li><li>Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opponent+effects+of+quinine+and+sucrose+on+single+fiber+taste+responses+of+the+chorda+tympani+nerve.">Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve.</a> Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).</li><li>Frank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+classification+of+mammalian+afferent+taste+nerve+fibers.">The classification of mammalian afferent taste nerve fibers.</a> Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).</li><li>Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+gustatory+nerve+fiber+discharge+pattern+with+change+in+stimulus+concentration+and+quality.">Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality.</a> Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).</li><li>Sollars, S. I., Hill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recordings+from+rat+geniculate+ganglia:+taste+response+properties+of+individual+greater+superficial+petrosal+and+chorda+tympani+neurones.">In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones.</a> Journal of Physiology. 564, 877-893 (2005).</li><li>Yokota, Y., Bradley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geniculate+ganglion+neurons+are+multimodal+and+variable+in+receptive+field+characteristics.">Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics.</a> Neuroscience. 367, 147-158 (2017).</li><li>Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+modulates+taste+responsiveness+and+stimulates+gustatory+neurons+in+the+rat+geniculate+ganglion.">Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion.</a> Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits:+A+decade+of+progress.">Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress.</a> Neuron. 98 (4), 865 (2018).</li><li>Barreto, R. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517, 373-376 (2015).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+animal+calcium+imaging+of+the+geniculate+ganglion.">Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion.</a> Protocol Exchange. , 106 (2015).</li><li>Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rewiring+the+taste+system.">Rewiring the taste system.</a> Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>. dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/5817461">https://gist.github.com/ackman678/5817461</a> (2014)</li><li>Cantu, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZcalcium:+Open-source+toolbox+for+analysis+of+calcium+imaging+data.">EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data.</a> Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sour+sensing+from+the+tongue+to+the+brain.">Sour sensing from the tongue to the brain.</a> Cell. 179 (2), 392-402 (2019).</li><li>Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+logic+of+sensory+coding+revealed+by+optical+tagging+of+physiologically-defined+neuronal+types.">A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types.</a> bioRxiv. , 692079 (2019).</li><li>Moeyaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+marking+active+neuron+populations.">Improved methods for marking active neuron populations.</a> Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).</li></ol>

Este trabalho descreve um protocolo passo-a-passo para expor cirurgicamente o gânglio geniculado e registrar visualmente a atividade de seus neurônios com GCaMP6s. Este procedimento é muito semelhante ao descrito anteriormente17, com algumas exceções notáveis. Primeiro, o uso de um poste na cabeça permite um ajuste fácil do posicionamento da cabeça durante a cirurgia. Em segundo lugar, em relação à entrega de estímulos, a abordagem de Wu e Dvoryanchikov flui estímulos de sabor atrav?...

