Name: visualizing and quantifying endonuclease-based site-specific dna damage
Uploaded: 2021-08-21T13:30:00
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Esta pesquisa foi financiada pelo Escritório Nacional de Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação, que concede GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, a Bolsa de Pesquisa János Bolyai da Academia Húngara de Ciências BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, bolsa de curto prazo da EMBO 8513 e a Fundação Tempus.

1. Imunodeseção de proteínas específicas
<ol><li>Preparação da cultura celular e configuração experimental
	<ol>
<li>Manter células U2OS em monocamadas em cultura DMEM meio suplementado com soro de bezerro fetal de 10%, 2 mM de glutamina e 1% solução antibiótico-antimicomolética. NOTA: Para indução de dano de DNA à base de endonuclease, use meio tratado com carvão ou sem esteroides para evitar vazamentos no sistema.</li>
		<li>Cultivar células em um ambiente umidificado de 5% de CO...

<ol>
	<li>Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitylation-Mediated+Fine-Tuning+of+DNA+Double-Strand+Break+Repair.">Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair.</a> Cancers (Basel). 12 (6), (2020).</li><li>Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Roles+of+Post-Translational+Modifications+in+Nucleotide+Excision+Repair.">Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair.</a> Cells. 9 (6), (2020).</li><li>Stephens, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+cancer+genes+and+mutational+processes+in+breast+cancer.">The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer.</a> Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).</li><li>Turnbull, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-gene+interactions+in+breast+cancer+susceptibility.">Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility.</a> Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).</li><li>Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-Oxoguanine-mediated+transcriptional+mutagenesis+causes+Ras+activation+in+mammalian+cells.">8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).</li><li>Jiricny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+mismatch-repair+system.">The multifaceted mismatch-repair system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).</li><li>Hanawalt, P. C., Spivak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription-coupled+DNA+repair:+two+decades+of+progress+and+surprises.">Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).</li><li>Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+DNA+break+metabolism:+in+the+'end',+it's+a+good+thing.">Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing.</a> EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).</li><li>Lemaitre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+position+dictates+DNA+repair+pathway+choice.">Nuclear position dictates DNA repair pathway choice.</a> Genes &amp; Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).</li><li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway.">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li><li>Lambert, S., Lopez, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mammalian+RAD51+double+strand+break+repair+using+non-lethal+dominant-negative+forms.">Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms.</a> EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).</li><li>Xu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p300-mediated+acetylation+of+histone+demethylase+JMJD1A+prevents+its+degradation+by+ubiquitin+ligase+STUB1+and+enhances+its+activity+in+prostate+cancer.">p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer.</a> Cancer Research. , (2020).</li><li>Kastan, M. B., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+checkpoints+and+cancer.">Cell-cycle checkpoints and cancer.</a> Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).</li><li>Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1+and+BRCA2:+different+roles+in+a+common+pathway+of+genome+protection.">BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).</li><li>Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+or+Death+after+a+Break:+What+Determines+the+Choice.">Life or Death after a Break: What Determines the Choice.</a> Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Caron, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WWP2+ubiquitylates+RNA+polymerase+II+for+DNA-PK-dependent+transcription+arrest+and+repair+at+DNA+breaks.">WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks.</a> Genes &amp; Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).</li><li>Caron, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+protects+genes+against+gammaH2AX+Induced+by+DNA+double-strand+breaks.">Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks.</a> PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).</li><li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites.">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).</li><li>Paques, F., Duchateau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meganucleases+and+DNA+double-strand+break-induced+recombination:+perspectives+for+gene+therapy.">Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).</li><li>Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAPKcs-dependent+arrest+of+RNA+polymerase+II+transcription+in+the+presence+of+DNA+breaks.">DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).</li><li>Iacovoni, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+gammaH2AX+around+DNA+double+strand+breaks+in+the+mammalian+genome.">High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome.</a> EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).</li><li>Poinsignon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Artemis+following+irradiation-induced+DNA+damage.">Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage.</a> European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).</li><li>Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+DNA+damage+induced+repair+focus+formation+via+super-resolution+dSTORM+localization+microscopy.">Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy.</a> Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).</li><li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals.">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).</li><li>Daniels, D. L., Urh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intracellular+protein--DNA+complexes+using+HaloCHIP,+an+antibody-free+alternative+to+chromatin+immunoprecipitation.">Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation.</a> Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).</li></ol>

Embora a reparação de DNA seja um campo de pesquisa relativamente recente, nosso conhecimento está se expandindo rapidamente com a ajuda de vários métodos bioquímicos e microscópicos. Preservar informações genéticas é crucial para as células, uma vez que mutações que ocorrem em genes envolvidos em processos de reparação estão entre as principais causas da tumorigênese e, portanto, elucidar os passos-chave das vias de reparação do DNA é essencial.
Técnicas bioquímicas (ou...

