Name: fluorescence-based measurements of phosphatidylserine/phosphatidylinositol 4-phosphate exchange between membranes
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes at JoVE.com

A. Cuttriss 박사가 원고를 주의 깊게 읽은 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 프랑스 국립 연구 기관 보조금 ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006)와 CNRS에 의해 지원됩니다.

1. NBD-C2수유의 정화
참고: 이 프로토콜은 박테리아를 부러뜨리기 위해 세포 파괴기의 사용을 자세히 설명하지만, 다른 용해전략(예: 프랑스 언론)을 사용하도록 수정할 수 있습니다. 정화의 시작 부분에서, 시스테인의 산화를 방지하기 위해 2mM 디티오스레이톨(DTT)으로 갓 탈착, 여과 및 보충되는 버퍼를 사용해야 한다. 그러나 단백질 라벨링 단계의 경우 DTT를 완?...

이러한 아세의 결과는 형광 지질 센서의 신호에 직접적으로 의존합니다. 따라서, NBD를 가진 1:1 비율로 표기된 이들 프로브의 정제는 무료 NBD 불소포아 오염 없이 이 프로토콜에서 중요한 단계이다. 또한 검사 중인 LTP가 제대로 접혀 집계되지 않았는지 확인해야 합니다. 추출 분석에서 테스트된 LTP의 양은 이 LTP가 이러한 지질을 효율적으로 추출하는지 여부를 적절하게 측정하기 위해 접근 가능한 ...