Um componente-chave do sistema de gosto periférico dos mamíferos é o gânglio geniculado. Além de alguns neurônios somatossensoriais que inervam o pinna do ouvido, o geniculado é composto pelos corpos celulares de neurônios gustativos que inervam a língua anterior e o paladar. Semelhante a outros neurônios sensoriais periféricos, os neurônios de gânglios geniculados são pseudo-unipolares com um longo axônio projetando periféricamente para as papilas gustativas, e centralmente para o núcleo do tronco cerebral do trato solitário1. Esses neurônios são ativados principalmente pela liberação de ATP por células receptoras de paladar que respondem a estímulos de paladar na cavidade oral2,3. ATP é um neurotransmissor essencial para sinalização de paladar, e receptores P2rx expressos pelos neurônios de gânglio gustativo são necessários para sua ativação4. Dado que as células receptoras de sabor expressam receptores de sabor específicos para uma modalidade de sabor particular (doce, amargo, salgado, umami ou azedo), tem sido hipótese que as respostas do neurônio gânglio gustativo a estímulos de sabor também seriam estreitamente ajustadas5.
Gravações nervosas inteiras mostraram que tanto o chorda tympani quanto os nervos petrosais superiores maiores conduzem sinais gustativos representando todas as cinco modalidades de gosto ao gânglio geniculado6,7. No entanto, isso ainda deixou dúvidas sobre a especificidade das respostas neuronais a um determinado tastant: se houver a modalidade de sabor neurônios específicos, neurônios polimodais ou uma mistura de ambos. Registros únicos de fibras dão mais informações sobre a atividade de fibras individuais e suas sensibilidades químicas8,9,10, mas essa metodologia limita-se à coleta de dados de pequenos números de fibras. Da mesma forma, gravações eletrofisiológicas in vivo de neurônios gânglios gênicos individuais de ratos dão informações sobre as respostas dos neurônios individuais11,12,13, mas ainda perdem a atividade da população e produzem relativamente poucos registros de neurônios por animal. Para analisar os padrões de resposta dos conjuntos neuronais sem perder de vista a atividade dos neurônios individuais, novas técnicas precisavam ser empregadas.
A imagem de cálcio, especialmente utilizando indicadores de cálcio geneticamente codificados como o GCaMP, proporcionou esse avanço técnico14,15,16,17,18. GCaMP usa cálcio como proxy para atividade neuronal, aumentando a fluorescência verde à medida que os níveis de cálcio dentro da célula aumentam. Novas formas de GCaMP continuam a ser desenvolvidas para melhorar a relação sinal/ruído, ajustar cinética de ligação e adaptar-se para experimentos especializados19. O GCaMP fornece resolução de neurônios únicos, ao contrário de todo o registro nervoso, e pode medir simultaneamente respostas de conjuntos de neurônios, ao contrário de uma única fibra ou gravação de célula única. A imagem de cálcio do gânglio geniculado já forneceu informações importantes sobre os perfis de ajuste desses neurônios em camundongos do tipo selvagem16,20, e identificou fenótipos de pericular de erro de giro em camundongos geneticamente manipulados18.
Uma grande dificuldade para aplicar técnicas de imagem de cálcio in vivo ao gânglio geniculado é que ele é encapsulado dentro da bula tympanica óssea. Para obter acesso óptico ao geniculado, uma cirurgia delicada é necessária para remover as camadas dos ossos, mantendo o gânglio intacto. Para isso, criamos este guia para ajudar outros pesquisadores a acessar o gânglio geniculado e a imagem que o GCaMP mediava respostas fluorescentes desses neurônios para provar estímulos in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 x #5 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NC9792102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe with luer lock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x #3 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>M3S 11200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge Blunt Dispensing Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1372532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0398332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Machine Screw Hex Nuts</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SNMS004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Socket Head Cap Screw</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SSCS04C004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Points</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-930-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acesulfame K</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A149025G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>59399-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>18200-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>MB8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A95-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Liquid</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Powder</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-062-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Head Post Holder</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202410.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Metal Head Post</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202406.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disection Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Clippers</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL7300-Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6195906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Ketaved</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cold Light Source</td>
			<td>Leica Mcrosystems</td>
			<td>KL300LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 1/16&#34; Tubing Adapters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-000-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series Optical Posts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1723230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXC-2.5 Rotatable probe Clamp</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>14030000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-947-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressurized air</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI Z300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC163720050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self Sticking Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>159015R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Pinch Valve Tubing 1/32&#34; x 1/16&#34; o.d. (per foot)</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sola SM Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap25-2A-GCaMP6s-D</td>
			<td>JAX</td>
			<td>025111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe Holder</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thread</td>
			<td>G&#252;termann</td>
			<td>02776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-046941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two Stage Gas Regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12FM244B580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon vinyl tubing - 1/16&#34;</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 digital/manual controller</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>17-pp-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Anased</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli

Nos últimos dez anos, os avanços nos indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs) promoveram uma revolução na imagem funcional in vivo. Usando o cálcio como proxy para a atividade neuronal, essas técnicas fornecem uma maneira de monitorar as respostas de células individuais dentro de grandes conjuntos neuronais para uma variedade de estímulos em tempo real. Nós, e outros, aplicamos essas técnicas para visualizar as respostas dos neurônios de gânglios gênicos individuais para provar estímulos aplicados às línguas de camundongos anesthetizados vivos. O gânglio geniculado é composto pelos corpos celulares de neurônios gustativos que inervam a língua e o paladar anteriores, bem como alguns neurônios somatosensoriais que inervam o pinna da orelha. A imagem das respostas evocadas pelo sabor de neurônios de gânglios gênicos individuais com GCaMP forneceu informações importantes sobre os perfis de ajuste desses neurônios em camundongos do tipo selvagem, bem como uma maneira de detectar fenótipos de desocupação de gosto periférico em camundongos geneticamente manipulados. Aqui demonstramos o procedimento cirúrgico para expor o gânglio geniculado, aquisição de imagem de fluorescência GCaMP, etapas iniciais para análise de dados e solução de problemas. Esta técnica pode ser usada com GCaMP codificado transgenicamente, ou com expressão GCaMP mediada por AAV, e pode ser modificada para imagem de subconjuntos genéticos particulares de interesse (ou seja, expressão GCaMP mediada por Cre). No geral, a imagem in vivo de cálcio de neurônios de gânglios geniculados é uma técnica poderosa para monitorar a atividade de neurônios gustativos periféricos e fornece informações complementares para gravações mais tradicionais de chorda tympani de nervo inteiro ou ensaios de comportamento de paladar.

Seguindo o protocolo, um animal Snap25-GCaMP6s transgênico foi sedado, gânglios geniculados foram expostos, e tastant foi aplicado na língua enquanto o vídeo era gravado. O objetivo do experimento era definir quais tastantes provocavam respostas de cada célula. Tastants (AceK de 30 mM, 5 mM Quinine, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM Ácido Cítrico)18 foram dissolvidos em água DI e foram aplicados na língua por 2 s separados por 13 s de água DI.
<p class="jove_content" fo:keep-to...

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In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Aqui apresentamos como expor o gânglio geniculado de um rato de laboratório vivo, anestesiado e como usar imagens de cálcio para medir as respostas desses conjuntos desses neurônios a estímulos de sabor, permitindo múltiplos ensaios com diferentes estimulantes. Isso permite comparações profundas das quais os neurônios respondem a quais tastantes.

