Name: fluorescence-based measurements of phosphatidylserine/phosphatidylinositol 4-phosphate exchange between membranes
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes at JoVE.com

ونحن ممتنون للدكتورة أ. كوتريس على تدقيقها الدقيق للمخطوطة. ويمول هذا العمل منحة الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR-16-CE13-0006) ومن المجلس الوطني للبحوث العلمية.

1. تنقية NBD-C2Lact
ملاحظة: على الرغم من أن هذا البروتوكول تفاصيل استخدام جهاز تعطيل الخلية لكسر البكتيريا، فإنه يمكن تعديلها لاستخدام استراتيجيات تحلل أخرى(على سبيل المثال، الصحافة الفرنسية). في بداية تنقية, فمن الإلزامي لاستخدام العازلة التي يتم degassed حديثا, تصفية, وت?...

تعتمد نتائج هذه المقايسات بشكل مباشر على إشارات أجهزة استشعار الدهون الفلورية. وبالتالي، فإن تنقية هذه المسابير التي تحمل علامة 1:1 مع بنك دبي الوطني وبدون تلوث حر بالفلوروفور من NBD هي خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. كما أنه من الإلزامي التحقق مما إذا كان LTP قيد الفحص مطويا بشكل صحيح وليس مجمع?...

التوزيع الدقيق للدهون بين الأغشية المختلفة وداخل أغشية الخلايا eukaryotic1،2 له آثار بيولوجية عميقة. فك تشفير كيف تعمل LTPs هي قضية هامة في بيولوجيا الخلية3،4،5،6، والنهج في المختبر هي ذات قيمة كبيرة في معالجة هذه المسألة7،8،9،10،11. هنا، يتم تقديم استراتيجية في المختبر، على أساس الفلورسينس التي كانت مفيدة في إثبات أن العديد من البروتينات ORP / Osh تأثير PS / PI (4) P تبادل بين أغشية الخلايا12 وبالتالي تشكل فئة جديدة من LTPs. PS هو glycerophospholipid الأنيوني الذي يمثل 2-10 ٪ من مجموع الدهون الغشاء في الخلايا eukaryotic13،14،16. يتم توزيعه على طول تدرج بين ER و PM ، حيث يمثل 5-7 ٪ وما يصل إلى 30 ٪ من الجليستروفوسفوليبيدات ، على التوالي17،18،19. وعلاوة على ذلك، يتركز PS أساسا في منشور السيتوسوليك من رئيس الوزراء. هذا تراكم وتقسيم متفاوتة من PS في PM حاسمة لعمليات الإشارات الخلوية19. نظرا لشحنة سلبية من جزيئات PS، منشور السيتوسوليك من رئيس الوزراء هو أكثر من ذلك بكثير أنيوني من منشور السيتوسوليك من العضيات الأخرى1،2،19،20. وهذا يمكن التوظيف، عبر القوى الكهروستاتيكية، من البروتينات الإشارات مثل myristoylated ألانين الغنية C-كيناز الركيزة (MARCKS)21، ساركوما (Src)22،كيرستن الفئران ساركوما الفيروسية oncogene (K-Ras)23،وراس ذات الصلة C3 البوتولينوم السم الركيزة 1 (Rac1)24 التي تحتوي على امتداد من الأحماض الأمينية المشحونة إيجابيا والذيل الدهني.
PS معترف بها أيضا من قبل البروتين التقليدي كيناز C بطريقة استريو انتقائية عبر نطاق C225. ومع ذلك، يتم تصنيع PS فيER 26،مما يشير إلى أنه يجب تصديرها إلى رئيس الوزراء قبل أن تتمكن من لعب دورها. لم يكن معروفا كيف تم تحقيق ذلك19 حتى وجدت أنه، في الخميرة، Osh6p وOsh7p نقل PS من ER إلى PM27. تنتمي هذه LTPs إلى عائلة محفوظة تطوريا في eukaryotes التي يكون عضوها المؤسس OSBP والتي تحتوي على بروتينات (ORPs في الإنسان ، بروتينات Osh في الخميرة) تدمج مجالا مرتبطا ب OSBP (ORD) مع جيب لاستضافة جزيء الدهون. Osh6p وOsh7p تتكون فقط من ORD التي يتم تكييفها ملامح الهيكلية لربط PS على وجه التحديد ونقله بين الأغشية. ومع ذلك ، كيف نقلت هذه البروتينات اتجاه PS من ER إلى رئيس الوزراء لم يكن واضحا. Osh6p وOsh7p يمكن فخ PI(4)P كبديل ليغاند الدهون12. في الخميرة، يتم تصنيع PI(4) P من فوسفاتيدلينوزيتول (PI) في غولجي ورئيس الوزراء من قبل PI 4-kinases، Pik1p و Stt4p، على التوالي. في المقابل، لا يوجد PI (4) P في غشاء الرواية، حيث يتم تحلل هذه الدهون إلى PI بواسطة فوسفاتاز Sac1p. وبالتالي، يوجد تدرج PI(4)P في كل من واجهات ER/Golgi وER/PM. Osh6p وOsh7p نقل PS من ER إلى رئيس الوزراء عبر PS / PI (4) P تبادل دورات باستخدام PI(4) P التدرج الموجود بين هذين الأغشية12.
