Name: fluorescence-based measurements of phosphatidylserine/phosphatidylinositol 4-phosphate exchange between membranes
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00
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我们感谢卡特里斯博士对手稿的仔细校对。这项工作由法国国家研究机构赠款ExCHANGE（ANR-16-CE13-0006）和全国研究中心资助。

1. 净化NBD-C2乳酸
注：虽然此协议详细说明了使用细胞干扰器来分解细菌，但可以修改它以使用其他裂解策略（例如， 法国媒体）。在净化开始时，必须使用新鲜脱气、过滤和补充 2 mM 二恶英 （DTT） 的缓冲器，以防止西斯坦的氧化。然而，对于蛋白质标签步骤，完全去除DTT至关重要。许多步骤必须在冰上或寒冷的房间里进行，以避免任何蛋白质降解。必须按照?...

这些检测的结果直接取决于荧光脂质传感器的信号。因此，这些探针的净化标有与 NBD 的 1：1 比率，并且没有免费的 NBD 氟污染，这是本协议中的关键步骤。还必须检查所检查的 LTP 是否正确折叠而不是聚合。在提取检测中测试的LTP量必须等于或高于可访问的PS或PI（4）P分子，以正确测量该LTP是否有效提取这些脂质。事实上，NBD-C2乳酸和 NBD-PHFAPP分别与 PS 和 PI （4）P 结合，遵循经?...