Nosso genoma está constantemente sendo desafiado por vários agentes prejudiciais ao DNA. Esses ataques podem derivar de fontes ambientais, como luz UV ou irradiação, bem como de fontes endógenas, como subprodutos metabólicos causados por estresse oxidativo ou erros de replicação1,2. Essas lesões podem afetar a integridade de um ou ambos os fios de DNA, e se os erros gerados se tornarem persistentes, muitas vezes levam a translocações e instabilidade do genoma, o que pode resultar em tumorigênese3,4. Para manter a integridade do genoma, vários sistemas de reparo foram desenvolvidos durante a evolução. De acordo com as propriedades químicas e físicas de tipos específicos de dano de DNA, múltiplos mecanismos de reparação podem ser ativados. Incompatibilidades, locais abasic, quebras de fios únicos e 8-oxoguanina (8-oxoG) podem ser removidos por reparo de incompatibilidade ou via de reparo de excisão base5,6. Lesões causadas por fotoprodutos induzidos por UV e adutos volumosos podem ser reparadas pelo reparo nucleotídeo-excisão (NER) ou pelo processo de quebra de dois fios (DSBR) de DNA7,8. O NER consiste em duas subseções principais: NER (TC-NER) e NER genômica global (GG-NER). Em relação à fase do ciclo celular, após a indução de quebra de duplo fio do DNA, duas subsomidas podem ser ativadas: junção final não homólogo (NHEJ) e recombinação homólogo (HR)1,9. O NHEJ, que é o caminho dominante nas células de descanso, pode ser ativado em todas as fases do ciclo celular, representando uma via mais rápida, mas propensa a erros10. Por outro lado, o RH é uma via livre de erros, na qual os DSBs são reparados com base na pesquisa seqüencial-homologia dos cromátides irmãs, portanto está presente principalmente nas fases de ciclo celular S e G211. Além disso, a junção final mediada pela microhomologia (MMEJ) é outro mecanismo de reparo DSB, distinto dos mencionados, baseado em uma maneira ku70/80 e RAD51 independente de religação de sequências microhomologos anteriormente resseccionadas flanqueando as extremidades de DNA quebradas. Portanto, o MMEJ é considerado propenso a erros e altamente mutagênico12. Durante o reparo do DNA, os DSBs podem induzir a resposta a danos de DNA (DDR), que resulta na ativação de quinases de ponto de verificação que param o ciclo celular durante o reparo13,14,15. O DDR é ativado como resposta ao recrutamento e ampla disseminação dos principais atores iniciadores do processo de reparo em torno das lesões, contribuindo para a formação de um foco de reparo. Nesta cascata de sinalização inicial, o ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) quinase desempenha um papel fundamental ao catalisar a fosforilação da variante histone H2AX em Ser139 (referida como γH2AX) em torno da lesão16. Este evento inicial é responsável pelo recrutamento de fatores adicionais de reparo e pelo início de processos de reparo a jusante. Embora a função exata das proteínas recrutadas no foco de reparo ainda não tenha sido totalmente caracterizada, a formação e a dinâmica dos focos de reparação têm sido investigadas por diversos laboratórios. Estes marcadores são amplamente usados para seguir a cinética de reparo, mas seu papel preciso durante o processo de reparo permanece indescritível. Devido à grande importância, mas má compreensão dos processos celulares relacionados à reparação de DNA, vários métodos foram desenvolvidos até agora para induzir e visualizar o DDR.
Vários métodos e sistemas foram estabelecidos para induzir o tipo desejado de dano de DNA. Por exemplo, alguns agentes [como neocarzinostatina (NCS), fleomicina, bleomicina, γ-irradiação, UV] podem induzir um grande número de quebras aleatórias de DNA em posições genômicas não preditivas, enquanto outras (endonucleases, como AsiSI, I-PpoI ou I-SceI, bem como tira laser) podem induzir quebras de DNA em loci genômica conhecida17,18,19,20,21. Aqui, focamos nas técnicas baseadas em endonuclease atualmente utilizadas para estudar o DDR em células de mamíferos e leveduras. Além de destacar os princípios dessas técnicas, enfatizamos suas vantagens e desvantagens.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-OHT</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100&#215;), Stabilized</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab26350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Fraction V albumin</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>PM-T1725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrackIt&#8482; Cyan/Yellow Loading Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10482035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-707F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; M-280 Sheep Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11202D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#8482; M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11204D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Molar Chemicals</td>
			<td>02910-101-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37% solution free from acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1.03999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPure kit v2</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C03010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W205702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-DOC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N9162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Powder without Ca2+, Mg2+</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L182-50-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Molar Chemicals</td>
			<td>09400-203-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Set I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-S2056 DNAPKcs antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109169001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH3COONa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate-EDTA buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON X-100</td>
			<td>Molar Chemicals</td>
			<td>09370-006-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and quantifying endonuclease-based site-specific dna damage