ضمن دورة واحدة, مقتطفات Osh6p PS من ER, تبادل PS لPI(4)P في PM وينقل PI(4)P العودة إلى ER لاستخراج جزيء PS آخر. Osh6p/Osh7p التفاعل مع Ist2p28, واحدة من البروتينات القليلة التي تربط وجلب غشاء ER ورئيس الوزراء على مقربة من بعضها البعض لإنشاء مواقع الاتصال ER-PM في الخميرة29,30,31. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ارتباط Osh6p مع الأغشية المشحونة سلبا يصبح ضعيفا بمجرد أن يستخرج البروتين واحدة من ليغند الدهون بسبب تغيير تشكيلي أن يعدل ملامحه الكهروستاتيكي32. هذا يساعد Osh6p عن طريق تقصير وقت سكن الغشاء ، وبالتالي الحفاظ على كفاءة نشاط نقل الدهون. جنبا إلى جنب مع ربط إلى Ist2p، يمكن أن تسمح هذه الآلية Osh6p/7p على حد سواء بسرعة وبدقة تنفيذ تبادل الدهون في واجهة ER / PM. في الخلايا البشرية، ORP5 و ORP8 البروتينات تنفيذ PS / PI(4) P تبادل في مواقع الاتصال ER-PM عبر آليات متميزة33. لديهم ORD المركزية، أقرب إلى Osh6p، ولكن ترتكز مباشرة إلى ER عبر الجزء عبر المبنىC-33 ورسو السفن في PM عبر N-محطة Pleckstrin homology (PH) المجال الذي يتعرف PI(4)P و PI(4,5)P233,34,35. ORP5/8 استخدام PI(4)P لنقل PS, وقد تبين أن ORP5/8 بالإضافة إلى تنظيم PM PI(4,5)P2 مستويات ويفترض تعديل مسارات الإشارات. بدوره، انخفاض في PI(4)P و PI(4,5)P2 يخفض نشاط ORP5/ORP8 حيث ترتبط هذه البروتينات مع PM بطريقة تعتمد على PIP. تركيب PS عالية بشكل غير طبيعي, مما يؤدي إلى متلازمة لينز-Majewski, يؤثر PI(4)P المستويات من خلال ORP5/836. عندما يتم حظر نشاط كل من البروتينات، PS يصبح أقل وفرة في PM، وخفض القدرة على الاونوجينيك للإشارة البروتينات37.
على العكس من ذلك ، يبدو أن التعبير المفرط ORP5 يعزز غزو الخلايا السرطانية والعمليات النقيلية38. وهكذا، يمكن أن التعديلات على النشاط ORP5/8 تعديل السلوك الخلوي بشدة من خلال التغيرات في التوازن الدهون. علاوة على ذلك، تحتل ORP5 و ORP8 مواقع الاتصال ER-الميتوكوندريا والحفاظ على بعض وظائف الميتوكوندريا، ربما عن طريق تزويد PS39. بالإضافة إلى ذلك، ORP5 localizes إلى مواقع الاتصال قطرات ER-الدهون لتقديم PS إلى قطرات الدهون بواسطة PS / PI(4) P تبادل40. الاستراتيجية المذكورة هنا لقياس (1) PS و PI (4) P استخراج من الليبوسومات و (2) PS و PI (4) P النقل بين الليبوسومات وقد وضعت لإنشاء وتحليل PS / PI (4) P نشاط تبادل Osh6p/Osh7p12,32 وتستخدم من قبل مجموعات أخرى لتحليل نشاط ORP5/ORP835 وغيرها LTPs10, 41. وهو يقوم على استخدام قارئ لوحة مضان، مقياس الطيف L-تنسيق القياسية، واثنين من أجهزة الاستشعار الفلورية، NBD-C2Lact و NBD-PHFAPP،التي يمكن الكشف عن PS وPI(4) P، على التوالي.
NBD-C2Lact يتوافق مع المجال C2 من بروتين الجليكوبروتين, لاكتادهيرين, التي أعيد هندستها لتشمل سيستين المذيبات المعرضة فريدة من نوعها بالقرب من موقع ملزم PS المفترض; ويرتبط NBD حساسة للقطبية (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) الفلوروفوري بشكل متناقض لهذه البقايا (الشكل 1A)12. أن نكون أكثر دقة, المجال C2 من lactadherin (بوس الثور, UniProt: Q95114, بقايا 270-427) تم استنساخها في ناقلات pGEX-4T3 ليتم التعبير عنها في الانصهار مع الجلوتاثيون S-transferase (GST) في الإشريكية القولونية. ثم تحور تسلسلC2 Lact ليحل محل اثنين من بقايا السيستين التي يمكن الوصول إليها للمذيبات (C270، C427) مع بقايا ألانين وإدخال بقايا السيستين في منطقة بالقرب من موقع المفترضة PS ملزمة (H352C طفرة) التي يمكن أن توصف في وقت لاحق مع N'N'dimethyl-N-N-(iodoacetyl)-N'-(7-نيترابينز-2-أوكسا-1،3-ديازول-4-yl) ديامين الإيثيلين (IANBD) 12. يوجد موقع انشقاق للثرومبين بين بروتين GST والنهاية N لنطاق C2. ميزة رئيسية هي أن هذا المجال يعترف بشكل انتقائي PS بطريقة Ca2 +-independent خلافا لغيرها من المجالات المعروفة C2 أو Annexin A542. NBD-PHFAPP مشتق من مجال PH من البروتين البشري أربعة فوسفات محول 1 (FAPP1)، الذي أعيد هندسته ليشمل السيستين المذيبات المعرضة واحدة التي يمكن أن تكون وصفت مع مجموعة NBD بالقرب من PI(4) P موقع ملزم (الشكل 1A)43. تم استنساخ تسلسل النيوكليوتيدات من مجال PH من بروتين FAPP البشري (UniProt: Q9HB20 ، الجزء [1-100]) إلى ناقل pGEX-4T3 ليتم التعبير عنه جنبا إلى جنب مع علامة GST. تم تعديل تسلسلPH FAPP لإدراج بقايا السيستين فريدة من نوعها داخل واجهة الغشاء ملزمة للبروتين43. وعلاوة على ذلك، تم إدخال وصلة من تسعة بقايا بين موقع شق الثرومبين والنهيمينوس من مجال PH لضمان إمكانية الوصول إلى البروتيز.