In vivo Imagem de cálcio do rato Geniculado Gânglio Respostas ao Sabor Estímulo

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

Esta técnica pode responder a importantes perguntas funcionais sobre respostas neuronais ao gosto no gânglio geniculado, uma parte crucial do caminho de gosto de chorda tympani interior. Esta técnica pode ser usada para monitorar as reações em tempo real de múltiplos neurônios individuais em um único ensaio experimental, uma vez que as células registradas por animal são significativamente maiores do que normalmente observadas através do método eletrofisiológico. Com o rato montado no posto principal na posição supina em uma almofada de aquecimento, faça uma incisão de linha média de dois centímetros na pele sobre a garganta, do esterno ao queixo.E retrair a pele e as glândulas sub-maxilais para expor totalmente os músculos digastricos. Depois de localizar a costura na musculatura paratracheal, separe a costura com dissecção sem cortes e retrate o tecido para abri-la. Corte cuidadosamente uma abertura na parte superior da traqueia grande o suficiente para caber um pedaço de tubo de polietileno sem cortar mais da metade do diâmetro da traqueia e inserir a tubulação na traqueia em direção aos pulmões.Reposicione os retratores para liberar a musculatura paratracheal e retrair as glândulas sub-maxilares. Em seguida, use uma pequena quantidade de cola veterinária para selar a musculatura paratracheal junto sobre o tubo. Para quebrar a bíprica timpânica, provoque suavemente o músculo digastric desejado para cima e puxe o tecido conjuntivo.Faça uma incisão na extremidade anterior do músculo, evitando os vasos sanguíneos. E puxe para trás posteriormente até se livrar da bíprica bulla. Incline a cabeça para trás ligeiramente para levantar a bíprica e localizar o ramo da artéria carótida anterior ao ponto de inserção posterior do músculo digastric.Palpate apenas posterior a este vaso sanguíneo para a estrutura convexa da bíptico bíptico e localize uma costura na musculatura. Usando dois conjuntos de fórceps finos, dissecar sem cortes na costura até que o osso da bímpula timpânica seja visível e use retrações para manter uma visão clara do osso. Localize a costura correndo de anterior para posterior na bula e use uma sonda cirúrgica para fazer um orifício no osso no centro da costura, em seguida, use um conjunto de tesouras finas para cortar uma área circular no osso, tomando cuidado para não cortar vasos sanguíneos e posterior para ou abaixo da bula.Para expor o geniculado, localize a cóclea. Anterior à cóclea é o músculo tensor tympani. Use a tesoura de mola para cortar e remover este músculo.Use a sonda cirúrgica para fazer um furo no promontório coclear e use imediatamente a sucção para aspirar qualquer líquido que flua para fora do orifício. Amplie o orifício na cóclea, tomando cuidado para não danificar o vaso sanguíneo que circunda a cóclea, até a borda posterior e lateral. E incline a cabeça do rato para a frente para localizar o buraco no osso temporal sob a antiga estrutura coclear.Tome nota do cume anterior para o buraco que se senta diretamente sobre o sétimo nervo. E insira uma sonda cirúrgica no buraco para permitir que o osso temporal seja cuidadosamente levantado para expor o sétimo nervo. Se o geniculado não estiver totalmente visível, incline suavemente a cabeça do animal para trás e tente puxar o osso anterior para o nervo.Se o gânglio ainda estiver obscurecido, puxe mais osso por baixo, tomando cuidado para não colocar a sonda bem abaixo do osso, pois isso pode danificar o geniculado. Para executar o painel tastant, use suctioned para remover o líquido de sobre o geniculado e coloque o mouse em uma almofada absorvente sob um microscópio dissecando. Use o buraco deixado na bula, o buraco no osso temporal, e o sétimo nervo para localizar o gânglio geniculado.E use o filtro FITCGFP no escopo epifluorescente para verificar se há neurônios glion geniculados individuais. Coloque a agulha de distribuição para uma linha tastante firmemente na boca do animal e coloque uma placa de Petri abaixo da boca para pegar qualquer fluido. Sincronizar o início da gravação de vídeo com o início da apresentação tastant, assistindo a transmissão ao vivo para respostas, deriva e infiltração durante a gravação.Se ocorrer a infiltração, sucção do líquido até que a visão do geniculado esteja clara e redeliver o tastant. Se ocorrer deriva, verifique se todas as partes do poste estão firmemente apertadas. Se não ocorrer resposta, verifique se o líquido está fluindo e se o microscópio e a câmera estão focados no local adequado sem que nada obscurece o campo de visão.Quando todos os experimentos desejados forem concluídos, alivie suavemente os retratores e repita a exposição e a análise tastante no lado oposto do animal. Como observado, os estímulos de paladar aplicados à língua devem resultar em um rápido aumento transitório da fluorescência GCaMP, causando uma mudança notável no brilho entre os neurônios que respondem. A análise das imagens de vídeo de fluorescência permite a geração de traços correspondentes às mudanças na fluorescência sobre a resposta da linha de base dentro de regiões individuais de interesse ao longo do tempo.Alterações na intensidade da fluorescência acima do nível limiar são consideradas uma resposta positiva. Além de danificar os gânglios, é importante evitar sangramentos. Se ocorrer sangramento, espere o sangue coagular antes de aplicar soro fisiológico e sucção para remover o sangue do campo visual.A visualização do gânglio geniculado permitiu aos pesquisadores medir diretamente as respostas dos neurônios a estímulos semelhantes a gosto e identificar esses neurônios com ferramentas como o GCaMP dependente de Cre.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Neurociência

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