다른 막 사이 및 진핵 세포의 막 내지질의 정확한 분포1,2는 심오한 생물학적 연루가 있습니다. LtP함수가 세포 생물학3,4,5,6에서중요한 문제이며 시험관 내 접근 방식은 이 문제점7,8,9,10,11을해결하는 데 큰 가치가 있다. 여기서, 체외,형광계 전략은 여러 ORP/Osh 단백질이 PS/PI(4)P 교환을세포막(12)과 형성하여 새로운 종류의 LtP를 구성하는 데 중요한 역할을 하고 있다. ER과 PM 사이의 그라데이션을 따라 분포되며, 여기서각각17,18,19의글리세로포스지질의 5-7%와 최대 30%를 나타낸다. 더욱이, PS는 본질적으로 PM의 세포소 전단지에 집중된다. 이 빌드업 및 PM에서 PS의 고르지 않은 파티션은 셀룰러 신호공정(19)에매우 중요합니다. PS 분자의 음전하로 인해 PM의 세포소 전단지는 다른 세포기관1, 2,19,20의세포소 잎보다 훨씬 더 음이온적이다. 이를 통해 정전기력을 통해 채용할 수 있습니다. myristoylated alanine-rich C-kinase 기판 (MARCKS)21,육종 (Src)22,커스틴 쥐 육종 바이러스 종양 유전자 (K-Ras)23,및 Ras 관련 C3 보툴리눔 독소 기판 1 (Rac1) 기판 기판 1 (Rac1) 기판 과 같은 신호 단백질의 산산과 산의 잔디를 긍정적으로 함유하고 있습니다.
PS는 또한 C2도메인(25)을 통해 고정관시 선택적 방식으로 종래의 단백질 키나제 C에 의해 인식된다. 그러나 PS는 ER26에서합성되어 해당 역할을 하기 전에 PM으로 내보내야 한다는 것을 나타냅니다. 효모, Osh6p 및 Osh7p 전송 PS가 ER에서 PM27로전송되는 것을 발견할 때까지19이 어떻게 달성되었는지는 알려지지 않았습니다. 이 LtP는 그의 창립 멤버가 OSBP이고 단백질을 포함하는 진핵생물에 있는 진화적으로 보존된 가족에 속합니다 (인간에 있는 ORP, 효모에 있는 Osh 단백질) 지질 분자를 호스트하는 주머니와 OSBP 관련 도메인 (ORD)를 통합합니다. Osh6p 및 Osh7p는 구조적인 특징이 PS를 특별히 결합하고 멤브레인 간에 전송하도록 조정된 ORD로만 구성됩니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 단백질이 ER에서 PM으로 PS를 방향으로 옮기는 방법은 불분명했습니다. Osh6p 및 Osh7p는 PI(4)P를 대체 지질 리간드12로트랩할 수 있다. 효모에서 PI(4)P는 골기내의 포스파디딜리노시톨(PI)과 PM에서 PI 4키나아제, 픽1p 및 Stt4p에 의해 각각 합성된다. 대조적으로, ER 멤브레인에는 PI(4)P가 없으며, 이 지질은 Sac1p 인스파타제에 의해 PI로 가수분해되기 때문이다. 따라서 ER/골기 및 ER/PM 인터페이스모두에 PI(4)P 그라데이션이 존재합니다. Osh6p 및 Osh7p 는 이 두 멤브레인(12) 사이에 존재하는 PI(4)P 그라데이션을 사용하여 PS/PI(4)P 교환 주기를 통해 ER에서 PM으로 PS를 전송한다.
한 주기 내에서, Osh6p는 ER로부터 PS를 추출하고, PM에서 PI(4)P에 대한 PS를 교환하고 PI(4)P를 ER로 다시 전송하여 다른 PS 분자를 추출한다. Osh6p/Osh7p는 Ist2p28과상호작용하며, ER 멤브레인과 PM을 서로 가깝게 연결하고 가져와서29,30,31에서ER-PM 접촉 부위를 생성한다. 또한, Osh6p의 부정적 하전 멤브레인과의 결합은 단백질이 정전기 특징을 수정하는 변형 변화로 인해 지질 리간드 중 하나를 추출하는 즉시 약해진다32. 이를 통해 Osh6p는 멤브레인 거주 시간을 단축하여 지질 전달 활동의 효율성을 유지합니다. Ist2p에 바인딩과 결합, 이 메커니즘은 빠르고 정확하게 ER / PM 인터페이스에서 지질 교환을 실행하는 Osh6p / 7p를 할 수 있습니다. 인간 세포에서, ORP5 및 ORP8 단백질은 뚜렷한 메커니즘을 통해 ER-PM 접촉 부위에서 PS/PI(4)P 교환을 실행한다33. 그들은 Osh6p와 유사한 중앙 ORD를 가지고 있지만, 직접 C 단자 막 세그먼트(33)를 통해 ER에 고정되고 PI (4)P및 PI (4,5)P233,34,35를인식하는 N 단말 플레크스트린 homology (PH) 도메인을 통해 PM에 도킹된다. ORP5/8은 PS를 전송하기 위해 PI(4)P를 사용하며, ORP5/8은 PM PI(4,5)P2 레벨을 추가로 조절하고 신호 경로를 조절하는 것으로 나타났다. 차례로, PI (4)P및 PI (4,5)P2 수준의 감소는 이러한 단백질이 PIP 의존적 방식으로 PM과 연관됨에 따라 ORP5 / ORP8 활성을 낮춥니다. 렌츠-마예스키 증후군으로 이어지는 비정상적으로 높은 PS 합성은 ORP5/836을통해 PI(4)P 수준에 영향을 미칩니다. 두 단백질의 활성이 막히면 PS가 PM에서 덜 풍부해져서단백질(37)의온코겐성 능력을 저하시한다.
반대로, ORP5 과발현은 암세포 침입 및 전이성과정(38)을촉진하는 것으로 보인다. 따라서, ORP5/8 활성에 대한 변경은 지질 항상성의 변화를 통해 세포 행동을 심각하게 수정할 수 있다. 또한, ORP5 및 ORP8은 ER-미토콘드리아 접촉 부위를 점유하고 PS39를공급함으로써 일부 미토콘드리아 기능을 보존한다. 또한, ORP5는 ER-지질 물방울 접촉 부위에 국한하여 PS/PI(4)P 교환40을통해 지질 방울에 PS를 전달한다. 본 명세서에 기재된 전략은 (i) 리포솜및 (ii) PS와 PI(4)P로부터 추출을 측정하기 위해 고안되어 Osh6p/Osh7p12,32의 PS/PI(4)P 교환활성을확립및 분석하기 위해 고안되었으며, 다른 그룹에서 ORP5/ORPP및10PS의활성을 분석하기 위해 사용되었다. 41. 각각 PS와 PI(4)P를 검출할 수 있는 형광판 판독기, 표준 L-포맷 분광계 및 2개의 형광 센서인 NBD-C2Lact 및 NBD-PHFAPP의사용을 기반으로 합니다.