لقياس استخراج PS من الليبوسومات ، يتم خلط NBD-C2Lact مع الليبوسومات المصنوعة من الفوسفاتيديل كولين (PC) التي تحتوي على كميات ضئيلة من PS. نظرا لتقاربها مع PS ، يرتبط هذا البناء بالليبوسومات ، وفلوروفور NBD يشهد تغييرا في القطبية لأنه يتلامس مع البيئة الكارهة للماء في الغشاء ، مما يثير تحولا أزرق وزيادة في الفلور إذا تم استخراج PS بشكل كامل تقريبا من قبل كمية stoichiometric من LTP، والتحقيق لا يرتبط مع الليبوسومات، وإشارة NBD أقل (الشكل 1B)32. ويستخدم هذا الاختلاف في إشارة لتحديد ما إذا كان LTP(على سبيل المثال، Osh6p) مقتطفات PS. وتستخدم استراتيجية مماثلة مع NBD-PHFAPP لقياس PI(4) P استخراج (الشكل 1B), كما هو موضح سابقا12,32. تم تصميم اثنين من المقايسات FRET المستندة إلى (1) قياس PS النقل من LA إلى LB liposomes، والتي تحاكي غشاء ER وPM، على التوالي، و (2) PI (4) P النقل في الاتجاه العكسي. يتم إجراء هذه المقايسات في نفس الظروف(أي نفس العازلة ودرجة الحرارة وتركيز الدهون) لقياس تبادل PS /PI(4) P. لقياس PS النقل، NBD-C2لاكت مختلطة مع LA ليبوسومات تتألف من جهاز الكمبيوتر ومنشطات مع 5 مول٪ PS و 2 مول٪ من الفلورسنت رودامين المسمى فوسفاتيديليثانلامينامين (رود-PE)-وLB ليبوسومات دمج 5 مول٪ PI(4)P.
في الوقت صفر، FRET مع رود PE يروي مضان NBD. إذا تم نقل PS من LA إلى LB ليبوسومات(على سبيل المثال، عند حقن Osh6p)، يحدث صرير سريع بسبب نقل جزيئات NBD-C2Lact من LA إلى LB ليبوسومات(الشكل 1C). ونظرا لكمية PS يمكن الوصول إليها، NBD-C2Lact لا يزال أساسا في حالة غشاء ملزمة على مدار التجربة12. وهكذا، فإن كثافة إشارة NBD ترتبط مباشرة مع توزيع NBD-C2Lact بين LA و LB liposomes ويمكن تطبيعها بسهولة لتحديد مقدار PS المنقول. لقياس نقل PI(4)P في الاتجاه المعاكس، يتم خلط NBD-PHFAPP مع LA و LB ليبوسومات؛ وبالنظر إلى أنه يربط فقط إلى LB الليبوسومات التي تحتوي على PI(4)P, ولكن ليس رود PE, مضان عالية. إذا تم نقل PI(4) P إلى LA liposomes، فإنه ينقل إلى هذه الليبوسومات، وتنخفض الإشارة بسبب FRET مع رود-PE(الشكل 1C). يتم تطبيع الإشارة لتحديد مقدار PI(4) P يتم نقل43.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;L-cysteine &#8805;97 % (FG)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305-100G</td>
			<td>Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W224681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm-diameter glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265934-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324, UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC800324, UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Gold Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0 Liss&#160; (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C16:0-PI(4)P&#160;&#160;</td>
			<td>Echelon Lipids</td>
			<td>P-4016-3</td>
			<td>Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 &#181;L of MeOH and 250 &#181;L of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C-500mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Disruptor</td>