不同膜之间和真核细胞膜内脂质的精确分布1、2具有深远的生物学意义。解密LTP功能如何是细胞生物学中一个重要的问题，3、4、5、6和体外方法对于解决这个问题有重要价值。在这里，提出了一种体外、荧光为基础的策略，有助于确定几个ORP/Osh蛋白对PS/PI（4）P细胞膜12之间的交换有作用，从而构成一类新的LTP。 PS是一种阴离子血糖磷脂，占真核细胞总膜脂质的2-10%13、14、16。它沿着急诊器和PM之间的梯度分布，分别代表5-7%和高达30%的甘油磷脂，分别为17、18、19。此外，PS 基本上集中在 PM 的细胞溶胶传单中。这种积累和下午PS的不均匀分割对于细胞信号过程19至关重要。由于PS分子的负电荷，PM的细胞溶胶传单比其他细胞器1，2，19，20的细胞溶胶传单要电性得多。这使得通过静电部队进行招募， 信号蛋白，如富含肌酸丙氨酸的C-激酶基板（MARCKS）21，肉瘤（Src）22，柯尔斯滕-鼠肉瘤病毒肿瘤病毒肿瘤23，和拉斯相关的C3肉毒杆菌毒素基板1 （Rac1）24，含有一段带正电荷的氨基酸和脂质尾巴。
PS也通过C2域25以立体选择的方式被传统蛋白激酶C识别。但是，PS 在 ER26中合成，表明它必须导出到 PM 才能发挥作用。直到发现，在酵母，Osh6p和Osh7p转移PS从ER到PM27，不知道这是如何完成19。这些LTP属于真核生物的进化保护家族，其创始成员是OSBP，含有蛋白质（人类中的ORP，酵母中的奥什蛋白），结合了OSBP相关领域（ORD），口袋承载脂质分子。Osh6p 和 Osh7p 仅由 ORD 组成，其结构特征被调整为专门绑定 PS 并在膜之间传输。然而，这些蛋白质如何定向地将PS从ER转移到PM尚不清楚。Osh6p 和 Osh7p 可以捕获 PI （4）P 作为替代脂质配体12.在酵母中，PI （4）P 分别由高尔吉的磷酸二醇 （PI） 和 PM 的 PI 4 激酶、Pik1p 和 Stt4p 合成。相比之下，ER 膜中没有 PI（4）P，因为这种脂质由 Sac1p 磷酸酶水解到 PI。因此，PI （4）P 梯度存在于 ER/高尔吉和 ER/PM 接口中。Osh6p 和 Osh7p 通过 PS/PI （4）P 交换周期将PS 从 ER 传输到 PM，使用这两个膜12之间的 PI （4）P 梯度。
在一个周期内，Osh6p 从 ER 中提取 PS，在 PM 将 PS 交换为 PI （4）P，并将 PI （4）P 传输回 ER 以提取另一个 PS 分子。Osh6p/Osh7p 与 Ist2p28相互作用，这是连接并使 ER 膜和 PM 彼此紧密相连的少数蛋白质之一，可在酵母29、30、31中创建 ER-PM 接触点。此外，Osh6p 与负电压膜的关联在蛋白质提取脂质配体之一后立即变得弱，因为构象变化改变了其静电特征32。这有助于Osh6p缩短其膜停留时间，从而保持脂质转移活动的效率。结合与 Ist2p 的结合，此机制可以使 Osh6p/7p 在 ER/PM 接口快速准确地执行脂质交换。在人体细胞中，ORP5和ORP8蛋白通过不同的机制33在ER-PM接触点执行PS/PI（4）P交换。他们有一个中央ORD，类似于Osh6p，但直接锚定到ER通过C终端跨膜段33和停靠到PM通过N终端普莱克斯特林同源（PH）域，识别PI（4）P和PI（4，5）P233，34，35。ORP5/8 使用 PI （4）P 传输 PS，并且已经表明 ORP5/8 还会调节 PM PI （4，5）P2级别，并可能调节信号通路。反过来，PI （4）P 和 PI （4，5）P2水平的降低降低了 ORP5/ORP8 活性，因为这些蛋白质以基于 PIP 的方式与 PM 相关联。异常高的PS合成，导致伦茨-马耶夫斯基综合征，影响PI（4）P水平通过ORP5/836。当两种蛋白质的活动被阻断时，PS在下午变得不那么丰富，降低了信号蛋白37的致癌能力。
相反，ORP5过度表达似乎促进癌细胞入侵和转移过程38。因此，对ORP5/8活性的改变可以通过脂质平衡的变化来严重改变细胞行为。此外，ORP5 和 ORP8 占据 ER-线粒体接触点，并保留一些线粒体功能，可能通过提供 PS39。此外，ORP5 本地化到 ER 脂液滴接触站点，通过 PS/PI （4）P 交换40将 PS 输送到脂质液滴。此处描述的测量 （i） PS 和 PI （4） P 从脂质体中提取和 （ii） PS 和 PI （4）P 在脂质体之间的传输的策略已被设计用于建立和分析 PS/PI （4）P 交换活动 Osh6p/Osh7p12，32并用于分析 ORP5/ORP835和其他 LTP10的活动， 41.它基于荧光板读取器、标准L格式光谱仪和两个荧光传感器（NBD-C2乳酸盐和NBD-PHFAPP）的使用，分别可以检测PS和PI（4）P。
NBD-C2乳酸对应于糖蛋白（乳酸丙胺）的 C2 域，该域重新设计，以包括假定的 PS 结合部位附近的一个独特的溶剂暴露的赛因子：极性敏感NBD（7-硝基苯甲酸-2-oxa-1，3-diazol）氟与这种残留物（图1A）12有共价关系。更确切地说，乳酸杆菌的C2域（博斯金牛座，UniProt：Q95114，残留物270-427）被克隆成pGEX-4T3载体，与大肠杆菌中的谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合。然后，C2乳酸序列发生变异，以替换两个可溶剂访问的赛因子残留物（C270， C427）与丙氨酸残留物，并引入一个赛因素残留物到附近的区域假定PS绑定位点（H352C突变），随后可以标记为N，N'-二甲基-N-（二恶英）-N'-（7-硝基苯-2-奥萨-1，3-二醇-4-yl）二胺乙烯（IANBD）12。 在 GST 蛋白和 C2 域的 N 终点之间存在血栓的位点。一个主要的优势是，这个域选择性地识别PS在Ca2+独立的方式与其他已知的C2域或附件A542相反。NBD-PHFAPP来自人类四磷酸盐适配蛋白1（FAPP1）的PH域，该蛋白被重新设计，包括一个溶剂暴露的赛因子，可以在PI（4）P结合位点（图1A）43附近标注NBD组。人类FAPP蛋白PH域的核苷酸序列（UniProt：Q9HB20，段[1-100]）已被克隆成pGEX-4T3载体，与GST标签一起表达。PHFAPP序列已修改，在蛋白质43的膜结合界面内插入独特的赛因子残留物。此外，在血栓裂口站点和 PH 域的 N 终点之间引入了九残联，以确保蛋白酶的可访问性。
要测量脂质体中的 PS 提取量， NBD-C2乳酸酯与含有微量PS的磷脂质素（PC）制成的脂质体混合。由于它对PS的亲和力，这种结构与脂质体结合，NBD荧光片在与膜的疏水环境接触时会经历极性的变化，从而引起蓝移和荧光的增加。如果PS几乎完全由LTP的气压量提取，探测器与脂质体没有关联，NBD信号较低（图1B）32。信号中的此差异用于确定 LTP（例如Osh6p）是否提取 PS。NBD-PHFAPP也采用了类似的策略来测量PI（4）P提取（图1B），如前所述的12，32。两个基于 FRET 的测定设计用于 （i） 测量从 LA到 LB脂质体的 PS 传输，分别模拟 ER 膜和 PM，以及 （ii） PI（4）P 向相反方向传输。这些检测在相同的条件下（即相同的缓冲、温度和脂质浓度）进行，以测量PS/PI（4）P交换。为了测量 PS 传输， NBD-C2乳酸盐与由 PC 组成的 LA脂质体混合， 掺杂 5 摩尔 % PS 和 2 摩尔% 的荧光罗丹标签磷酸乙醇胺 （Rhod-PE） - 和 LB脂质体， 包括 5 摩尔% PI （4） P.
在时间零，FRET与罗德-佩淬火NBD荧光。如果PS从LA运输到LB脂质体（例如，注射Osh6p后），由于NBD-C2乳酸分子从LA转移到LB脂体（图1C），就会发生快速排解。鉴于可访问的PS量，NBD-C2乳酸盐在实验过程中基本上保持膜绑定状态。因此，NBD 信号的强度直接与 LA和 LB脂体之间的 NBD-C2乳酸盐分布相关，并且可以轻松正常化以确定传输的 PS 量。为了测量 PI （4）P 朝相反的方向转移，NBD-PHFAPP与 LA和 LB脂质体混合：鉴于它只与含有PI（4）P的LB脂质体结合，而不是Rhod-PE，它的荧光很高。如果 PI （4）P 转移到 LA脂质体，则它转移到这些脂质体，并且信号因 Rhod-PE （图 1C）的 FRET 而降低。信号正常化，以确定 PI （4）P 传输43的量。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;L-cysteine &#8805;97 % (FG)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305-100G</td>
			<td>Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W224681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm-diameter glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265934-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324, UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC800324, UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Gold Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0 Liss&#160; (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C16:0-PI(4)P&#160;&#160;</td>
