Name: in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli
Uploaded: 2021-02-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli at JoVE.com

Yazarlar fare hayvancılığı için S. Humayun'a teşekkür eder. Bu çalışma için finansman kısmen UTSA'nın Beyin Sağlığı Konsorsiyumu Mezunu ve Doktora Sonrası Tohum Hibesi (B.E.F.) ve NIH-SC2-GM130411 tarafından L.J.M.'ye sağlanmıştır.

Hayvan protokolleri Texas San Antonio Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.
1. Ameliyat öncesi kurulum
NOT: Kullanılan pompa sistemi, mikroskop, kamera ve görüntüleme yazılımına göre değişeceğinden, ekipmanın ilk kurulumunun burada ele alınmadığını lütfen unutmayın. Kurulum talimatları için lütfen ekipman satıcısı tarafından sağlanan öğretim materyallerine bakın. Yazarl...

<ol>
	<li>Krimm, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+regulate+embryonic+gustatory+development.">Factors that regulate embryonic gustatory development.</a> BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).</li><li>Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+taste+cells+lacking+synapses+mediate+neurotransmission?+CALHM1,+a+voltage-gated+ATP+channel.">How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel.</a> Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).</li><li>Taruno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+transduction+and+channel+synapses+in+taste+buds.">Taste transduction and channel synapses in taste buds.</a> Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).</li><li>Kinnamon, S. C., Finger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taste+for+ATP:+neurotransmission+in+taste+buds.">A taste for ATP: neurotransmission in taste buds.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste.">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li><li>Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+sense+about+taste:+from+mammals+to+insects.">Common sense about taste: from mammals to insects.</a> Cell. 139 (2), 234-244 (2009).</li><li>Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+neural+response+in+the+mouse.">Gustatory neural response in the mouse.</a> Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).</li><li>Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opponent+effects+of+quinine+and+sucrose+on+single+fiber+taste+responses+of+the+chorda+tympani+nerve.">Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve.</a> Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).</li><li>Frank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+classification+of+mammalian+afferent+taste+nerve+fibers.">The classification of mammalian afferent taste nerve fibers.</a> Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).</li><li>Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+gustatory+nerve+fiber+discharge+pattern+with+change+in+stimulus+concentration+and+quality.">Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality.</a> Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).</li><li>Sollars, S. I., Hill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recordings+from+rat+geniculate+ganglia:+taste+response+properties+of+individual+greater+superficial+petrosal+and+chorda+tympani+neurones.">In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones.</a> Journal of Physiology. 564, 877-893 (2005).</li><li>Yokota, Y., Bradley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geniculate+ganglion+neurons+are+multimodal+and+variable+in+receptive+field+characteristics.">Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics.</a> Neuroscience. 367, 147-158 (2017).</li><li>Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+modulates+taste+responsiveness+and+stimulates+gustatory+neurons+in+the+rat+geniculate+ganglion.">Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion.</a> Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits:+A+decade+of+progress.">Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress.</a> Neuron. 98 (4), 865 (2018).</li><li>Barreto, R. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517, 373-376 (2015).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+animal+calcium+imaging+of+the+geniculate+ganglion.">Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion.</a> Protocol Exchange. , 106 (2015).</li><li>Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rewiring+the+taste+system.">Rewiring the taste system.</a> Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>. dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/5817461">https://gist.github.com/ackman678/5817461</a> (2014)</li><li>Cantu, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZcalcium:+Open-source+toolbox+for+analysis+of+calcium+imaging+data.">EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data.</a> Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sour+sensing+from+the+tongue+to+the+brain.">Sour sensing from the tongue to the brain.</a> Cell. 179 (2), 392-402 (2019).</li><li>Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+logic+of+sensory+coding+revealed+by+optical+tagging+of+physiologically-defined+neuronal+types.">A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types.</a> bioRxiv. , 692079 (2019).</li><li>Moeyaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+marking+active+neuron+populations.">Improved methods for marking active neuron populations.</a> Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).</li></ol>

Bu çalışma, genikül ganglionu cerrahi olarak ortaya çıkarmak ve nöronlarının GCaMP6'larla aktivitesini görsel olarak kaydetmek için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Bu prosedür çok benzer daha önce açıklanan17, birkaç önemli istisna dışında. İlk olarak, bir kafa direğinin kullanılması, ameliyat sırasında kafa konumlandırmasının kolay ayarını sağlar. İkincisi, uyaran teslimatı ile ilgili olarak, Wu ve Dvoryanchikov'un yaklaşımı, yemek borusu tüpü<...