			<td>Constant Dynamics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (CHCl3) RPE-ISO</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>438601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized (Milli-Q) water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide (DMF), anhydrous, &#62;99% pure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td>Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.&#160; Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac chromatography columns (1.5 &#215; 12 cm).</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette 2 mm</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td>EP102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator Eppendorf 2510</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Spinning the batcerial lysates</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (10, 25, and 50 &#181;L) for fluorescence experiment</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 &#181;L) to handle lipid stock solutions</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (99% pure)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemolysis tubes with a cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES , &#62;99 % pure</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra NAP 10 desalting column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>GE17-0854-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td>Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Acetate</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>26664.293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth medium without glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared with milli-Q water and autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH) &#8805;99.8%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20847.24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator-based fluorescence plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>M1000 Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N&#39;-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 &#181;L in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 &#176;C in the dark.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass)</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p5318-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-C2LACT&#160; plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-PHFAPP plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) &#8805;98.5% (GC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626-25g</td>
			<td>Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoramidon</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 &#181;m</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7311550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prefilters (10 mm in diameter).</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>http://pymol.org/</td>
			<td></td>
			<td>Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 &#181;L)</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge&#160; Eppendorf 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>B-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic PFTE stirring bar (5 &#215; 2 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO orange</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10602400001</td>
			<td>Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 &#181;L aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, ultra pure</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge L90K</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible absorbance spectrophotometer</td>
			<td>SAFAS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device</td>
			<td>Jasco or Shimadzu</td>
			<td>Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based measurements of phosphatidylserine/phosphatidylinositol 4-phosphate exchange between membranes