NBD-C2Lact는 추정된 PS 결합 부위 근처에서 고유한 용매 노출 시스테인을 포함하도록 재설계된 당단백질, 락타데린의 C2 도메인에 대응한다. 극성 민감성 NBD(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸) 불소호레는 이 잔류물(도1A)12에이와 함께 연결된다. 보다 정확하게 말하자면, 락타데린의 C2 도메인(보스 타우러스, UniProt: Q95114, 잔류물 270-427)은 에셰리히아 대장균의글루타티온 S-transferase(GST)와 융합하여 발현되는 pGEX-4T3 벡터로 복제되었다. 그런 다음 C2Lact 서열은 두 개의 용매 접근 시스테인 잔류물을 대체하기 위해 돌연변이되었다(C270, C427) 알라닌 잔류물을 사용하여 이후에 N,N'-로 표시될 수 있는 퍼티제 PS 결합 부위(H352C 돌연변이) 근처의 부위에 시스테인 잔류물을 도입 디메틸-N-(요오도아세틸)-N'-(7-니트로벤츠-2-옥사-1,3-디아솔-4-yl) 에틸렌 디아민(IANBD) 12. 혈소판에 대한 분열 부위는 C2 도메인의 GST 단백질과 N-종점 사이에 존재한다. 주요 장점은 이 도메인이 다른 알려진 C2 도메인 또는 부속서 A542에반하는 Ca2+독립적인 방식으로 PS를 선택적으로 인식한다는 것입니다. NBD-PHFAPP는 인간 4-인산염 어댑터 단백질 1(FAPP1)의 PH 도메인으로부터 유래되었으며, 이는 PI(4)P 결합부위(도 1A)43근처의 NBD 그룹으로 표지될 수 있는 단일 용매 노출 시스테인을 포함하도록 재설계되었습니다. 인간 FAPP 단백질의 PH 도메인의 뉴클레오티드 서열(UniProt: Q9HB20, 세그먼트 [1-100])은 GST 태그와 함께 발현되는 pGEX-4T3 벡터로 복제되었다. PHFAPP 서열은단백질(43)의막 결합 인터페이스 내에서 고유한 시스테인 잔류물을 삽입하도록 변형되었다. 더욱이, 프로테아제에 대한 접근성을 보장하기 위해 혈전 분열 부위와 PH 도메인의 N-종자 사이에 9잔류 링커가 도입되었다.
리포솜에서 PS 추출을 측정하려면, NBD-C2Lact는 PS에 대한 친화력으로 인해 미량의 PS를 함유하는 인산염(PC)으로 만든 리포솜과 혼합되어 있으며, 이 구조는 리포솜에 결합하고, NBD 형광은 뇌의 소수성 환경과 접촉함에 따라 극성의 변화를 경험하며, 이는 조류가 증가하고 이는 조류가 증가한다. PS가 LTP의 stoichiometric 양에 의해 거의 완전히 추출되는 경우, 프로브는 리포솜과 연결되지 않으며, NBD 신호는 더낮다(도 1B)32. 신호의 이러한 차이는 LTP(예를들어, Osh6p)가 PS를 추출하는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다. 유사한전략은 이전에 설명된 바와 같이 PI(4)P 추출(도1B)을측정하기 위해 NBD-PHFAPP와 함께사용된다. 두 개의 FRET 기반 아세약은 (i) LA에서 LB 리포솜으로 PS 수송을 측정하도록 설계되었으며, 이는 각각 ER 멤브레인과 PM을 모방하고(ii) PI(4)P를 역방향으로 수송하도록 설계되었습니다. 이러한 소는 PS/PI(4)P 교환을 측정하기 위해 동일한조건(즉, 동일한 완충, 온도 및 지질 농도)에서수행됩니다. PS 수송을 측정하기 위해, NBD-C2Lact는 PC로 구성된 LA 리포솜과 혼합되어 5 mol% PS와 2 mol%의 형광 로다민 라벨인 포스파디들레타놀라민(Rhod-PE)과 LB 리포솜이 5mol% PI(4)P를 통합한 것으로 나타났다.
시간 제로, Rhod-PE와 FRET는 NBD 형광을 담금질. PS가LA에서 LB 리포솜(예를들어, Osh6p주입 시)으로 수송되는 경우,LA에서 LB 리포좀(도1C)으로NBD-C2Lact 분자의 전역으로 인해 빠른 분해가 발생한다. 접근 가능한 PS의 양을 감안할 때, NBD-C2Lact는 실험(12)의과정을 통해 멤브레인 바운드 상태로 본질적으로 남아 있다. 따라서, NBD 신호의 강도는 LA와 LB 리포솜 사이의 NBD-C2Lact의 분포와 직접 상관관계가 있으며 쉽게 정규화되어 얼마나 많은 PS가 전달되는지 결정할 수 있다. 반대 방향으로 PI(4)P의 전송을 측정하기 위해, NBD-PHFAPP는 LA 및 LB 리포솜과 혼합된다; PI(4)P를 포함하는 LB 리포솜에만 결합하지만 Rhod-PE가 아니라는 점을 감안할 때 형광은 높습니다. PI(4)P가 LA 리포솜으로 옮겨지면 이러한 리포솜으로 배회되고, 로드-PE(도1C)를가진 FRET로 인해 신호가 감소한다. 신호는 정규화되어43로전송되는 PI(4)P양을 결정합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;L-cysteine &#8805;97 % (FG)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305-100G</td>
			<td>Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W224681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm-diameter glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265934-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324, UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC800324, UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Gold Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0 Liss&#160; (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C16:0-PI(4)P&#160;&#160;</td>
			<td>Echelon Lipids</td>
			<td>P-4016-3</td>
			<td>Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 &#181;L of MeOH and 250 &#181;L of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C-500mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Disruptor</td>
			<td>Constant Dynamics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (CHCl3) RPE-ISO</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>438601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized (Milli-Q) water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide (DMF), anhydrous, &#62;99% pure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td>Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.&#160; Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac chromatography columns (1.5 &#215; 12 cm).