Name: visualizing and quantifying endonuclease-based site-specific dna damage
Uploaded: 2021-08-21T13:30:00
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Diese Forschung wurde durch das National Research, Development and Innovation Office Grant GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, das János Bolyai Research Scholarship der Ungarischen Akademie der Wissenschaften BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO Short-Term Fellowship 8513 und die Tempus Foundation finanziert.

1. Immundetektion spezifischer Proteine
<ol><li>Vorbereitung der Zellkultur und des Versuchsaufbaus
	<ol>
<li>Halten Sie U2OS-Zellen in Monoschichten in DMEM-Kulturmedium, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 1% antibiotisch-antimykotischer Lösung. HINWEIS: Verwenden Sie für die Induktion von DNA-Schäden auf Endonukleasebasis holzkohlebehandeltes oder steroidfreies Medium, um Systemleckagen zu vermeiden.</li>
		<li>Züchten Sie Zellen in einer befeuchteten 5% CO2 Um...

<ol>
	<li>Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitylation-Mediated+Fine-Tuning+of+DNA+Double-Strand+Break+Repair.">Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair.</a> Cancers (Basel). 12 (6), (2020).</li><li>Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Roles+of+Post-Translational+Modifications+in+Nucleotide+Excision+Repair.">Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair.</a> Cells. 9 (6), (2020).</li><li>Stephens, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+cancer+genes+and+mutational+processes+in+breast+cancer.">The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer.</a> Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).</li><li>Turnbull, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-gene+interactions+in+breast+cancer+susceptibility.">Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility.</a> Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).</li><li>Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-Oxoguanine-mediated+transcriptional+mutagenesis+causes+Ras+activation+in+mammalian+cells.">8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).</li><li>Jiricny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+mismatch-repair+system.">The multifaceted mismatch-repair system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).</li><li>Hanawalt, P. C., Spivak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription-coupled+DNA+repair:+two+decades+of+progress+and+surprises.">Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).</li><li>Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+DNA+break+metabolism:+in+the+'end',+it's+a+good+thing.">Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing.</a> EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).</li><li>Lemaitre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+position+dictates+DNA+repair+pathway+choice.">Nuclear position dictates DNA repair pathway choice.</a> Genes &amp; Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).</li><li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway.">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li><li>Lambert, S., Lopez, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mammalian+RAD51+double+strand+break+repair+using+non-lethal+dominant-negative+forms.">Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms.</a> EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).</li><li>Xu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p300-mediated+acetylation+of+histone+demethylase+JMJD1A+prevents+its+degradation+by+ubiquitin+ligase+STUB1+and+enhances+its+activity+in+prostate+cancer.">p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer.</a> Cancer Research. , (2020).</li><li>Kastan, M. B., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+checkpoints+and+cancer.">Cell-cycle checkpoints and cancer.</a> Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).</li><li>Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1+and+BRCA2:+different+roles+in+a+common+pathway+of+genome+protection.">BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).</li><li>Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+or+Death+after+a+Break:+What+Determines+the+Choice.">Life or Death after a Break: What Determines the Choice.</a> Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Caron, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WWP2+ubiquitylates+RNA+polymerase+II+for+DNA-PK-dependent+transcription+arrest+and+repair+at+DNA+breaks.">WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks.</a> Genes &amp; Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).</li><li>Caron, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+protects+genes+against+gammaH2AX+Induced+by+DNA+double-strand+breaks.">Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks.</a> PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).</li><li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites.">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).</li><li>Paques, F., Duchateau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meganucleases+and+DNA+double-strand+break-induced+recombination:+perspectives+for+gene+therapy.">Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).</li><li>Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAPKcs-dependent+arrest+of+RNA+polymerase+II+transcription+in+the+presence+of+DNA+breaks.">DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).</li><li>Iacovoni, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+gammaH2AX+around+DNA+double+strand+breaks+in+the+mammalian+genome.">High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome.</a> EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).</li><li>Poinsignon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Artemis+following+irradiation-induced+DNA+damage.">Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage.</a> European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).</li><li>Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+DNA+damage+induced+repair+focus+formation+via+super-resolution+dSTORM+localization+microscopy.">Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy.</a> Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).</li><li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals.">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).</li><li>Daniels, D. L., Urh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intracellular+protein--DNA+complexes+using+HaloCHIP,+an+antibody-free+alternative+to+chromatin+immunoprecipitation.">Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation.</a> Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).</li></ol>