تم العثور مؤخرا على العديد من أعضاء البروتين المرتبط بالأوكسيسترول (OSBP) المرتبط بالبروتينات (ORP) / OSBP homologs (Osh) لتمثيل مجموعة جديدة من بروتين نقل الدهون (LTP) في الخميرة والخلايا البشرية. أنها نقل فوسفاتيديلسيرين (PS) من الشبكية الانتوبلازمية (ER) إلى غشاء البلازما (PM) عن طريق PS /فوسفاتيديلينوزيتول 4-فوسفات (PI(4)P) دورات التبادل. تسمح هذه النتيجة بفهم أفضل لكيفية توزيع PS ، وهو أمر بالغ الأهمية لعمليات الإشارات ، في جميع أنحاء الخلية والتحقيق في الصلة بين هذه العملية واستقلاب فوسفوينوسيتيد (PIP). وكان لتطوير بروتوكولات جديدة قائمة على الفلورسينس دور فعال في اكتشاف وتوصيف هذه الآلية الخلوية الجديدة في المختبر على المستوى الجزيئي. تصف هذه الورقة إنتاج واستخدام جهازي استشعار الدهون المسمى الفلورسنت، NBD-C2Lact و NBD-PHFAPP، لقياس قدرة البروتين على استخراج PS أو PI(4)P ونقل هذه الدهون بين الأغشية الاصطناعية. أولا، يصف البروتوكول كيفية إنتاج وتسمية والحصول على عينات عالية النقاء من هذه الإنشاءات اثنين. ثانيا، تشرح هذه الورقة كيفية استخدام أجهزة الاستشعار هذه مع قارئ لوحة مضانة لتحديد ما إذا كان البروتين يمكن استخراج PS أو PI (4) P من الليبوسومات، وذلك باستخدام Osh6p كدراسة حالة. وأخيرا، يوضح هذا البروتوكول كيفية قياس حركة تبادل PS/PI(4) P بدقة بين الليبوسومات من تكوين الدهون المحدد وتحديد معدلات نقل الدهون عن طريق نقل الطاقة بالرنين الفلوري (FRET) باستخدام مقياس الفلورومتر القياسي.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> الشكل 1: وصف أجهزة الاستشعار الدهون الفلورية والمقاسات في المختبر. (أ) نماذج ثلاثية الأبعاد من NBD-C2Lact و NBD-PHFAPP استنادا إلى الهيكل البلوري لنطاق C2 من اللاكتاديرين البقري (PDB ID: 3...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes at JoVE.com