Memeli periferik tat sisteminin önemli bir bileşeni genikül gangliondur. Kulağın pinnasını içselleştiren bazı somatosensör nöronlara ek olarak, genikül ön dili ve damağı içselleştiren gustatory nöronların hücre gövdelerinden oluşur. Diğer periferik duyusal nöronlara benzer şekilde, genikül ganglion nöronları, periferik olarak tat tomurcuklarına ve merkezi olarak yalnız sistemin beyin sapı çekirdeğine uzun bir aksla sözde tek kutupludur1. Bu nöronlar öncelikle atp ağız boşluğunda tat uyaranlarına yanıt veren tat reseptör hücreleri tarafından serbest bırakılması ile aktive edilir2,3. ATP tat sinyali için gerekli bir nörotransmitterdir ve gustatory ganglion nöronları tarafından ifade edilen P2rx reseptörleri aktivasyonları için gereklidir4. Tat reseptör hücrelerinin belirli bir tat modalitesi (tatlı, acı, tuzlu, umami veya ekşi) için belirli tat reseptörlerini ifade ettiği göz önüne alındığında, tadı uyaranlara verilen gustatory ganglion nöron yanıtlarının da dar bir şekilde ayarlandırılacağı hipotez edilmiştir5.
Tüm sinir kayıtları hem chorda tympani hem de daha büyük üstün petrosal sinirlerin genikül ganglion6,7'yebeş tat modalitesini temsil eden gustatory sinyalleri iletdiğini göstermiştir. Bununla birlikte, bu hala belirli bir şok tabancasına nöronal yanıtların özgüllüğü hakkında sorular bıraktı: tat modalitesine özgü nöronlar, polimodal nöronlar veya her ikisinin bir karışımı varsa. Tek lif kayıtları, bireysel liflerin aktivitesi ve kimyasal hassasiyetleri 8,9,10hakkında daha fazla bilgi verir, ancak bu metodoloji az sayıda elyaftan veri toplamakla sınırlıdır. Benzer şekilde, bireysel sıçan genikül ganglion nöronlarının in vivo elektrofizyolojikkayıtları,bireysel nöronların11 , 12,13, yanıtları hakkında bilgi verir, ancak yine de popülasyonun aktivitesini kaybeder ve hayvan başına nispeten az nöron kaydı verir. Nöronal toplulukların yanıt kalıplarını, bireysel nöronların aktivitesini gözden kaçırmadan analiz etmek için yeni tekniklerin çalıştırılması gerekiyordu.
Kalsiyum görüntüleme, özellikle GCaMP gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak, bu teknik atılımı sağlamıştır14,15,16,17,18. GCaMP, kalsiyumu nöronal aktivite için bir proxy olarak kullanır ve hücre içindeki kalsiyum seviyeleri yükseldikçe yeşil floresan artar. Sinyali gürültü oranına iyileştirmek, bağlama kinetiğini ayarlamak ve özel deneyler için uyum sağlamak için yeni GCaMP formları geliştirilmeye devam ediyor19. GCaMP, tüm sinir kaydının aksine tek bir nöron çözünürlüğü sağlar ve aynı anda tek lif veya tek hücre kaydının aksine nöron topluluklarının yanıtlarını ölçebilir. Genikül gangliyonunun kalsiyum görüntülemesi, vahşi tip farelerde bu nöronların ayar profilleri hakkında önemli bilgiler sağlamıştır16,20ve genetik olarak manipüle edilmiş farelerde periferik tat yanlış yönlendiren fenotipler tanımlamıştır18.
Genikül ganglionuna in vivo kalsiyum görüntüleme tekniklerinin uygulanmasının en büyük zorluklarından biri kemikli tympanic bulla içinde kapsüllenmiş olmasıdır. Geniküle optik erişim elde etmek için, ganglionu sağlam tutarken kemik katmanlarını çıkarmak için hassas bir ameliyat gerekir. Bu amaçla, diğer araştırmacıların genikül ganglion'a erişmelerine ve GCaMP'nin bu nöronların uyarıcı in vivo tatmak için floresan yanıtlarına aracılık ettiğini göstermelerine yardımcı olmak için bu kılavuzu oluşturduk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 x #5 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NC9792102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe with luer lock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x #3 Inox Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>M3S 11200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge Blunt Dispensing Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1372532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0398332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Machine Screw Hex Nuts</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SNMS004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 Socket Head Cap Screw</td>
			<td>Fastenere</td>
			<td>3SSCS04C004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Points</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-930-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acesulfame K</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A149025G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>59399-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>18200-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>MB8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A95-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Liquid</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contemporary Ortho-Jet Powder</td>
			<td>Lang</td>
			<td>1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-062-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Head Post Holder</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202410.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Metal Head Post</td>
			<td>eMachineShop</td>
			<td></td>
			<td>See attached file 202406.ems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disection Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Clippers</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL7300-Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6195906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Ketaved</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cold Light Source</td>
			<td>Leica Mcrosystems</td>
			<td>KL300LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 1/16&#34; Tubing Adapters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-000-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series Optical Posts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1723230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXC-2.5 Rotatable probe Clamp</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>14030000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-947-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressurized air</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI Z300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC163720050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self Sticking Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>159015R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Pinch Valve Tubing 1/32&#34; x 1/16&#34; o.d. (per foot)</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sola SM Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap25-2A-GCaMP6s-D</td>
			<td>JAX</td>
			<td>025111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Probe Holder</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thread</td>
			<td>G&#252;termann</td>
			<td>02776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-046941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two Stage Gas Regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12FM244B580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon vinyl tubing - 1/16&#34;</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>05-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 digital/manual controller</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>17-pp-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Anased</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of mouse geniculate ganglion neuron responses to taste stimuli