Obwohl die DNA-Reparatur ein relativ neues Forschungsgebiet ist, erweitert sich unser Wissen mit Hilfe verschiedener biochemischer und mikroskopischer Methoden rasant. Die Erhaltung der genetischen Information ist für Zellen von entscheidender Bedeutung, da Mutationen, die in Genen auftreten, die an Reparaturprozessen beteiligt sind, zu den Hauptursachen für Tumorgenese gehören und daher die Aufklärung der wichtigsten Schritte von DNA-Reparaturwegen unerlässlich ist.
Biochemische Technike...

Unser Genom wird ständig durch verschiedene DNA-schädigende Wirkstoffe herausgefordert. Diese Angriffe können von Umweltquellen wie UV-Licht oder Bestrahlung sowie von endogenen Quellen wie metabolischen Nebenprodukten, die durch oxidativen Stress oder Replikationsfehler verursacht werden, stammen1,2. Diese Läsionen können die Integrität eines oder beider DNA-Stränge beeinträchtigen, und wenn die erzeugten Fehler persistent werden, führt dies häufig zu Translokationen und Genominstabilität, was zu Tumorgenese führen kann3,4. Um die Integrität des Genoms zu erhalten, wurden während der Evolution mehrere Reparatursysteme entwickelt. Entsprechend den chemischen und physikalischen Eigenschaften bestimmter Arten von DNA-Schäden können mehrere Reparaturmechanismen aktiviert werden. Mismatches, abasic stellen, Einzelstrangbrüche und 8-Oxoguanin (8-OxoG) können entweder durch Mismatch-Reparatur oder Base-Exzisions-Reparaturweg5,6entfernt werden. Läsionen, die durch UV-induzierte Photoprodukte und sperrige Addukte verursacht werden, können entweder durch Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER) oder DNA-Doppelstrangbruchreparatur (DSBR) repariert werden7,8. NER besteht aus zwei Hauptsubwegen: transkriptionsgekoppeltes NER (TC-NER) und globales genomisches NER (GG-NER). In Bezug auf die Zellzyklusphase können nach der DNA-Doppelstrangbruchinduktion zwei Subwege aktiviert werden: nicht-homologe Endfügung (NHEJ) und homologe Rekombination (HR)1,9. NHEJ, der dominante Weg in ruhenden Zellen, kann in allen Zellzyklusphasen aktiviert werden und stellt einen schnelleren, aber fehleranfälligen Weg dar10. Auf der anderen Seite ist HR ein fehlerfreier Weg, bei dem die DSBs basierend auf der Sequenz-Homologie-Suche der Schwesterchromatiden repariert werden, daher ist es hauptsächlich in den S- und G2-Zellzyklusphasen11vorhanden. Darüber hinaus ist das mikrohomologievermittelte Endfügen (MMEJ) ein weiterer DSB-Reparaturmechanismus, der sich von den oben genannten unterscheidet und auf einer KU70/80- und RAD51-unabhängigen Art der Religatur von zuvor resezierten mikrohomologen Sequenzen basiert, die die gebrochenen DNA-Enden flankieren. Daher gilt MMEJ als fehleranfällig und sehr mutagen12. Während der DNA-Reparatur können DSBs die DNA-Schadensreaktion (DDR) induzieren, was zur Aktivierung von Checkpoint-Kinasen führt, die den Zellzyklus während der Reparatur stoppen13,14,15. Die DDR wird als Reaktion auf die Rekrutierung und extensive Verbreitung von Initiator-Schlüsselakteuren des Reparaturprozesses um die Läsionen aktiviert und trägt zur Bildung eines Reparaturfokus bei. In dieser frühen Signalkaskade spielt die ATM-Kinase (Ataxia Telangiectasia Mutated) eine zentrale Rolle, indem sie die Phosphorylierung der Histonvariante H2AX bei Ser139 (γH2AX genannt) um die Läsion16katalysiert. Dieses frühe Ereignis ist verantwortlich für die Rekrutierung zusätzlicher Reparaturfaktoren und die Initiierung nachgelagerter Reparaturprozesse. Obwohl die genaue Funktion der rekrutierten Proteine im Reparaturfokus noch nicht vollständig charakterisiert ist, wurden die Bildung und die Dynamik von Reparaturherden von mehreren Laboren untersucht. Diese Marker werden ausgiebig verwendet, um die Reparaturkinetik zu verfolgen, aber ihre genaue Rolle während des Reparaturprozesses bleibt schwer fassbar. Aufgrund der großen Bedeutung, aber des schlechten Verständnisses von DNA-Reparatur-bezogenen zellulären Prozessen wurden bisher mehrere Methoden entwickelt, um die DDR zu induzieren und zu visualisieren.
Verschiedene Methoden und Systeme wurden etabliert, um die gewünschte Art von DNA-Schäden zu induzieren. Zum Beispiel können einige Wirkstoffe [wie Neocarzinostatin (NCS), Phleomycin, Bleomycin, γ-Bestrahlung, UV] eine große Anzahl von zufälligen DNA-Brüchen an nicht prädiktiven genomischen Positionen induzieren, während andere (Endonukleasen wie AsiSI, I-PpoI oder I-SceI sowie Laser striping) DNA-Brüche an bekannten genomischen Loci17,18,19,20,21induzieren können . Hier konzentrieren wir uns auf die endonukleasebasierten Techniken, die derzeit zur Untersuchung der DDR in Säugetier- und Hefezellen verwendet werden. Abgesehen davon, dass wir die Prinzipien dieser Techniken hervorheben, betonen wir sowohl ihre Vor- als auch Nachteile.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-OHT</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100&#215;), Stabilized</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab26350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Fraction V albumin</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>PM-T1725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrackIt&#8482; Cyan/Yellow Loading Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10482035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-707F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; M-280 Sheep Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11202D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11204D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Molar Chemicals</td>
			<td>02910-101-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37% solution free from acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1.03999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPure kit v2</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C03010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W205702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-DOC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N9162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Powder without Ca2+, Mg2+</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L182-50-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Molar Chemicals</td>
			<td>09400-203-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Set I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-S2056 DNAPKcs antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109169001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH3COONa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate-EDTA buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON X-100</td>
			<td>Molar Chemicals</td>
			<td>09370-006-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and quantifying endonuclease-based site-specific dna damage