</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette 2 mm</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td>EP102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator Eppendorf 2510</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Spinning the batcerial lysates</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (10, 25, and 50 &#181;L) for fluorescence experiment</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 &#181;L) to handle lipid stock solutions</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (99% pure)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemolysis tubes with a cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES , &#62;99 % pure</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra NAP 10 desalting column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>GE17-0854-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td>Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Acetate</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>26664.293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth medium without glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared with milli-Q water and autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH) &#8805;99.8%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20847.24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator-based fluorescence plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>M1000 Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N&#39;-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 &#181;L in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 &#176;C in the dark.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass)</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p5318-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-C2LACT&#160; plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-PHFAPP plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) &#8805;98.5% (GC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626-25g</td>
			<td>Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoramidon</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 &#181;m</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7311550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prefilters (10 mm in diameter).</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>http://pymol.org/</td>
			<td></td>
			<td>Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 &#181;L)</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge&#160; Eppendorf 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>B-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic PFTE stirring bar (5 &#215; 2 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO orange</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10602400001</td>
			<td>Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 &#181;L aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, ultra pure</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge L90K</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible absorbance spectrophotometer</td>
			<td>SAFAS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device</td>
			<td>Jasco or Shimadzu</td>
			<td>Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based measurements of phosphatidylserine/phosphatidylinositol 4-phosphate exchange between membranes