Son on yıl içinde, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerindeki (GECI'ler) gelişmeler in vivo fonksiyonel görüntülemede bir devrimi teşvik etti. Kalsiyumun nöronal aktivite için bir proxy olarak kullanılması, bu teknikler büyük nöronal topluluklar içindeki bireysel hücrelerin çeşitli uyaranlara yanıtlarını gerçek zamanlı olarak izlemenin bir yolunu sağlar. Biz ve diğerleri, canlı uyuşturulmuş farelerin dillerine uygulanan uyaranları tatmak için bireysel genikül ganglion nöronlarının yanıtlarını görmek için bu teknikleri uyguladık. Genikül ganglion, ön dili ve damağı içselleştiren gustatory nöronların hücre vücutlarının yanı sıra kulağın pinnasını içselleştiren bazı somatosensör nöronlardan oluşur. GCaMP ile bireysel genikül ganglion nöronlarının tat çağrışımlı yanıtlarının görüntülenmesi, bu nöronların vahşi tip farelerdeki ayarlama profilleri hakkında önemli bilgiler ve genetik olarak manipüle edilmiş farelerde periferik tat yanlış dönen fenotipleri tespit etmenin bir yolunu sağlamıştır. Burada genikül ganglionu, GCaMP floresan görüntü alımını, veri analizi için ilk adımları ve sorun gidermeyi ortaya çıkarmak için cerrahi prosedürü gösteriyoruz. Bu teknik transgenik olarak kodlanmış GCaMP veya AAV aracılı GCaMP ifadesi ile kullanılabilir ve belirli genetik ilgi alt kümelerini (örneğin, Cre aracılı GCaMP ifadesi) görüntülenecek şekilde değiştirilebilir. Genel olarak, genikül ganglion nöronlarının in vivo kalsiyum görüntülemesi periferik gustatory nöronların aktivitesini izlemek için güçlü bir tekniktir ve daha geleneksel tam sinir chorda tympani kayıtlarına veya tat davranışı testlerine tamamlayıcı bilgiler sağlar.