As células são continuamente expostas a vários agentes prejudiciais ao DNA, induzindo diferentes respostas celulares. A aplicação de abordagens bioquímicas e genéticas é essencial para revelar eventos celulares associados ao recrutamento e montagem de complexos de reparação de DNA no local do dano ao DNA. Nos últimos anos, várias ferramentas poderosas foram desenvolvidas para induzir danos de DNA específicos do local. Além disso, novas técnicas seminais nos permitem estudar esses processos no nível de resolução unicelular usando células fixas e vivas. Embora essas técnicas tenham sido utilizadas para estudar vários processos biológicos, aqui apresentamos os protocolos mais amplamente utilizados no campo da reparação de DNA, Fluorescence Imunostaining (IF) e Chromatin Imunoprecipitation (ChIP), que em combinação com danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease possibilitam visualizar e quantificar a ocupação genômica de fatores de reparação de DNA de forma direcionada e regulamentada, respectivamente. Essas técnicas fornecem ferramentas poderosas para os pesquisadores identificarem novas proteínas ligadas ao lócus genômico danificado, bem como suas modificações pós-translacionais necessárias para sua regulação de ajuste fino durante a reparação do DNA.

Estudar processos de reparo induzidos pelo DSB direcionados ao local nas células pode ser alcançado através de transfecção estável ou transitória. No entanto, deve-se notar que a transfecção estável garante uma população celular homogênea, o que dá uma resposta celular unificada e, portanto, mais confiável. No caso da transfecção transitória, apenas uma pequena proporção da população celular ocupa e mantém o plasmídeo, o que introduz a diversidade no experimento. Estabelecer sistemas celulares bas...

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Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Este artigo introduz passos essenciais de imunoprecipitação de imunossuagem e cromatina. Esses protocolos são comumente usados para estudar processos celulares relacionados ao dano de DNA e para visualizar e quantificar o recrutamento de proteínas implicadas na reparação do DNA.

Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

Este vídeo de metodologia introduz as etapas cruciais dos protocolos de imunoprecipitação de imunossuagem e cromatina regularmente usados para estudar o processo celular relacionado ao dano de DNA e para visualizar e quantificar o recrutamento de proteínas implicadas na reparação do DNA. Esta técnica fornece ferramentas poderosas para os pesquisadores identificarem novas proteínas ligadas ao lócus genômico danificado, bem como suas modificações pós-translacionais necessárias para a regulação afinada durante a reparação do DNA. Uma vez que essas técnicas podem ser aplicadas para estudar diferentes processos celulares, elas têm potencial relevância se uma microirradição a laser ou o DNA baseado em núcleo danificar sistemas de indução são usados.Recentemente, várias ferramentas poderosas foram desenvolvidas para induzir danos de DNA específicos do local que podem ser usados para estender nossa compreensão da reparação de DNA. Aplicando abordagens bioquímicas e genéticas, esses utensílios são essenciais para revelar eventos celulares associados ao recrutamento e montagem de complexos de reparação de DNA no local do dano ao DNA. Além disso, essas técnicas permitem o estudo desses processos em resolução de células únicas utilizando células fixas e vivas.Manter células U2OS em monocamadas em cultura DMEM meio suplementado com soro de bezerro 10% fetal, 2 glutamina milimililar, e a solução antimycótica 1%. Cultivar células em um ambiente umidificado de 5% de dióxido de carbono a 37 graus até que 80% de confluência seja alcançada, renovando o meio a cada dois ou três dias. Aspire o meio e lave as células com PBS.Desapegar células com solução Trypsin-EDTA. Quando as células se desprendem, pare a atividade da trippsina adicionando mídia cultural às células, gerando uma suspensão celular. Conte as células usando uma câmara de contagem de células.Placa 20.000 células por mililitro por poço na placa de 24 poços com deslizamentos de cobertura redondas estéreis de 12 milímetros em cada poço. Incubar células por 24 horas a 37 graus em um ambiente umidificado de dióxido de carbono de 5% para permitir a fixação nos deslizamentos de cobertura. Trate as células com 10 nanogramas por neocarzinostatina mililitro ou use o método apropriado para induzir quebras de dois fios através de sistemas baseados em endonucleusa.Incubar células por uma a oito horas a 37 graus em um ambiente umidificado de 5% de dióxido de carbono para seguir a cinética do reparo do DNA. Fixar células com solução PBS de 4% de formaldeído por 20 minutos a 25 graus. Remova a solução de fixação e lave as células três vezes com PBS por cinco minutos cada.Retire o PBS e adicione 0,2% Triton X dissolvido em PBS. Incubar as amostras por 20 minutos. Lave as células três vezes com PBS.Bloqueie a ligação não específica com 5% de BSA diluída no BSA-PBST e incubar as amostras por pelo menos 20 minutos. Adicione a quantidade adequada de anticorpo primário diluído na solução 1%BSA-PBST. Coloque cada deslizamento de cobertura de cabeça para baixo em um parafilme ou 10 gotículas de microliter do anticorpo diluído.Incubar as amostras em uma câmara de umidade por uma hora e meia a quatro graus. Coloque a tampa deslizando para trás sendo lateral para cima na placa de 24 poços e a lavagem três vezes com PBS. Adicione a quantidade adequada de anticorpos secundários diluídos em 1%BSA-PBST.Coloque cada deslizamento de cobertura de cabeça para baixo em parafilm sobre uma gotícula de 10 microliter do anticorpo diluído. Incubar as amostras em uma câmara de umidade a quatro graus por uma hora. Coloque os deslizamentos de cobertura para trás sendo configurado na placa de 24 poços e lave três vezes com PBS.Antes da remoção da última solução de lavagem PBS, retire delicadamente os deslizamentos de cobertura com a metade da pinça e da agulha e, em seguida, coloque-os de cabeça para baixo sobre as lâminas de vidro com gotículas de meio de montagem. A imunoprecipitação de cromatina é uma técnica amplamente utilizada para identificar padrões de ligação de proteínas ao DNA. Para revelar a ocupação de uma proteína de reparação de desejo ao redor do DSB, um anticorpo específico é usado para imunoprecipitar a proteína de interesse da preparação da cromatina juntamente com a região de DNA à qual está ligada.Além disso, o ChIP tem sido comumente aplicado para mapear a presença de modificações pós-translacionais específicas em uso por DSBs em um determinado lócus genômico. Aproximadamente 20 milhões de células por mililitro devem ser cultivadas em um prato de 15 centímetros para cada amostra. Remova o meio de cultura e