진화적으로 보존된 옥시스테롤 결합 단백질(OSBP)-관련 단백질(ORP)/OSBP 동종학(Osh) 패밀리의 몇몇 구성원은 최근 효모 및 인간 세포에서 새로운 지질 전달 단백질(LTP) 그룹을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그들은 내피 성 망상 (ER)에서 PS /phosphatidylinosol 4-인산염 (PI(4)P) 교환 주기를 통해 혈장 막 (PM)으로 인산화 (PS)를 전송합니다. 이 발견은 신호 프로세스에 중요한 PS가 세포 전체에 분포되는 방법과 이 과정과 인포이노시타이드 (PIP) 대사 사이의 링크의 조사를 더 잘 이해할 수 있게 합니다. 새로운 형광 기반 프로토콜의 개발은 분자 수준에서 시험관내의 이 새로운 세포 기계장치의 발견 그리고 특성화에 중요한 역할을 했습니다. 이 논문은 두 개의 형광 표기 지질 센서, NBD-C2Lact 및 NBD-PHFAPP의생산 및 사용을 설명하며, PS 또는 PI(4)P를 추출하는 단백질의 능력을 측정하고 인공 막 사이에 이러한 지질을 전달합니다. 첫째, 프로토콜은 이 두 구문중의 고순도 샘플을 생성, 레이블 및 얻는 방법을 설명합니다. 둘째, 이 논문은 Osh6p를 사례 연구로 사용하여 단백질이 리포솜에서 PS 또는 PI(4)P를 추출할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 형광 마이크로 플레이트 판독기와 이러한 센서를 사용하는 방법을 설명합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 정의된 지질 조성물의 지질성 간의 PS/PI(4)P 교환의 운동학을 정확하게 측정하고 표준 형광계를 사용하여 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 의한 지질 전달 속도를 결정하는 방법을 보여줍니다.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> 그림 1: 형광 지질 센서 및 시험관 내 작용에 대한 설명. (A)소 락타데린의 C2 도메인의 결정 구조를 기반으로 NBD-C2Lact 및 NBD-PHFAPP의 3차원 모델 (PDB ID: 3BN648)및 인간 FAPP1 단백질(PDB4K4K)의 PH 도메인의 NMR 구조(PDB4K: ID).<sup clas...