Protokolün ardından transgenik bir Snap25-GCaMP6s hayvanı sakinleştirildi, geniculate gangliyon maruz kaldı ve video kaydedilirken dile tastant uygulandı. Deneyin amacı, her hücreden hangi şok tabancalarının yanıtlar ortaya çıkarttığıydı. Tastantlar (30 mM AceK, 5 mM Kinin, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM Sitrik Asit)18 di suda çözünmüş ve dile 13 s DI su ile ayrılmış 2 s için uygulanmıştır.
<img alt...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli at JoVE.com

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Burada canlı, uyuşturuldulu bir laboratuvar faresinin genikül ganglionunun nasıl ortaya çıkarılacağını ve bu nöronların topluluklarının uyaranları tatmak için tepkilerini ölçmek için kalsiyum görüntülemenin nasıl kullanılacağını ve farklı uyarıcılarla birden fazla denemeye izin vermeyi sunuyoruz. Bu, hangi nöronların hangi şok tabancalarına yanıt verdiğine derinlemesine karşılaştırmalar sağlar.

Tadı Uyaranlara Fare Genikül Ganglion Nöron Yanıtlarının In vivo Kalsiyum Görüntülemesi

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

Bu teknik, iç chorda tympani tat yolunun önemli bir parçası olan genikül gangliyonunda tatmak için nöronal yanıtlar hakkında önemli fonksiyonel soruları yanıtlayabilir. Bu teknik, tek bir deneysel denemede birden fazla bireysel nöronun gerçek zamanlı reaksiyonlarını izlemek için kullanılabilir, çünkü hayvan başına kaydedilen hücreler elektrofizyolojik yöntemle tipik olarak gözlenenden önemli ölçüde daha yüksektir. Baş direğine monte edilmiş fare bir ısıtma yastığı üzerinde supine konumundayken, ciltte sternumdan çeneye kadar iki santimetrelik bir orta çizgi kesisi yapın.Digastrik kasları tamamen açığa çıkarmak için deri ve maksiller altı bezleri geri çek. Dikişi paratracheal kas yapısında tespit ettikten sonra, dikişi künt diseksiyonla ayırın ve açmak için dokuyu geri çekin. Trakeanın çapını yarıya kadar kesmeden bir parça polietilen boruya sığacak kadar büyük olan trakeanın üst kısmındaki bir açıklığı dikkatlice kesin ve boruyu akciğerlere doğru trakeaya yerleştirin.Paratrakial kasları serbest bırakmak ve alt maksiller bezleri geri çekmek için retraktörleri yeniden konumlandırın. Daha sonra, paratracheal kasları tüp üzerinde birbirine kapatmak için az miktarda veteriner yapıştırıcısı kullanın. Tympanic bulla'yı kırmak için, istenen digastrik kası yukarı doğru hafifçe kızdırin ve bağ dokusunu ayırın.Kan damarlarından kaçınarak kasın ön ucunda bir kesi yapın. Ve tympanic bulla'dan temizlene kadar arka arkaya çekin. Tympanic bulla'yı kaldırmak ve karotis arter ön kısmının dalını digastrik kasın arka yerleştirme noktasına bulmak için başı hafifçe geriye doğru eğin.Tirpanik bullanın dışbükey yapısı için bu kan damarının sadece arkasını palpate edin ve kas yapısında bir dikiş bulun. İki ince toka seti kullanarak, timpanik bullanın kemiği görünene kadar dikişte künt diseksiyon yapın ve kemiğin net bir görünümünü korumak için retraktörler kullanın. Bulla üzerinde arka tarafta ön tarafta çalışan dikişi bulun ve dikişin ortasındaki kemikte bir delik açmak için cerrahi bir prob kullanın, Ardından, kemikte dairesel bir alanı kesmek için bir dizi ince uç makası kullanın, kan damarları ön ve arkasını bullanın içine veya altına kesmemeye dikkat edin.Genikülleri açığa çıkarmak için kokleayı bulun. Kokleanın ön ucu tensör tympani kasıdır. Bu kası kesmek ve çıkarmak için yay makası kullanın.Koklear