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

هنا، ونحن نصف بروتوكولات باستخدام أجهزة استشعار الدهون الفلورية والدهون لتحديد ما إذا كان البروتين مقتطفات وينقل فوسفاتيديلسيرين أو فوسفاتيديلينوزيتول 4-فوسفات في المختبر.

القياسات القائمة على الفلورسينس من فوسفاتيديلسيرين / فوسفاتيديلينوزيتول 4-تبادل الفوسفات بين الأغشية

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

تستخدم هذه الطريقة الفلورسينس لتحديد ما إذا كان نقل البروتين إلى liqids المهم بيولوجيا بين الغشاء الاصطناعي وبالتالي المساهمة في توزيع هذه الدهون داخل الخلايا eukaryotic. هذه التقنية يجعل من الممكن لاستخراج ونقل الدهون الطبيعية عن طريق البروتين، فإنه يتطلب والخلايا الفلورية والدهون التي هي سهلة لجعل. يمكن استخدام هذه الطريقة وتعديلها للحصول على نظرة ثاقبة في البيولوجيا الخلوية عن طريق البروتينات وراء توزيع بعض الدهون الأساسية بين الجهاز والأغشية.تعتبر المظاهرة البصرية حاسمة لشرح كيفية إجراء قياسات في الوقت الحقيقي لنقل الدهون عن طريق الفلورسينس. لذا فإن إظهار الإجراء سيكون أيضا مود مجديلين، مهندسة في مختبري. تبدأ بإعداد الطازجة المصفاة وإزالة الغاز HEPES خلات البوتاسيوم العازلة، تكملها مع كلوريد المغنيسيوم ميليمولار واحد لتشكيل المخزن المؤقت HKM.ثم، وإعداد الليبوسومات مصنوعة فقط من جهاز الكمبيوتر أو مخدر بالإضافة إلى ذلك مع اثنين من الضرس في المئة PS أو PI(4)P. الآن، ضع القارورة على المبخر الدوار لتجفيف الدهون تحت الفراغ. في بئر واحد، مزيج الليبوسومات التي تحتوي على اثنين من الضرس في المئة PS مع استشعار الدهون، NBD-C2 لاكت، إلى تركيز نهائي من 250 نانومولار وحجم 100 ميكرولتر.ملء بئر ثانية مع نفس الكمية من الدهون و NBD-C2 لاكت مختلطة مع ثلاثة بروتين نقل الدهون ميكرومولار أو LTP. ملء بئر ثالثة مع 250 نانومولار NBD-C2 lact مختلطة مع نقية 80 ميكرومولار PC liposomes وبئر رابع مع نقية 80 ميكرومولار ليبوسومات PC. كرر هذه الخطوات لإعداد ثلاثة سلاسل إضافية من أربعة آبار.ثم ضع لوحة متعددة الآبار في القارئ الفلوري. لكل سجل جيد طيف NBD من 505 إلى 650 نانومتر مع عرض النطاق الترددي خمسة نانومتر عند الإثارة في 490 نانومتر في 25 درجة مئوية. لكل سلسلة طرح الطيف المسجل مع الليبوسومات فقط من الأطياف الأخرى.ل PI(4)P استخراج المقايسة إعداد الليبوسومات مخدر مع اثنين من المولر في المئة فوسفاتيدلينوزيتول-4-الفوسفات وإجراء القياسات مع التحقيق NBD-PH FAPP. إجراء تجارب التحكم وتحديد نسبة الاستخراج. بعد الانتهاء من الليبوسومات الطاردة ملء أنبوب مع هذه الليبوسومات مقذوف.إعداد خالية من الغاز الطازجة وتصفيتها HKM العازلة والحفاظ على الأنابيب التي تحتوي على الليبوسومات مقذوف في درجة حرارة الغرفة. التفاف أنابيب تحتوي على الليبوسومات مع رودامين المسمى فوسفاتيديليثانولامين في رقائق الألومنيوم وتخزينها في مربع مبهمة لمنع أي تبييض الصورة. تعيين درجة الحرارة بين 25 و 37 درجة مئوية وضبط أحادية اللون الإثارة إلى 460 نانومتر مع عرض نطاق ترددي قصير من واحد إلى ثلاثة نانومتر والانبعاثات إلى 530 نانومتر مع عرض نطاق ترددي كبير أكبر من 10 نانومتر.تعيين وقت الاستحواذ إلى خمس وعشرين دقيقة مع دقة الوقت من ثانية واحدة على الأكثر. في كوفيت الكوارتز تمييع 30 ميكرولتر من تعليق الدهون لوس انجليس و NBD-C2 محلول الأسهم اللاكت وحاجز HKM قبل الحرب لإعداد عينة 570 ميكرولتر التي تحتوي على 200 الدهون الكلية ميكرومولار و 250 نانومولار أو NBD-C2 lact. إضافة شريط صغير اثارة المغناطيسي ووضع cuvette في حامل الفلوروميتر.بمجرد أن يتم توازن العينة حراريا تشغيل القياس. بعد دقيقة واحدة، أضف 30 ميكرولتر من تعليق الليبوسوم LB إلى العينة. بعد ثلاث دقائق حقن LTP في العينة بحيث يكون التركيز النهائي للLTP 200 نانومولار، ثم الحصول على إشارة لمدة 21 دقيقة المتبقية.إجراء تجربة موازية لتطبيع إشارة NBD. مزيج 30 ميكرولتر من لوس انجليس تعليق ليبوسوم التوازن مع 250 نانومولار NBD-C2 lact في المخزن المؤقت HKM في حجم نهائي من 570 ميكرولتر. بعد دقيقة واحدة، حقن 30 ميكرولتر من LB التوازن تعليق الدهون.