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Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

여기서, 우리는 단백질 추출물과 트랜스포파디딜리노시톨 4-인산염이 체외에서인산염을 배출하는지 여부를 결정하기 위해 형광 지질 센서와 리포좀을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

이 방법은 형광을 사용하여 단백질이 합성 막 사이의 생물학적으로 중요한 liqids로 전달되는지 확인하고 따라서 진핵 세포 내부의 이러한 지질 분포에 기여합니다. 이 기술은 단백질에 의한 천연 지질의 추출 및 수송을 가능하게 하며, 쉽게 만들 수 있는 형광 세포와 리포솜이 필요합니다. 이 방법은 장기와 막 사이의 몇 가지 필수 지질의 분포 뒤에 단백질에 의해 세포 생물학에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용하고 수정 할 수 있습니다.시각적 데모는 형광에 의한 지질 전달의 실시간 측정을 수행하는 방법을 설명하는 것이 중요합니다. 그래서 절차를 시연하는 것은 또한 Maud Magdeleine, 내 실험실에 대한 엔지니어가 될 것입니다. 먼저 신선한 여과 및 탈가스 HEPES 칼륨 아세테이트 버퍼를 준비하여 1밀리알라 마그네슘 염화 마그네슘으로 보충하여 HKM 버퍼를 형성합니다.그런 다음 PC로만 만들거나 2개의 어금니 퍼센트 PS 또는 PI(4)P로 도핑된 리포솜을 준비합니다. 이제 플라스크를 회전 증발기위에 놓고 지질을 진공 상태에서 건조시하십시오. 한 가지 잘, 지질 센서, NBD-C2 Lact와 두 어진 퍼센트 PS를 포함하는 리포솜을 혼합, 250 나노 몰러와 100 마이크로 리터의 최종 농도.3개의 마이크로몰라 지질 전달 단백질 또는 LTP와 혼합된 리포솜 및 NBD-C2 수질의 동일한 양으로 두 번째 를 잘 채웁니다. 순수 80 마이크로몰러 PC 리포솜과 순수한 80 마이크로 몰러 PC 리포좀과 네 번째 잘 혼합 250 나노 몰러 NBD-C2 lact와 세 번째 잘 채우기. 이 단계를 반복하여 세 개의 우물 시리즈를 추가로 준비합니다.그런 다음 형광 판독기에 멀티 웰 플레이트를 배치합니다. 각 웰에 대해 25섭씨 490 나노미터에서 5나노미터 대역폭을 가진 505~650나노미터의 NBD 스펙트럼을 기록한다. 각 계열에 대해 다른 스펙트럼에서 리포솜만으로 기록된 스펙트럼을 뺍니다.PI(4)P 추출 분석의 경우 2개의 어금니 퍼센트 인산염으로 도핑된 리포솜을 준비하고 NBD-PH FAPP 프로브로 측정을 수행한다. 제어 실험을 수행하고 추출 비율을 결정합니다. 압출 리포솜을 마친 후 이 압출 된 리포좀으로 튜브를 채웁니다.갓 탈가스 및 여과된 HKM 버퍼를 준비하고 압출 된 리포솜을 실내 온도에서 유지하는 튜브를 유지하십시오. 알루미늄 호일에 인산염으로 표시된 로다민이 함유된 리포솜을 감싸고 불투명한 상자에 보관하여 사진 표백을 방지합니다. 섭씨 25~37도 사이의 온도를 설정하고 1~3나노미터의 짧은 대역폭으로 460나노미터로 발산 단색계를 조정하고, 10나노미터 이상의 큰 대역폭으로 530나노미터로 방출한다.최대 1초의 시간 해결을 통해 획득 시간을 25분으로 설정합니다. 석영 쿠벳에서 LA 리포솜 서스펜션 및 NBD-C2 lact 스톡 솔루션 및 프리웜 HKM 버퍼의 30 마이크로리터를 희석하여 200 마이크로몰라 총 지질 및 250 나노 몰라 또는 NBD-C2 lact를 포함하는 570 마이크로리터 샘플을 준비합니다. 작은 자기 교반 바를 추가하고 플루오로미터 홀더에 큐벳을 배치합니다.시료가 열적으로 평형화되면 측정을 트리거합니다. 1분 후, 샘플에 LB 리포솜 현탁액 30마이크로리터를 추가합니다. 3분 후 LTP의 최종 농도가 200 나노몰러되도록 샘플에 LTP를 주입한 다음 나머지 21분 동안 신호를 획득한다.NBD 신호를 정규화하기 위해 병렬 실험을 수행합니다. LA 평형 리포솜 서스펜션 30마이크로리터를 HKM 버퍼에 250 나노몰러 NBD-C2 lact와 혼합하여 570마이크로리터의 최종 부피로 혼합합니다. 1 분 후, LB 평형 리포솜 현탁액30 마이크로 리터를 주입하십시오.관심 있는 LTP로 측정된 운동 곡선을 변환하여 시간이 지남에 따라 LA에서 LB 리포솜으로 전송되는 PS의 양을 결정합니다. 