Zellen sind kontinuierlich verschiedenen DNA-schädigenden Wirkstoffen ausgesetzt, die unterschiedliche zelluläre Reaktionen hervorrufen. Die Anwendung biochemischer und genetischer Ansätze ist unerlässlich, um zelluläre Ereignisse aufzudecken, die mit der Rekrutierung und Montage von DNA-Reparaturkomplexen an der Stelle von DNA-Schäden verbunden sind. In den letzten Jahren wurden mehrere leistungsfähige Werkzeuge entwickelt, um ortsspezifische DNA-Schäden zu induzieren. Darüber hinaus ermöglichen uns neuartige bahnbrechende Techniken, diese Prozesse auf der Ebene der Einzelzellauflösung sowohl mit festen als auch mit lebenden Zellen zu untersuchen. Obwohl diese Techniken zur Untersuchung verschiedener biologischer Prozesse eingesetzt wurden, stellen wir hier die am weitesten verbreiteten Protokolle auf dem Gebiet der DNA-Reparatur, des Fluoreszenzimmunfärbungs (IF) und der Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) vor, die es in Kombination mit endonukleasebasierten ortsspezifischen DNA-Schäden ermöglichen, die genomische Belegung von DNA-Reparaturfaktoren gezielt und reguliert zu visualisieren und zu quantifizieren. beziehungsweise. Diese Techniken bieten den Forschern leistungsfähige Werkzeuge, um neuartige Proteine zu identifizieren, die an den beschädigten genomischen Locus gebunden sind, sowie ihre post-translationalen Modifikationen, die für ihre Feinabstimmung während der DNA-Reparatur erforderlich sind.