lave as células duas vezes com PBS gelado.Fixar as células com solução 1%formaldeído-PBS. Coloque a placa em um agitador orbital e agitar suavemente por 20 minutos. Pare a fixação com glicina para alcançar uma concentração final de 125 milimilhas e incubar em um agitador orbital com agitação suave por cinco minutos a 25 graus.Coloque a placa no gelo e lave duas vezes com PBS gelado. Raspe as células em PBS gelado e transfira-as para tubos cônicos de 15 mililitros. Centrifugar as células a 5.000 rpm por cinco minutos a quatro graus.Aspire cuidadosamente o supernasciente e resuspense a pelota em dois tampão de lise celular mililitro e incubar no gelo por 10 minutos. Centrífuga a 5.000 rpm por cinco minutos a quatro graus. Descarte cuidadosamente o supernascer e resuspenque a pelota em 500 a 1.500 tampão de lise nuclear microliter e incubar no gelo por 30 a 60 minutos.Transfira o lise para um tubo cônico de poliestireno adequado para a sônicação. Sonicar o lise para cisalhamento do DNA para um tamanho médio de fragmento de 300 a 1000 pares de base. Prepare as dínas para as etapas de pré-limpeza e imunoprecipitação.Lave as contas duas vezes por 10 minutos a quatro graus com tampão RIPA. Resuspend Dynabeads no mesmo volume de buffer RIPA que você tirou da solução de estoque original nas etapas 3.1. Pré-claro 25 a 30 microgramas de cromatina de cada amostra com quatro dynabeads microliter via rotação por uma a duas horas a quatro graus.Precipitar as Dynabeads com um ímã e transferir o supernatante para um novo tubo Eppendorf. Adicione a quantidade apropriada de anticorpo a cada amostra de cromatina e gire durante a noite a quatro graus. No dia seguinte, adicione 40 microlitos de Dínamos lavados a cada amostra e incuba-as durante a noite girando a quatro graus.Lave uma vez com 300 tampão de sal baixo por 10 minutos com rotação a quatro graus. Lave uma vez com 300 tampão de sal de 300 microliter por 10 minutos com rotação a quatro graus. Lave uma vez com 300 tampão de cloreto de lítio de 300 microliter por 10 minutos com rotação a quatro graus.Lave duas vezes com 300 microliter TE por 10 minutos com rotação para a primeira lavagem a quatro graus e a segunda lavagem a 25 graus. Adicione 200 tampão de eluição de microliter às contas e incuba-as a 65 graus em um termelétrica por 15 minutos com agitação contínua. Transfira o supernatante para um novo tubo e contas elute novamente em 200 tampão de eluição de microliter.Adicione 500 microgramas por mililitro proteinase-K e meio por cento de SDS e incubar as amostras a 50 graus por duas horas. Realize a extração de clorofórmio e transfira a fase superior aquosa para um novo tubo Eppendorf. Adicione dois volumes e meio de etanol absoluto e 0,1 volume três acetato de sódio molar pH 5.2.Incubar por pelo menos 20 minutos a menos 80 graus. Retire o etanol e o ar seque a pelota. Resuspend a pelota em 50 microliter TE. Para estudar sua distribuição especial no DNA, deve-se aplicar a imunoprecipitação de cromatina.Um resultado experimental típico obtido por ChIP-qPCR é apresentado nesta figura, o que demonstra o enriquecimento temporal do gama histona AX como resposta aos danos induzidos pelo I-PpoI no DNA. Na parte esquerda da imagem, o sinal de histona gama detectado oportunamente é mostrado no lado da ruptura, enquanto na parte direita, a distribuição gama histone AX é apresentada na região do gene de controle na qual as quebras demonstradas não foram induzidas. Embora a reparação de DNA seja um campo de pesquisa relativamente recente, nosso conhecimento está aumentando rapidamente com a ajuda de métodos bioquímicos e microscópicos.No entanto, técnicas bioquímicas, como uma mancha ocidental, imunoprecipitação e espectrometria de massa requerem uma grande quantidade de células. Os processos de reparação do estudo representam um instantâneo da população celular desejada. O campo microscópico tem sido revolucionado por técnicas de alta resolução, como microscópio de super resolução, que permite a visualização de processos celulares induzidos por danos de DNA no nível nucleosômico, além de garantir o mapeamento preciso da co-localização proteica.Por outro lado, a imunoprecipitação de cromatina é uma ferramenta poderosa, especialmente combinando-a com métodos de sequenciamento para visualizar seu padrão de ligação em todo o genoma de uma proteína relacionada à reparação de DNA desejada e quebras de fios duplos em regiões de cromatina ou heterocromatina.

Research

JoVE Journal

Biology

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

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Biologia

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