그런 다음 곡선의 각 데이터 점을 정규화합니다. PS 전송 분석과 동일한 바닥 방출기 설정 및 조건을 사용하여 PI(4)P 실험을 수행합니다.큐벳에서는 30마이크로리터의 lb 리포솜 서스펜션과 NBD-PH FAPP 프로브를 사전 따뜻하게 한 HKM 버퍼와 혼합하여 570 마이크로리터의 최종 부피를 얻습니다. 시료의 열 평형에 도달하면 측정을 시작합니다. 1 분 후 LA 리포솜 서스펜션 30 마이크로 리터를 주입하십시오.3분 후, 관심 있는 LTP를 주입하고 신호를 기록합니다. NBD 신호를 정규화하기 위해 두 번째 실험을 수행합니다. 250 나노 몰라 NBD-PH FAPP와 570 HKM 버퍼의 570 마이크로 리터와 lb 평형 리포솜 현탁액의 30 마이크로 리터를 혼합합니다.1 분 후, LA 평형 리포솜 서스펜션의 30 마이크로 리터를 주입. 운동 곡선을 변환하여 시간이 지남에 따라 LB에서 LA 리포솜으로 전송되는 PI(4)P의 양을 결정한 다음 각 데이터 점을 정규화합니다. LTP가 효율적인 정도를 정량화합니다.경적을 얻기 위해 전송 역학의 첫 번째 데이터 포인트의 선형 회귀를 수행합니다. 반응 혼합물의 LTP 농도로 경사 값을 나누어 시간 단위당 단백질당 전달되는 지질 분자의 수를 결정한다. SDS 페이지 분석을 통해 구슬에서 C2 수유의 효율적인 복구가 확인되었습니다.NBD로 표지된 C2 수유의 자외선 가시 흡수 스펙트럼은 모든 C2 lact 분자가 NBD 그룹으로 표지되었다는 것을 확인했습니다. NBD-C2 수질과 그 형광의 순도는 SDS 페이지 분석에 의해 결정되었다. NBD-C2 lact 또는 NBD-PH FAPP의 형광은 PS 또는 PI(4)P를 함유한 리포솜만이 인큐베이션에 사용되었을 때 최대화되어 센서가 멤브레인바운드임을 나타냅니다.Osh6p가 또한 이 단백질이 리포솜에서 PS 또는 PI(4)P를 효율적으로 추출했다는 것을 나타내는 낮은 형광이 존재했을 때 보였습니다. Osh6p를 LTP로 사용한 PS 전송 분석의 결과가 표시됩니다. LA 리포솜에서 LB 리포솜으로 PS 이송의 평균 운동 곡선을 계산하거나, 인산염-4-인산염으로 도핑하거나 도핑하지 않은 것으로 계산되었다.평균 초기 PS 전송 속도는 세 가지 뚜렷한 실험에서 결정되었다. 마찬가지로, Osh6p를 LTP로 사용한 PI(4)P 전송 분석의 결과가 여기에 나와 있다. 신호 정규화 후 얻은 평균 운동 곡선과 함께.평균 전송 속도는 도핑또는 PS와 도핑되지 않은 LA 리포솜으로 측정되었다. 이 프로토콜을 수행할 때는 신선한 버퍼를 사용하고 같은 날을 준비합니다. 플로르센트 리포솜과 단백질의 가벼운 박람회를 최소화하고, 잘 정제된 NBD 라벨 단백질을 사용하고 얼음 위에 보관하십시오. 유전자 인코딩형 형광지질 센서를 사용하여 원핵세포 내부의 세포기관 간 PS 및 PI(4)P 전달을 측정하여 확인할 수 있다.이 기술은 PS와 PI(4)가 세포 내에 분포되어 있으며, 이들의 활동은 여러 LTPS의 특이성을 겪는다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

연구

생화학

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

SAXS 빔라인에 온라인 크기 배제 및 이온 교환 크로마토 그래피

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

나노-추적 분석 인 혈에 있는 단일 Extracellular Vesicles의 빠른 형광 기반 특성

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

중재 Rad51 DNA 물가 교환 반응의 실시간 관찰

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

단백질 분리 및 특성에 대 한 다 각 산란 (MALS)를 결합 하는 이온 교환 크로마토그래피 (전류 구동)

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

아실-PEGyl 교환 젤 시프트 분석은 뇌막 단백질의 팔미토일화의 정량적 측정을 위한 것입니다.

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...