promontory'de bir delik açmak için cerrahi probu kullanın ve delikten akan herhangi bir sıvıyı emmek için hemen emme kullanın. Kokleayı çevreleyen kan damarına, arka ve yanal kenara zarar vermemeye dikkat ederek kokleadaki deliği büyütün. Ve farenin başını öne doğru eğerek eski koklear yapının altındaki zamansal kemikteki deliği bulun.Sırt ön kısmının, yedinci sinirin hemen üzerine oturan deliğe dikkat edin. Ve yedinci siniri açığa çıkarmak için zamansal kemiğin dikkatlice kaldırılmasını sağlamak için deliğe cerrahi bir sonda yerleştirin. Genikül tam olarak görünmüyorsa, hayvanın başını hafifçe geriye doğru eğin ve kemik ön kenarını sinire çekmeye çalışın.Gangliyon hala gizlenmişse, aşağıdan daha fazla kemik çekin, sondayı kemiğin derinlerine yerleştirmemeye dikkat edin, çünkü bu geniküle zarar verebilir. Lezzetli paneli çalıştırmak için, sıvıyı geniş bir yüzeyden çıkarmak için emişli kullanın ve fareyi bir diseksiyon mikroskobu altında emici bir ped üzerine yerleştirin. Bulla'da kalan deliği, temporal kemikteki deliği ve genikül ganglionu bulmak için yedinci siniri kullanın.Ve genikül ganglion nöronlarını ifade eden bireysel GCaMP'yi kontrol etmek için epifluoresan dürbündeki FITCGFP filtresini kullanın. Bir tastant hattı için dağıtım iğnesini hayvanın ağzına sıkıca yerleştirin ve herhangi bir sıvıyı yakalamak için ağzın altına bir Petri kabı yerleştirin. Video kaydının başlangıcını, kayıt sırasında yanıtlar, sürüklenme ve sızıntı için canlı akışı izleyerek, lezzetli sunumun başlangıcıyla senkronize edin.Sızıntı meydana gelirse, genikül görünümü net olana kadar sıvıyı emiş edin ve lezzetliyi yeniden bildirin. Sürüklenme meydana gelirse, baş direğin tüm kısımlarının sıkıca sıkılıp sıkıldığını kontrol edin. Yanıt alınmazsa, sıvının akıp aktığını ve mikroskop ve kameranın görüş alanını gizleyen bir şey olmadan uygun konuma odaklanıp odaklanmadığını kontrol edin.İstenilen tüm deneyler tamamlandığında, retraktörleri hafifçe gevşetin ve hayvanın karşı tarafındaki maruziyet ve şok analizini tekrarlayın. Gözlemlendiği gibi, dile uygulanan tat uyaranları GCaMP floresanında hızlı bir geçici artışa neden olmalı ve yanıt veren nöronlar arasında parlaklıkta gözle görülür bir değişikliğe neden olmalıdır. Floresan video görüntülerinin analizi, zaman içinde tek tek ilgi çekici bölgelerdeki temel yanıt üzerindeki floresan değişikliklerine karşılık gelen izlerin üretilmesini sağlar.Eşik seviyesinin üzerindeki floresan yoğunluğundaki değişiklikler olumlu bir yanıt olarak kabul edilir. Gangliyona zarar vermenin yanı sıra kanamayı önlemek önemlidir. Kanama meydana gelirse, kanı görme alanından çıkarmak için salin ve emme uygulamadan önce kanın pıhtılaşmasını bekleyin.Genikül gangliyonunun görselleştirilmesi, araştırmacıların nöronların tat benzeri uyaranlara verdiği tepkileri doğrudan ölçmelerine ve bu nöronları Cre'ye bağımlı GCaMP gibi araçlarla tanımlamalarına izin sağlamıştır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optik Koherens tomografi: Fare retina Ganglion hücreleri Vivo içinde görüntüleme

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Nörofizyolojik Deneylerde Kapalı Döngü Uyaranlarını Tetiklemek Için Nöron Spiking Aktivitesinin Kullanılması

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Davranış ve Uyaran Yanıtları Sırasında Yetişkin Drosophila melanogaster'ı Tüm Beyin Görüntülemeye Hazırlama

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...