Die Untersuchung ortsgerichteter DSB-induzierter Reparaturprozesse in Zellen kann entweder durch stabile oder transiente Transfektion erreicht werden. Es ist jedoch zu beachten, dass eine stabile Transfektion eine homogene Zellpopulation gewährleistet, die eine einheitliche und damit zuverlässigere zelluläre Reaktion ergibt. Bei der transienten Transfektion nimmt nur ein kleiner Teil der Zellpopulation das Plasmid auf und erhält es, was Diversität in das Experiment einführt. Die Etablierung von ER-I-PpoI- oder ER-A...

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Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Dieser Artikel stellt wesentliche Schritte der Immunfärbung und Chromatin-Immunpräzipitation vor. Diese Protokolle werden häufig verwendet, um DNA-schädigende zelluläre Prozesse zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteinen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, zu visualisieren und zu quantifizieren.

Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

Dieses Methodenvideo stellt die entscheidenden Schritte der Immunfärbungs- und Chromatin-Immunpräzipitationsprotokolle vor, die regelmäßig verwendet werden, um DNA-schädigende zelluläre Prozesse zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteinen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, zu visualisieren und zu quantifizieren. Diese Technik bietet den Forschern leistungsfähige Werkzeuge, um neuartige Proteine zu identifizieren, die an den beschädigten genomischen Locus gebunden sind, sowie ihre post-translationalen Modifikationen, die für die fein abgestimmte Regulation während der DNA-Reparatur notwendig sind. Da diese Techniken zur Untersuchung verschiedener zellulärer Prozesse eingesetzt werden können, haben sie potenzielle Relevanz, wenn eine Lasermikrostrahlung oder die kernbasierte DNA-schädigenden induzierenden Systeme verwendet werden.In jüngster Zeit wurden mehrere leistungsstarke Werkzeuge entwickelt, um ortsspezifische DNA-Schäden zu induzieren, die verwendet werden können, um unser Verständnis der DNA-Reparatur zu erweitern. Unter Anwendung biochemischer und genetischer Ansätze sind diese Utensilien unerlässlich, um zelluläre Ereignisse aufzudecken, die mit der Rekrutierung und Montage von DNA-Reparaturkomplexen an der Stelle von DNA-Schäden verbunden sind. Darüber hinaus ermöglichen diese Techniken die Untersuchung dieser Prozesse bei Einzelzellauflösung sowohl mit festen als auch mit lebenden Zellen.Halten Sie U2OS-Zellen in Monoschichten in DMEM-Kulturmedium, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum, 2 Millimolarglutamin und der 1% antibiotisch-antimykotischen Lösung. Züchten Sie Zellen in einer befeuchteten 5% Kohlendioxid-Umgebung bei 37 Grad, bis 80% Konfluenz erreicht ist, wobei das Medium alle zwei bis drei Tage erneuert wird. Saugen Sie das Medium an und waschen Sie die Zellen mit PBS.Zellen mit Trypsin-EDTA-Lösung lösen. Wenn sich die Zellen lösen, stoppen Sie die Aktivität des Trypsins, indem Sie den Zellen Nährmedien hinzufügen, wodurch eine Zellsuspension erhalten wird. Zählen Sie die Zellen mit einer Zellzählkammer.Platte 20.000 Zellen pro Milliliter pro Vertiefung auf der 24-Well-Platte mit steriler 12-Millimeter-Rundabdeckung schlüpft in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad in einer befeuchteten 5% Kohlendioxid-Umgebung, damit die Befestigung auf der Abdeckung rutscht. Behandeln Sie die Zellen mit 10 Nanogramm pro Milliliter Neocarzinostatin oder verwenden Sie die entsprechende Methode, um Doppelstrangbrüche über endonukleusebasierte Systeme zu induzieren.Inkubieren Sie die Zellen für ein bis acht Stunden bei 37 Grad in einer befeuchteten 5% Kohlendioxid-Umgebung, um der Kinetik der DNA-Reparatur zu folgen. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Formaldehyd PBS-Lösung für 20 Minuten bei 25 Grad. Entfernen Sie die Fixierlösung und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS für jeweils fünf Minuten.Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 0,2% Triton X in PBS gelöst hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 20 Minuten. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.Blockieren Sie die unspezifische Bindung mit 5% BSA verdünnt in BSA-PBST und inkubieren Sie die Proben für mindestens 20 Minuten. Fügen Sie die richtige Menge an primärem Antikörper hinzu, der in 1% BSA-PBST-Lösung verdünnt ist. Legen Sie jeden Deckzettel kopfüber auf einen Parafilm oder einen 10-Mikroliter-Tröpfchen des verdünnten Antikörpers.Inkubieren Sie die Proben in einer Feuchtigkeitskammer für eineinhalb Stunden bei vier Grad. Legen Sie die Seitwärtsrutsche wieder in die 24-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Fügen Sie die richtige Menge an sekundärem Antikörper hinzu, der in 1% BSA-PBST verdünnt ist.Legen Sie jeden Deckelrutsch kopfüber auf den Parafilm über einen 10-Mikroliter-Tropfen des verdünnten Antikörpers. Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang in einer Feuchtigkeitskammer bei vier Grad. Legen Sie die Abdecklappen wieder in die 24-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal mit PBS.Vor dem Entfernen der letzten PBS-Waschlösung die Deckelrutsche vorsichtig mit der Hälfte der Pinzette und der Nadel herausnehmen und dann kopfüber mit Tröpfchen Des Montagemediums auf die Glasträger legen. Die Chromatin-Immunpräzipitation ist eine weit verbreitete Technik, um Bindungsmuster von Proteinen an DNA zu identifizieren. Um die Belegung eines Wunschreparaturproteins um das DSB herum aufzudecken, wird ein spezifischer Antikörper verwendet, um das interessierende Protein aus dem Chromatinpräparat zusammen mit der DNA-Region, an die es gebunden ist, zu immunpräzipieren.Darüber hinaus wurde ChIP häufig angewendet, um das Vorhandensein spezifischer post translationaler Modifikationen bei der Verwendung durch DSBs an einem bestimmten genomischen Ort abzubilden. Ungefähr 20 Millionen Zellen pro Milliliter sollten in einer 15 Zentimeter großen Schale für jede Probe kultiviert werden. Kulturmedium entfernen und die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS waschen.Fixieren Sie die Zellen mit 1% Formaldehyd-PBS-Lösung. Legen Sie die Platte auf einen Orbitalschüttler und rühren Sie 20 Minuten lang sanft. Stoppen Sie die Fixierung mit Glycin, um eine Endkonzentration von 125 Millimolar zu erreichen, und inkubieren Sie auf einem Orbiter-Shaker mit sanftem Rühren für fünf Minuten bei 25 Grad.Legen Sie den Teller auf Eis und waschen Sie ihn zweimal mit eiskaltem PBS. Kratzen Sie die Zellen in eiskaltem PBS ab und übertragen Sie sie in 15 Milliliter konische Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 5.000 U / min für fünf Minuten bei vier Grad.Den Überstand vorsichtig absaugen und das Pellet in zwei Milliliter Zelllysepuffern wieder aufsaugen und 10 Minuten auf Eis inkubieren. Zentrifuge bei 5.000 U/min für fünf Minuten bei vier Grad. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Pellet in 500 bis 1.500 Mikroliter Kernlysepuffer und inkubieren Sie es 30 bis 60 Minuten auf Eis.Das Lysat wird in ein konisches Polystyrolrohr überführen, das für die Beschallung geeignet ist. Beschallen Sie das Lysat, um die DNA auf eine durchschnittliche Fragmentgröße von 300 bis 1000 Basenpaaren zu scheren. Bereiten Sie Dynabeads für die Vorreinigungs- und Immunpräzipitationsschritte vor.Perlen zweimal für 10 Minuten bei vier Grad mit RIPA-Puffer waschen. Verwenden Sie Dynabeads in demselben RIPA-Puffervolumen, das Sie in Schritt 3.1 aus der ursprünglichen Stammlösung entnommen haben. Vorklarieren Sie 25 bis 30 Mikrogramm Chromatin jeder Probe mit vier Mikroliter-Dynabeads durch Rotation für ein bis zwei Stunden bei vier Grad.Die Dynabeads mit einem Magneten ausfällen und den Überstand in ein neues Eppendorf-Rohr überführen. Fügen Sie die entsprechende Menge an Antikörper zu jeder Chromatinprobe hinzu und drehen Sie sich über Nacht um vier Grad. Am nächsten Tag fügen Sie 40 Mikroliter gewaschene Dynabeads zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht, drehen Sie sie um vier Grad.Einmal mit 300 Mikroliter niedrigem Salzpuffer für 10 Minuten mit Drehung bei vier Grad waschen. Einmal mit 300 Mikroliter hohem