			<td>Echelon Lipids</td>
			<td>P-4016-3</td>
			<td>Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 &#181;L of MeOH and 250 &#181;L of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C-500mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Disruptor</td>
			<td>Constant Dynamics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (CHCl3) RPE-ISO</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>438601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized (Milli-Q) water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide (DMF), anhydrous, &#62;99% pure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td>Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.&#160; Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac chromatography columns (1.5 &#215; 12 cm).</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette 2 mm</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td>EP102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator Eppendorf 2510</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Spinning the batcerial lysates</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (10, 25, and 50 &#181;L) for fluorescence experiment</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 &#181;L) to handle lipid stock solutions</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (99% pure)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemolysis tubes with a cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES , &#62;99 % pure</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra NAP 10 desalting column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>GE17-0854-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td>Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Acetate</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>26664.293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth medium without glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared with milli-Q water and autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH) &#8805;99.8%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20847.24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator-based fluorescence plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>M1000 Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N&#39;-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 &#181;L in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 &#176;C in the dark.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass)</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p5318-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-C2LACT&#160; plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-PHFAPP plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) &#8805;98.5% (GC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626-25g</td>
			<td>Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoramidon</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 &#181;m</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7311550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prefilters (10 mm in diameter).</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>http://pymol.org/</td>
			<td></td>
			<td>Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 &#181;L)</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge&#160; Eppendorf 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>B-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic PFTE stirring bar (5 &#215; 2 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO orange</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10602400001</td>
			<td>Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 &#181;L aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, ultra pure</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge L90K</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible absorbance spectrophotometer</td>
			<td>SAFAS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device</td>
			<td>Jasco or Shimadzu</td>
			<td>Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based measurements of phosphatidylserine/phosphatidylinositol 4-phosphate exchange between membranes