تحويل المنحنيات الحركية تقاس مع LTP من الفائدة لتحديد كمية PS نقلها من لوس انجليس لLB liposomes مع مرور الوقت. ثم تطبيع كل نقطة بيانات من المنحنى. قم بإجراء تجربة PI(4)P باستخدام نفس إعدادات وشروط باعث الكلمة كما هو الحال بالنسبة لمقاايسة نقل PS.في cuvette، مزيج 30 ميكرولتر من تعليق ليبوسوم رطل والتحقيق NBD-PH FAPP مع العازلة HKM ساخنة مسبقا للحصول على حجم نهائي من 570 ميكرولتر. بمجرد الوصول إلى التوازن الحراري للعينة، ابدأ القياس. بعد دقيقة واحدة، حقن 30 ميكرولتر من تعليق الدهون لوس انجليس.بعد ثلاث دقائق، حقن LTP من الفائدة وتسجيل الإشارة. إجراء تجربة ثانية لتطبيع إشارة NBD. مزيج 30 ميكرولتر من lb التوازن تعليق الدهون مع 250 نانومولار NBD-PH FAPP و 570 ميكرولتر من العازلة HKM.بعد دقيقة واحدة، حقن 30 ميكرولتر من لوس انجليس تعليق الدهون التوازن. تحويل المنحنيات الحركية لتحديد كمية PI(4) P المنقولة من LB إلى LA liposomes مع مرور الوقت، ثم تطبيع كل نقطة بيانات. تحديد مدى كفاءة LTP.إجراء انحدار خطي من نقاط البيانات الأولى من الحركية نقل للحصول على منحدر. تقسيم قيمة المنحدر من تركيز LTP في خليط التفاعل لتحديد عدد جزيئات الدهون المنقولة لكل بروتين في وحدة الوقت. تم التحقق من كفاءة استرداد C2 lact من الخرز مع تحليل صفحة SDS.وأكد الطيف الماصة المرئي للأشعة فوق البنفسجية من اللاكت C2 المسمى مع NBD أن جميع جزيئات اللاكت C2 وصفت مع مجموعة NBD. تم تحديد نقاء اللاكت NBD-C2 وفلورة من قبل تحليل صفحة SDS. كان تفلور NBD-C2 lact أو NBD-PH FAPP أقصى حد عندما تم استخدام الليبوسومات التي تحتوي على PS أو PI (4) P للحضانة ، مما يشير إلى أن المستشعر كان مقيدا بالغشاء.وشوهد تفلور منخفض عندما كان Osh6p حاضرا أيضا مما يشير إلى أن هذا البروتين استخرج بكفاءة PS أو PI (4) P من الليبوسومات. تظهر النتائج من فحص نقل PS باستخدام Osh6p ك LTP. تم حساب متوسط المنحنيات الحركية لنقل PS من الليبوسومات LA إلى ليبوسومات LB ، أو مخدرة ، أو غير مخدرة مع فوسفاتيدلينوزيتول -4-فوسفات.تم تحديد متوسط معدل النقل الأولي PS من ثلاث تجارب متميزة. وبالمثل، تظهر هنا نتائج اختبار نقل PI(4)P باستخدام Osh6p ك LTP. جنبا إلى جنب مع متوسط المنحنيات الحركية التي تم الحصول عليها بعد تطبيع الإشارة.تم قياس متوسط معدلات الانتقال مع الليبوسومات LA التي تم تعاطيها أو لم يتم تعاطيها مع PS. عند تنفيذ هذا البروتوكول استخدام المخزن المؤقت الطازجة وإعداد نفس الأيام. تقليل المعرض الخفيفة من الليبوسومات الفلورية والبروتينات، واستخدام البروتين NBD تنقية جيدا المسمى والاحتفاظ بها على الجليد. يمكن تأكيد ذلك عن طريق قياس PS و PI(4) P نقل بين العضية داخل الخلية prokaryotic باستخدام أجهزة استشعار الدهون الفلورية المشفرة وراثيا.هذه التقنية تمهد الطريق لفهم أفضل للPS وPI (4) يتم توزيعها داخل الخلية، ونشاطهم يخضع لخصوصية عدة LTPS.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

فحص مضان القائم من الفوسفوليبيدية Scramblase آخر

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

على الانترنت الحجم الاستبعاد والتبادل الأيوني اللوني على SAXS خط الأشعة

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

الحجم الذري الدراسات الهيكلية للتجميعات الجزيئات بالتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي الصلبة

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

والعزلة وقياسات الجهاز التنفسي من الميتوكوندريا من التمويل نبات

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

كشف المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

توصيف واحد حويصلات خارج الخلية في الدم البشري مع تحليل تتبع نانوحبيبات المستندة إلى الأسفار السريع

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

المراقبة في الوقت الحقيقي من رد تبادل حبلا الحمض النووي توسط Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

التبادل الأيوني اللوني (المستوى) بالإضافة إلى تشتت الضوء زاوية المتعددة (مالس) لفصل البروتين وتوصيف

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl تبادل جل تحويلة القول لتحديد كمي من البالميتويشن من بروتينات غشاء الدماغ

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...