Salzpuffer für 10 Minuten mit Drehung bei vier Grad waschen. Einmal mit 300 Mikroliter Lithiumchloridpuffer 10 Minuten mit Drehung bei vier Grad waschen.Zweimal mit 300 Mikroliter TE für 10 Minuten waschen, wobei die erste Wäsche bei vier Grad und die zweite Wäsche bei 25 Grad rotieren sollte. Fügen Sie den Perlen 200 Mikroliter Elutionspuffer hinzu und inkubieren Sie sie bei 65 Grad in einem Thermoschüttler für 15 Minuten unter kontinuierlichem Schütteln. Den Überstand in ein neues Röhrchen geben und die Perlen in 200 Mikroliter Elutionspuffer erneut eluieren.Fügen Sie 500 Mikrogramm pro Milliliter Proteinase-K und ein halbes Prozent SDS hinzu und inkubieren Sie die Proben bei 50 Grad für zwei Stunden. Führen Sie eine Chloroformextraktion durch und übertragen Sie die obere wässrige Phase auf ein neues Eppendorf-Rohr. Fügen Sie zweieinhalb Volumina absolutes Ethanol und 0,1 Volumen drei molare Natriumacetat pH 5,2 hinzu.Mindestens 20 Minuten bei minus 80 Grad inkubieren. Ethanol entfernen und Pellet an der Luft trocknen. Resuspend das Pellet in 50 Mikroliter TE. Um ihre spezielle Verteilung auf DNA zu untersuchen, sollte die Chromatin-Immunpräzipitation angewendet werden.Ein typisches experimentelles Ergebnis von ChIP-qPCR ist in dieser Abbildung dargestellt, das die zeitliche Anreicherung von Gamma-Histon AX als Reaktion auf I-PpoI-induzierte induzierte DNA-Schäden zeigt. Im linken Teil des Bildes wird das rechtzeitig detektierte Gamma-Histon-AX-Signal auf der Bruchseite gezeigt, während im rechten Teil die Gamma-Histon-AX-Verteilung an der Kontrollgenregion dargestellt wird, bei der nachgewiesene Brüche nicht induziert wurden. Obwohl die DNA-Reparatur ein relativ neues Forschungsgebiet ist, nimmt unser Wissen mit Hilfe biochemischer und mikroskopischer Methoden rapide zu.Nichtsdestotrotz erfordern biochemische Techniken wie ein Western Blot, Immunpräzipitation und Massenspektrometrie eine große Anzahl von Zellen. Die Reparaturprozesse der Studie stellen eine Momentaufnahme der gewünschten Zellpopulation dar. Das mikroskopische Feld wurde durch hochauflösende Techniken wie das hochauflösende Mikroskop revolutioniert, das die Visualisierung von DNA-schädigend induzierten zellulären Prozessen auf nukleosomaler Ebene sowie die genaue Kartierung der Protein-Colokalisierung ermöglicht.Auf der anderen Seite ist die Chromatin-Immunpräzipitation ein leistungsfähiges Werkzeug, insbesondere durch die Kombination mit Sequenzierungsmethoden, um ihr genomweites Bindungsmuster eines gewünschten DNA-Reparaturproteins und Doppelstrangbrüche in einer Chromatin- oder Heterochromatin-Region zu visualisieren.

Research

JoVE Journal

Biology

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

Extrahieren von DNA aus dem Gut Mikroben der Termite (Zootermopsis Angusticollis) und visualisieren Gut Mikroben

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Forschung

Biologie

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

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Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

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Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

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Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

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Untersuchung der DNA Damage Checkpoint mit<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Auszüge

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

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Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel<em&gt; In-situ-</em&gt; Verwenden der TUNEL-Methode

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

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In - vivo - Alkaline Comet Assay und enzymmodifizierten Alkaline Comet Assay zur Messung von DNA - Strangbrüchen und oxidative DNA - Schäden in der Rattenleber

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

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Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...