进化保存的氧固醇结合蛋白（OSBP）相关蛋白质（ORP）/OSBP同源（Osh）家族的几个成员最近被发现代表了酵母和人类细胞中一种新的脂质转移蛋白（LTP）组。他们 通过 PS/磷脂蛋白4磷酸（PI（4）P）交换周期将磷脂蛋白（PS）从内质质视网膜（ER）转移到等离子体膜（PM）。这一发现有助于更好地了解PS，这对信号过程至关重要，如何在整个细胞中分布，并调查这个过程与磷酸二胺（PIP）代谢之间的联系。新的荧光协议的开发有助于在分子水平上发现和描述这种新的细胞机制 在体外 。本文描述了两个荧光标记脂质传感器NBD-C2乳酸 和NBD-PHFAPP的生产和使用，以测量蛋白质提取PS或PI（4）P的能力，并在人造膜之间转移这些脂质。首先，协议描述了如何生产、标记和获取这两种结构的高纯度样品。其次，本文解释了如何使用这些传感器与荧光微板读取器，以确定蛋白质是否可以提取PS或PI（4）P从脂质体，使用Osh6p作为案例研究。最后，本协议展示了如何准确测量定义脂质成分脂质体之间的 PS/PI （4）P 交换，以及使用标准荧光共振能量转移 （FRET） 确定脂质转移速率。

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> 图1：荧光脂质传感器和 体外 测定说明。 （A） NBD-C2乳酸 酯和NBD-PHFAPP 的三维模型基于牛乳酸（PDB ID：3BN648）的C2域晶体结构和人类FAPP1蛋白PH域的NMR结构（PDB ID：2KCJ46）。一个 N， N '二甲基 -N...

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Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

在这里，我们描述协议使用荧光脂质传感器和脂质体，以确定蛋白质提取物和运输磷酸二醇或磷二醇4磷酸盐 体外。

基于荧光的测量磷酸酯/磷酸二醇 4-磷酸盐膜之间的交换

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

这种方法使用荧光来确定蛋白质是否在合成膜之间转移到生物学上重要的脂质，从而有助于这些脂质在真核细胞内的分布。这项技术使蛋白质能够提取和运输天然脂质，它需要荧光细胞和脂质体，很容易制造。这种方法可以使用和修改，通过器官和膜之间一些基本脂质分布背后的蛋白质来深入了解细胞生物学。视觉演示对于解释如何通过荧光对脂质转移进行实时测量至关重要。因此，演示程序也将是莫德马格德琳，我的实验室工程师。首先准备新鲜的过滤和脱气的 HEPES 醋酸钾缓冲器，辅以一毫摩尔氯化镁，形成 HKM 缓冲器。然后，准备仅由 PC 制成的脂质体，或额外掺杂两个摩尔百分比 PS 或 PI （4）P。现在，将烧瓶放在旋转蒸发器上，在真空下干燥脂质。在一口井中，将含有两摩尔%PS的脂质体与脂质传感器NBD-C2乳酸混合，最终浓度为250纳米摩尔和100微升。用同样数量的脂质体和NBD-C2乳酸与三种微摩尔脂质转移蛋白或LTP混合，填充第二口井。用250纳米摩尔NBD-C2乳糖与纯80微摩尔PC脂质体混合，用纯80微摩尔PC脂质体填充第四口井。重复这些步骤，准备另外三个系列的四口井。然后将多井板放入荧光读卡器中。每口井记录的NBD频谱为505至650纳米，在25摄氏度的490纳米激发时带宽为5纳米。对于每个系列减去仅从其他光谱中记录的脂质体记录的光谱。对于PI（4）P提取检测准备脂质体掺杂了2摩尔%磷酸二甲基二醇-4磷酸盐，并使用NBD-PH FAPP探头进行测量。执行控制实验并确定提取百分比。完成挤压脂质体后，用这些挤出的脂质体填充管子。准备新鲜脱气和过滤的HKM缓冲器，并在室温下保持含有挤出脂质体的管子。将含有脂质体的管子与标有磷酸二醇胺的铝箔包裹起来，并存放在不透明的盒子中，以防止任何照片漂白。将温度设置在 25 至 37 摄氏度之间，并将激发单色计调整为 460 纳米，带宽短 1 到 3 纳米，将辐射到 530 纳米，带宽大于 10 纳米。将采集时间设置为 25 分钟，时间分辨率最多为 1 秒。在石英中，夸维特稀释了30微升的LA脂质体悬浮液和NBD-C2乳酸库存溶液和预温HKM缓冲器，以准备一个570微升样品，其中含有200微摩尔总脂质和250纳米摩尔或NBD-C2乳酸盐。添加一个小的磁搅拌棒，并将 cuvette 放置在荧计支架中。一旦样品被热平衡触发测量。一分钟后，在样品中加入 30 微升 LB 脂质体悬浮剂。三分钟后将LTP注入样品中，使LTP的最终浓度为200纳米摩尔，然后获得剩余21分钟的信号。进行并行实验，使 NBD 信号正常化。将 30 微升 LA 平衡脂质体悬浮液与 250 纳米摩尔 NBD-C2 乳酸混合在 HKM 缓冲器中，最终体积为 570 微升。一分钟后，注射30微升LB平衡脂质体悬浮液。转换使用感兴趣的 LTP 测量的动能曲线，以确定随着时间的推移从 LA 传输到 LB 脂质体的 PS 量。然后使曲线的每个数据点正常化。使用与 PS 传输检测相同的地板发射器设置和条件执行 PI （4）P 实验。在 cuvette 中，将 30 微升磅脂体悬架和 NBD-PH FAPP 探针与预加热的 HKM 缓冲器混合，获得 570 微升的最终体积。一旦达到样品的热平衡，就开始测量。一分钟后，注射30微升LA脂质体悬浮剂。三分钟后，注入感兴趣的LTP并记录信号。执行第二个实验以使 NBD 信号正常化。将 30 微升磅平衡脂质体悬浮液与 250 纳米摩尔 NBD-PH FAPP 和 570 微升 HKM 缓冲器混合。一分钟后，注射30微升LA平衡脂质体悬浮液。转换动能曲线，确定随着时间的推移从 LB 传输到 LA 脂质体的 PI （4）P 量，然后使每个数据点正常化。量化 LTP 的有效程度。对传输动力学的第一个数据点进行线性回归以获得坡度。将斜值除以反应混合物中的 LTP 浓度，以确定每个时间单位每个蛋白质转移的脂质分子数量。通过 SDS 页面分析验证了从珠子中高效回收 C2 乳糖。标有NBD的C2乳酸的紫外线可见吸光谱证实，所有C2乳酸分子都标有NBD组。NBD-C2乳清的纯度及其荧光是由SDS页面分析确定的。当只有含有PS或PI（4）P的脂质体用于孵育时，NBD-C2乳酸或NBD-PH FAPP的荧光是最大的，表明传感器是膜结合的。当Osh6p也出现时，出现了低荧光，表明这种蛋白质从脂质体中有效地提取了PS或PI（4）P。使用 Osh6p 作为 LTP 的 PS 传输检测结果如图所示。计算了从 LA 脂质体到 LB 脂质体、掺杂或未掺杂磷脂质醇-4-磷酸盐的 PS 传输的平均动能曲线。平均初始PS传输速率是由三个不同的实验确定的。同样，使用 Osh6p 作为 LTP 的 PI （4）P 传输检测结果也显示在此处。以及信号正常化后获得的平均动能曲线。平均转移率测量与 LA 脂质体被掺杂或不掺杂与 PS。执行此协议时，使用新的缓冲器并准备相同的日期。尽量减少荧光脂质体和蛋白质的光展示，使用纯化良好的NBD标签蛋白质，并把它们留在冰上。可以通过使用基因编码荧光脂质传感器测量蛋白酶细胞内细胞之间的PS和PI（4）P转移来确认。该技术为更好地了解 PS 和 PI （4） 分布在细胞内铺平了道路，它们的活动经过多个 LTPS 的特异性。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

磷脂Scramblase活动的基于荧光的测定法

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

科研

生物化学

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

在线体积排阻和离子交换色谱法SAXS光束线

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱用于研究蛋白质结构与动态

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

固体核磁共振波谱法研究高分子组件的原子尺度结构

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

拟南芥线粒体的分离和呼吸测量

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

膜蛋白对洗涤剂敏感相互作用的检测

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

基于荧光的人体血液单细胞外囊快速表征

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

rad51 介导的 dna 链交换反应的实时观测

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

离子交换色谱 (IEX) 与多角度光散射 (ALS) 相结合, 用于蛋白质分离和表征

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

阿西尔-PEGyl交换凝胶移位测定，用于脑膜蛋白棕榈酸化定量测定

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...